一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，該方法先在T形組織培養(yǎng)瓶中對(duì)293細(xì)胞種子進(jìn)行傳代擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)移到攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步傳代擴(kuò)增，而后轉(zhuǎn)移到5L容積生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，而后將培養(yǎng)得到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移接種至250L容積生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，過(guò)程中定期補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基用于維持培養(yǎng)環(huán)境適宜細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案填補(bǔ)了293細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)空白，所選培養(yǎng)條件適于293細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)密度的最大化，減少了細(xì)胞培養(yǎng)的體積，減少了后續(xù)的勞動(dòng)強(qiáng)度，質(zhì)量均一穩(wěn)定，生產(chǎn)過(guò)程銜接緊密，易操控。本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)液，保證了細(xì)胞增殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又提高了營(yíng)養(yǎng)液的利用率，節(jié)約成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]293細(xì)胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5El區(qū)的人胚腎亞三倍體細(xì)胞系，是一種El區(qū)缺陷互補(bǔ)細(xì)胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。293細(xì)胞是貼壁依賴(lài)型呈上皮樣細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型，細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293細(xì)胞屬于貼壁細(xì)胞系，在無(wú)Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長(zhǎng)，也可生長(zhǎng)在血清濃度降低的培養(yǎng)基中，
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多對(duì)293細(xì)胞單層培養(yǎng)方式下細(xì)胞的生長(zhǎng)以及腺病毒載體的表達(dá)量產(chǎn)生了明顯的影響，但是對(duì)于懸浮培養(yǎng)方式下293細(xì)胞的生長(zhǎng)以及腺病毒載體的表達(dá)量確沒(méi)有影響，但是現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)293細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種利用生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)293細(xì)胞的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟:
[0007]I)取出293細(xì)胞，先在T形組織培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)移到攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步傳代擴(kuò)增，而后轉(zhuǎn)移到小規(guī)模反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，而后將培養(yǎng)得到的細(xì)胞用于下級(jí)培養(yǎng)的種子細(xì)胞；
[0008]2)將步驟I)得到的用于下級(jí)培養(yǎng)的種子細(xì)胞的用胰蛋白酶消化液消化，用無(wú)血清293SFM II培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液，按一定的細(xì)胞密度接種到生物反應(yīng)器調(diào)整培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度在36-38°C ；pH維持在7.0-7.4之間；溶氧濃度在40%_50%之間；攪拌速度在100-135rpm之間，在培養(yǎng)的第1_3天攪拌速度設(shè)置為100_120rpm，自培養(yǎng)第4天開(kāi)始在110-135rpm的范圍內(nèi)逐步提高攪拌速度持續(xù)培養(yǎng)；
[0009]3)培養(yǎng)過(guò)程中每24小時(shí)補(bǔ)充步驟2)中無(wú)血清293SFM II培養(yǎng)基總量20% (v/v)的新鮮無(wú)血清293SFM II培養(yǎng)基。
[0010]上述技術(shù)方案中，步驟I)所述293細(xì)胞種子在接種到T形組織培養(yǎng)瓶中之前先進(jìn)行馴化培養(yǎng)；所述生物反應(yīng)器為自動(dòng)控溫?cái)嚢韫奘椒磻?yīng)器；步驟2)所述的細(xì)胞接種密度分別優(yōu)選為0.5X IO6-L 5X IO6個(gè)/ml和0.6X IO6個(gè)/ml ;步驟2)所述的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為370C ;步驟2)所述的pH值優(yōu)選為7.2 ;步驟2)所述的溶氧濃度優(yōu)選為45% ;步驟2)所述的第1-3天攪拌速度設(shè)置為llOrpm。
[0011]本發(fā)明提供的技術(shù)方案填補(bǔ)了 293細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)空白，所選培養(yǎng)條件適于293細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)密度的最大化，減少了細(xì)胞培養(yǎng)的體積，減少了后續(xù)的勞動(dòng)強(qiáng)度，質(zhì)量均一穩(wěn)定，生產(chǎn)過(guò)程銜接緊密，易操控。本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)液，保證了細(xì)胞增殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又提高了營(yíng)養(yǎng)液的利用率，節(jié)約成本。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
[0013]5L生物反應(yīng)器:Biostat公司生產(chǎn),低剪切槳式攪拌器,旋轉(zhuǎn)濾器(Spinfilter)和無(wú)氣泡通氣系統(tǒng)，以及中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)(強(qiáng)化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動(dòng)控制，四氣混合控制供氣系統(tǒng)，融氧雙參數(shù)關(guān)聯(lián)、回收液流速。
[0014]250L生物反應(yīng)器:Biostat公司生產(chǎn)，低剪切槳式攪拌器，旋轉(zhuǎn)濾器(Spinfilter)和無(wú)氣泡通氣系統(tǒng)，以及中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)(強(qiáng)化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動(dòng)控制，四氣混合控制供氣系統(tǒng)，融氧雙參數(shù)關(guān)聯(lián)、回收液流速。
[0015]細(xì)胞系:HEK-293sus細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；293SFM II培養(yǎng)基自市面購(gòu)得。
[0016]1.1 HEK-293細(xì)胞的馴化培養(yǎng)
[0017]1.1.1 HEK-293細(xì)胞的全懸浮馴化培養(yǎng)
[0018]I)接種HEK-293細(xì)胞于含IOml DMEM完全培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天達(dá)到100%匯合狀態(tài)；
[0019]2)棄除培養(yǎng)基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293細(xì)胞消化脫離培養(yǎng)皿表面，然后加入3ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；
[0020]3)將上述消化后的 細(xì)胞用移液管吸取，并轉(zhuǎn)移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心lmin，沉降收集HEK-293細(xì)胞，并用IOml DMEM完全培養(yǎng)基重懸收集的細(xì)胞，再將全部細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中；
[0021]4)步驟3)中放入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞每培養(yǎng)2天重復(fù)步驟2)和3)，重復(fù)7_11次，直至培養(yǎng)皿中同時(shí)出現(xiàn)貼壁細(xì)胞和懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)；吸取及轉(zhuǎn)移過(guò)程中注意勿打散細(xì)胞團(tuán)；
[0022]5)將最后一次培養(yǎng)的全部細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至搖瓶中培養(yǎng)，每?jī)商彀凑?.5X IO6/ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細(xì)胞團(tuán)至分散狀態(tài)，直至培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2X 107ml細(xì)胞，活力95%以上，即得可連續(xù)傳代95-105代，并可達(dá)到最高密度
1.3 X 107/ml的，適應(yīng)10%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293細(xì)胞，命名該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為HEK-293sus細(xì)胞，以4X 106/ml密度凍存即可。
[0023]1.1.2對(duì)上述馴化后的HEK-293sus懸浮細(xì)胞的無(wú)血清馴化
[0024]I)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至密度為L(zhǎng) 2X106/ml，活力95%以上，收集細(xì)胞于離心管中，于IOOOrpm離心2min沉降，留沉淀；
[0025]2)用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的細(xì)胞團(tuán)，并在此過(guò)程中震蕩離心管，使細(xì)胞均勻分布；
[0026]3)加入5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化作用，并重懸步驟2)得到的HEK-293s 細(xì)胞，按照 0.5 XlOVml 傳代；
[0027]4)每?jī)商熘貜?fù)步驟I)至步驟3)—次，直至培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；
[0028]5)分步將DMEM培養(yǎng)基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%、1%，重復(fù)步驟I)至步驟3)，每?jī)商靷鞔淮?，直至培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上，即得適應(yīng)1%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293細(xì)胞；
[0029]6)將適應(yīng)1%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293S細(xì)胞每?jī)商彀凑?.5X 106/ml傳代一次，擴(kuò)大培養(yǎng)到50ml培養(yǎng)體積，至兩天后能達(dá)到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；[0030]7)對(duì)適應(yīng)1%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293s細(xì)胞進(jìn)行70 μ m細(xì)胞篩過(guò)濾處理，觀察并記錄過(guò)濾后的HEK-293S細(xì)胞團(tuán)數(shù)量及大小；
[0031]8)傳代步驟7)中過(guò)濾后的HEK-293S細(xì)胞于含25%293SFM II及75%DMEM的混合培養(yǎng)基中，該DMEM中含1.0%FBS,每?jī)商靷鞔淮危敝僚囵B(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2X 106/ml細(xì)胞，活力90%以上；
[0032]9)按照50%、75%和100%的比例增加混合培養(yǎng)基中293SFM II的比率，增加293SFMII比率的同時(shí)按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養(yǎng)基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養(yǎng)基依次傳代培養(yǎng)步驟8)所得的HEK-293sus細(xì)胞，直至所述的HEK_293sus細(xì)胞于含100%293SFM II且無(wú)FBS存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2X106/ml細(xì)胞密度，活力90%以上，且細(xì)胞無(wú)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象；
[0033]10)以4X 107ml密度凍存步驟9)得到的適應(yīng)100%293SFM II懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)條件的HEK-293SUS于_80°C醫(yī)用低溫冰箱中，次日轉(zhuǎn)移凍存管至液氮罐中保存。
[0034]1.2 HEK-293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)
[0035]I)取以上步驟得到的處于凍存狀態(tài)的HEK-293SUS細(xì)胞作為293細(xì)胞種子，將冷凍管直接投入37°C溫水，不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化，解凍I分鐘；取出冷凍管，用酒精消毒后打開(kāi)管蓋，吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，再用培養(yǎng)液重復(fù)洗一次；用培養(yǎng)液10倍稀釋后，接種T形組織培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為
0.2X106cells/ml。置于37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0036]24h后按照1:2的比例轉(zhuǎn)移至攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，每個(gè)方瓶培養(yǎng)體積為15ml ;待組織培養(yǎng)瓶培養(yǎng)體積達(dá)到200ml時(shí)，接種至IL搖瓶中；將200ml方瓶培養(yǎng)中的HEK-293S細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用293F Freestyle SFM培養(yǎng)基分散并調(diào)整細(xì)胞密度為
0.6X 106cells/ml,第I~2天攪拌速度40r/min,自培養(yǎng)第3天起攪拌速度為60r/min,置于37°C、5%C02條件下擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0037]按照規(guī)程完成生物反應(yīng)器的安裝、校準(zhǔn)和滅菌消毒，連接攪拌電極、pH電極導(dǎo)線(xiàn)、融氧電極導(dǎo)線(xiàn)、溫度探頭、收液瓶、取樣管等，檢查無(wú)誤后，開(kāi)機(jī)；
[0038]按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程補(bǔ)充灌流培養(yǎng)基約2L進(jìn)入5L生物反應(yīng)器內(nèi)，開(kāi)機(jī)運(yùn)行48小時(shí)，觀察溫度、攪拌速度、pH、融氧等各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定狀況；
[0039]接種細(xì)胞，待細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶體積至800ml，細(xì)胞密度達(dá)到0.6X 106Cells/ml時(shí)，接種到5L生物反應(yīng)器中，起始培養(yǎng)體積約3.5L。
[0040]設(shè)置起始培養(yǎng)條件:溫度37°C ；pH7.2 ;融氧控制40% ;攪拌速度lOOrpm。培養(yǎng)72小時(shí)，至細(xì)胞密度達(dá)到1.2X106cells/ml。
[0041]2)用0.25%胰酶消化罐內(nèi)細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液，接種至250L生物反應(yīng)器，起始培養(yǎng)體積75L。
[0042]設(shè)置起始培養(yǎng)條件:溫度37°C ；pH7.2 ;融氧控制40% ;攪拌速度llOrpm，培養(yǎng)72小時(shí)，至細(xì)胞密度達(dá)到2.lX106cells/ml。[0043]3)自培養(yǎng)第4天起灌流培養(yǎng)補(bǔ)液加入24L的無(wú)血清培養(yǎng)基，提高攪拌速度至115rpm,培養(yǎng)24小時(shí)，再此補(bǔ)充培養(yǎng)基19.5L，提高攪拌速度至120rpm，培養(yǎng)48小時(shí)至細(xì)胞密度達(dá)到3.3X106cells/ml，收獲細(xì)胞懸液。
[0044]實(shí)施例2
[0045]5L生物反應(yīng)器:Biostat公司生產(chǎn),低剪切槳式攪拌器,旋轉(zhuǎn)濾器(Spinfilter)和無(wú)氣泡通氣系統(tǒng)，以及中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)(強(qiáng)化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動(dòng)控制，四氣混合控制供氣系統(tǒng)，融氧雙參數(shù)關(guān)聯(lián)、回收液流速。
[0046]250L生物反應(yīng)器:Biostat公司生產(chǎn)，低剪切槳式攪拌器，旋轉(zhuǎn)濾器(Spinfilter)和無(wú)氣泡通氣系統(tǒng)，以及中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)(強(qiáng)化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動(dòng)控制，四氣混合控制供氣系統(tǒng)，融氧雙參數(shù)關(guān)聯(lián)、回收液流速。
[0047]細(xì)胞系:HEK-293sus細(xì)胞，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；293SFM II培養(yǎng)基自市面購(gòu)得。
[0048]2.1 HEK-293細(xì)胞的馴化培養(yǎng)
[0049]2.1.1 HEK-293細(xì)胞的全懸浮馴化培養(yǎng)
[0050]I)接種HEK-293細(xì)胞于含IOml DMEM完全培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天達(dá)到100%匯合狀態(tài)；
[0051]2)棄除培養(yǎng)基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293細(xì)胞消化脫離培養(yǎng)皿表面，然后加入3ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；
[0052]3)將上述消化后的細(xì)胞用移液管吸取，并轉(zhuǎn)移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心lmin，沉降收集HEK-293細(xì)胞，并用IOml DMEM完全培養(yǎng)基重懸收集的細(xì)胞，再將全部細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，放于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中；
[0053]4)步驟3)中放入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞每培養(yǎng)2天重復(fù)步驟2)和3)，重復(fù)7_11次，直至培養(yǎng)皿中同時(shí)出現(xiàn)貼壁細(xì)胞和懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)；吸取及轉(zhuǎn)移過(guò)程中注意勿打散細(xì)胞團(tuán)；
[0054]5)將最后一次培養(yǎng)的全部細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至搖瓶中培養(yǎng)，每?jī)商彀凑?.5X IO6/ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細(xì)胞團(tuán)至分散狀態(tài)，直至培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2X 107ml細(xì)胞，活力95%以上，即得可連續(xù)傳代95-105代，并可達(dá)到最高密度
1.3 X 107/ml的，適應(yīng)10%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293細(xì)胞，命名該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為HEK-293sus細(xì)胞，以4X 106/ml密度凍存即可。
[0055] 2.1.2對(duì)上述馴化后的HEK-293sus懸浮細(xì)胞的無(wú)血清馴化
[0056]I)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至密度為L(zhǎng) 2X106/ml，活力95%以上，收集細(xì)胞于離心管中，于IOOOrpm離心2min沉降，留沉淀；
[0057]2)用0.25%胰酶EDTA消化沉淀的細(xì)胞團(tuán)，并在此過(guò)程中震蕩離心管，使細(xì)胞均勻分布；
[0058]3)加入5ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化作用，并重懸步驟2)得到的HEK-293s 細(xì)胞，按照 0.5 XlOVml 傳代；
[0059]4)每?jī)商熘貜?fù)步驟I)至步驟3)—次，直至培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；
[0060]5)分步將DMEM培養(yǎng)基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%、1%，重復(fù)步驟I)至步驟3)，每?jī)商靷鞔淮危敝僚囵B(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2XlOVml細(xì)胞，活力95%以上，即得適應(yīng)1%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293細(xì)胞；
[0061]6)將適應(yīng)1%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK-293S細(xì)胞每?jī)商彀凑?.5X 106/ml傳代一次，擴(kuò)大培養(yǎng)到50ml培養(yǎng)體積，至兩天后能達(dá)到1.2 XlOVml細(xì)胞，活力95%以上；
[0062]7)對(duì)適應(yīng)1%FBS DMEM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的HEK_293s細(xì)胞進(jìn)行70 μ m細(xì)胞篩過(guò)濾處理，觀察并記錄過(guò)濾后的HEK-293S細(xì)胞團(tuán)數(shù)量及大??；
[0063]8)傳代步驟7)中過(guò)濾后的HEK-293S細(xì)胞于含25%293SFM II及75%DMEM的混合培養(yǎng)基中，該DMEM中含1.0%FBS,每?jī)商靷鞔淮?，直至培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2X 106/ml細(xì)胞，活力90%以上；
[0064]9)按照50%、75%和100%的比例增加混合培養(yǎng)基中293SFM II的比率，增加293SFM
II比率的同時(shí)按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養(yǎng)基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養(yǎng)基依次傳代培養(yǎng)步驟8)所得的HEK-293sus細(xì)胞，直至所述的HEK_293sus細(xì)胞于含100%293SFM II且無(wú)FBS存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后能達(dá)到1.2X106/ml細(xì)胞密度，活力90%以上，且細(xì)胞無(wú)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象；
[0065]10)以4X 107ml密度凍存步驟9)得到的適應(yīng)100%293SFM II懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)條件的HEK-293SUS于_80°C醫(yī)用低溫冰箱中，次日轉(zhuǎn)移凍存管至液氮罐中保存。
[0066]2.2 HEK-293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)
[0067]I)取以上步驟得到的處于凍存狀態(tài)的HEK-293SUS細(xì)胞作為293細(xì)胞種子，先在T形組織培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)移到攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步傳代擴(kuò)增，而后轉(zhuǎn)移到5L容積生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，而后挑選 形態(tài)健康、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于下級(jí)培養(yǎng)的種子細(xì)胞；
[0068]2)用0.25%胰酶消化上述下級(jí)培養(yǎng)的種子細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液，接種至250L生物反應(yīng)器，起始培養(yǎng)體積75L ；
[0069]設(shè)置起始培養(yǎng)條件:溫度36°C ；pH7.1 ;溶氧控制45% ;攪拌速度115rpm，培養(yǎng)72小時(shí)，至細(xì)胞密度達(dá)到2.lX106cells/ml。
[0070]3)自培養(yǎng)第4天起灌流培養(yǎng)補(bǔ)液加入24L的無(wú)血清培養(yǎng)基，提高攪拌速度至115rpm,培養(yǎng)24小時(shí)，再此補(bǔ)充培養(yǎng)基19.5L，提高攪拌速度至120rpm，培養(yǎng)48小時(shí)至細(xì)胞密度達(dá)到3.3X106cells/ml，收獲細(xì)胞懸液。
[0071]以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取293細(xì)胞種子，先在T形組織培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)移到攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步傳代擴(kuò)增，而后轉(zhuǎn)移到5L容積生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，而后將培養(yǎng)得到的細(xì)胞用于下級(jí)培養(yǎng)的種子細(xì)胞； 2)將步驟I)得到的用于下級(jí)培養(yǎng)的種子細(xì)胞的用胰蛋白酶消化液消化，用無(wú)血清293SFM II培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)制成細(xì)胞懸液，按一定的細(xì)胞密度接種到生物反應(yīng)器調(diào)整培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度在36-38°C ；pH維持在7.0-7.4之間；溶氧濃度在40%_50%之間；攪拌速度在100-135rpm之間，在培養(yǎng)的第1_3天攪拌速度設(shè)置為100_120rpm，自培養(yǎng)第4天開(kāi)始在110-135rpm的范圍內(nèi)逐步提高攪拌速度持續(xù)培養(yǎng)； 3)培養(yǎng)過(guò)程中每24小時(shí)補(bǔ)充步驟2)中無(wú)血清293SFMII培養(yǎng)基總量20% (v/v)的新鮮無(wú)血清293SFM II培養(yǎng)基，直至培養(yǎng)結(jié)束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟I)所述293細(xì)胞種子在接種到T形組織培養(yǎng)瓶中之前先進(jìn)行馴化培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于所述生物反應(yīng)器為自動(dòng)控溫?cái)嚢韫奘椒磻?yīng)器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述的細(xì)胞接種密度為0.5X IO6-L 5X IO6個(gè)/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述的培養(yǎng)溫度為37°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述的pH值為7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述的溶氧濃度為45%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述的第1-3天攪拌速度設(shè)置為llOrpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種293細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述的細(xì)胞接種密度為0.6 X IO6個(gè)/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103468638SQ201310439028
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】夏廣欣, 呂茂杰, 何召慶, 王壽山, 吳全忠, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司