一株適應全懸浮培養(yǎng)的st細胞及其應用和培養(yǎng)疫苗病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞及其在培養(yǎng)疫苗病毒中的應用和培養(yǎng) 疫苗病毒的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬睪丸（swinetestis,簡稱ST)細胞，是由豬睪丸原代細胞通過傳代克隆篩選轉(zhuǎn) 化而來的工程細胞系，體外培養(yǎng)呈貼壁生長，可進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，ST細胞對多種豬病病 毒比較敏感，如豬瘟病毒（CSFV)、豬細小病毒（PPV)、偽狂犬病毒（PRV)、豬傳染性胃腸炎病 毒（TGEV)等，目前廣泛應用于這幾種豬病疫苗病毒的制備。
[0003] 從1962年，Capstick等對BHK21細胞馴化實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)并應用于疫苗生產(chǎn)，經(jīng)過 半個世紀的發(fā)展，細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥行業(yè)的應用已經(jīng)掀開工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的 浪潮。
[0004]細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)以其自動化、規(guī)?；⒓毎囵B(yǎng)簡易化、操作安全化、批間均一 化等優(yōu)勢彌補了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)的眾多不足，解決實際生產(chǎn)過程中的人工、成本、場地、 生產(chǎn)周期、原材料控制、質(zhì)量不穩(wěn)定等諸多問題。
[0005]因為大多數(shù)疫苗病毒生產(chǎn)用細胞呈嚴格貼壁依賴性生長，所以制約細胞懸浮培養(yǎng) 技術(shù)發(fā)展以及應用的關(guān)鍵是適應全懸浮培養(yǎng)的細胞株。常規(guī)ST細胞同樣呈嚴格貼壁依賴 性生長，所以CSFV、PPV、PRV、TGEV這幾種病毒培養(yǎng)大多數(shù)采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，僅少數(shù)采用 載體懸浮培養(yǎng)方式，還未能實現(xiàn)細胞全懸浮培養(yǎng)，細胞載體懸浮培養(yǎng)本質(zhì)上還是貼壁依賴 性培養(yǎng)，需要轉(zhuǎn)瓶提供種子細胞，需要昂貴的微載體，需要增加微載體培養(yǎng)消化等步驟，細 胞生長仍需要高血清含量的培養(yǎng)基，其中最重要的是細胞載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)不能像全懸浮 培養(yǎng)一樣線性化放大，無法工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，這就制約了此項技術(shù)的工業(yè)化應用，這也是 雖然有很多載體懸浮培養(yǎng)方面的研究或?qū)＠?，但鮮有產(chǎn)品問市的原因所在。細胞全懸浮培 養(yǎng)技術(shù)不但有線性化放大的優(yōu)勢，而且細胞可以用無血清或低血清培養(yǎng)，在降低疫苗成本， 簡化下游純化工藝以及終產(chǎn)品安全性方面也獨具優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種生產(chǎn)成本低、可以規(guī)?；糯笈囵B(yǎng)的適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞及其在生產(chǎn)疫苗病毒中的應用和培養(yǎng)疫苗病毒的方法。
[0007]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：一株適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞，分類命 名為豬睪丸細胞懸浮適應株ST-2014S，已于2015年5月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏編號為CCTCCC201567。
[0008]ST細胞株在培養(yǎng)疫苗病毒中的應用。
[0009]ST細胞株在培養(yǎng)疫苗病毒中的應用，所述病毒為豬痕病毒、豬偽狂犬病毒，豬細小 病毒、豬傳染性胃腸炎病毒。
[0010] -種ST細胞株培養(yǎng)疫苗病毒的方法，包括如下步驟： (1) 將液氮凍存的如權(quán)利要求1所述ST細胞株復蘇，用搖瓶懸浮培養(yǎng)擴增，以細胞濃度 5-10X105個/ml接種至生物反應器中懸浮培養(yǎng)，得到ST細胞懸浮培養(yǎng)液； (2) 當ST細胞懸浮培養(yǎng)液中細胞密度達到2-4X106個/ml時，用病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)基 替換細胞生長培養(yǎng)基，并按照病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)基終體積的3. 0-8. 0%接種病毒； (3) 在生物反應器中繼續(xù)培養(yǎng)懸浮細胞24-96h，收獲病毒液。
[0011] 所述的生物反應器為工業(yè)化攪拌式生物反應器。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開的一種適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞培養(yǎng)疫苗病毒自 動化程度高，不需要載體介入，可以在無血清或低血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，解決病毒培養(yǎng)大 規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的要求，開發(fā)能滿足GMP生產(chǎn)技術(shù)要求的大規(guī)?；a(chǎn)方法，擁有很好的工業(yè) 化應用前景。
【附圖說明】
[0013] 適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞，分類命名為豬睪丸細胞懸浮適應株ST-2014S，已于 2015年5月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCC201567。
[0014] 圖1為ST-2014S細胞懸浮生長曲線圖。
[0015] 圖2為ST-2014S細胞顯微圖（100倍放大)。
【具體實施方式】
[0016] 以下是本發(fā)明具體的實施方案，以進一步闡述本發(fā)明，但不能解釋為限制本發(fā)明 的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù) 方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0017] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018] 實驗涉及的主要生物材料和設備 適應全懸浮培養(yǎng)ST細胞株，分類命名為豬睪丸細胞懸浮適應株ST-2014S，保藏在中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCC201567,保藏日期為2015年5月13日。
[0019] 細胞生長培養(yǎng)基：GRH公司M3專用培養(yǎng)基，添加3%新生牛血清，細胞生長培養(yǎng)基 即是ST細胞懸浮株搖瓶培養(yǎng)與生物反應器全懸浮培養(yǎng)所用的營養(yǎng)液； 病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)基：GRH公司M3專用培養(yǎng)基，添加0. 5-1. 5%新生牛血清，病毒培養(yǎng) 維持培養(yǎng)基即是全懸浮培養(yǎng)的ST細胞培養(yǎng)病毒所用的營養(yǎng)液； 疫苗病毒：豬瘟病毒（CSFV)C株，為廣東永順生物制藥有限公司生產(chǎn)的ST?豬瘟活疫 苗(傳代細胞源）株分離得到； 偽狂犬病毒（PRV)Bartha-k61株，為梅里亞公司生產(chǎn)的偽狂犬病活疫苗株分離得到； 豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)華毒株，為哈獸研維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的豬傳染性 胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒（G型）三聯(lián)活疫苗株分離得到； 豬細小病毒PPV-HN14株為本公司研發(fā)中心自行分離保存，已于2015年7月8日保藏 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCV201525 ; 豬細小病毒PPV-HN14株，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：湖北省 武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學校內(nèi)；保藏日期：2015年7月8日；保藏編號：CCTCC V201525 ;分類命名：豬細小病毒PPV-HN14株。 生物反應器：美國NBS14升攪拌式生物反應器。
[0020] 實施例1適應全懸浮培養(yǎng)ST細胞株的擴增培養(yǎng) 將保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCC201567的豬睪丸細胞懸浮 適應株ST-2014S復蘇傳代培養(yǎng)，然后接種到生物反應器中懸浮培養(yǎng)，得到ST細胞懸浮培養(yǎng) 液，具體步驟如下： ① 取液氮凍存的ST-2014S細胞株，快速融化后加入盛有營養(yǎng)液的搖瓶中，于36~37°C 培養(yǎng)60~72h，按照1:3-1:5的比例傳代放大培養(yǎng)； ② 將步驟①中放大培養(yǎng)的ST-2014S細胞株稀釋至5-10X105個/ml的密度，接種入生 物反應器，培養(yǎng)溫度為36~37°C，pH值為6. 8~7. 2,溶氧為40%~60%，ST-2014S細胞懸 浮生長曲線如圖1所示； ③ 三批次生物反應器中細胞密度的測定：用生物反應器連續(xù)培養(yǎng)三個批次ST-2014S 細胞，培養(yǎng)條件同步驟②，在培養(yǎng)的第72小時采樣，細胞離心后用胰酶消化，用臺盼蘭染色 法檢測細胞密度，實驗結(jié)果如表1所示。
[0021] 表 1
實施例2利用生物反應器懸浮培養(yǎng)ST細胞培養(yǎng)豬瘟病毒的方法 在搖瓶中培養(yǎng)擴增懸浮ST細胞，按7. 5X105個/ml的密度，接種入生物反應器，細胞培 養(yǎng)條件為：反應器工作體積10升，細胞培養(yǎng)溫度為37°C，pH值為7. 0,溶氧為50%，培養(yǎng)72 小時，細胞密度為32. 7X106個/ml時，更換為含1. 0%新生牛血清的病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)液， 按照病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)基體積的6%接種豬痕病毒C株，病毒培養(yǎng)條件為：溫度36°C，pH值 為7. 0,溶氧為45%，培養(yǎng)72小時收獲第一批病毒液，繼續(xù)加注病毒維持液連續(xù)培養(yǎng)病毒，共 收獲3批病毒液，病毒滴度按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》家兔定型熱反應標準 進行判定，收獲病毒含量為4X106RID/ml。
[0022] 實施例3-5 利用生物反應器懸浮培養(yǎng)ST細胞培養(yǎng)偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸 炎病毒、豬細小病病毒的方法 ST-2014S細胞懸浮培養(yǎng)方法同實施例2,培養(yǎng)72h時將細胞生長培養(yǎng)基更換為病毒培 養(yǎng)維持培養(yǎng)基，病毒培養(yǎng)條件在具體實施例中按照接種病毒的不同適當調(diào)整，參照表2,所 有病毒滴度的測定按照常規(guī)試驗方法進行，實驗結(jié)果見表2。
[0023]表 2

【主權(quán)項】
1. 一株適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞，其特征在于：命名為豬睪丸細胞懸浮適應株 ST-2014S，已于2015年5月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC C201567。2. 權(quán)利要求1所述的ST細胞株在培養(yǎng)疫苗病毒中的應用。3. 權(quán)利要求2所述的ST細胞株在培養(yǎng)疫苗病毒中的應用，其特征在于：所述病毒為豬 瘟病毒、豬偽狂犬病毒，豬細小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒。4. 一種ST細胞株培養(yǎng)疫苗病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將液氮凍存的如權(quán)利要求1所述ST細胞株復蘇，用搖瓶懸浮培養(yǎng)擴增，以細胞濃度 5-10 X IO5個/ml接種至生物反應器中懸浮培養(yǎng)，得到ST細胞懸浮培養(yǎng)液； (2) 當ST細胞懸浮培養(yǎng)液中細胞密度達到2-4X IO6個/ml時，用病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)基 替換細胞生長培養(yǎng)基，并按照病毒培養(yǎng)維持培養(yǎng)基終體積的3. 0-8. 0%接種病毒； (3) 在生物反應器中繼續(xù)培養(yǎng)ST懸浮細胞24-96h，收獲病毒液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的ST細胞株培養(yǎng)疫苗病毒的方法，其特征在于：所述的生物反 應器為工業(yè)化攪拌式生物反應器。
【專利摘要】本發(fā)明涉及株適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞及其在培養(yǎng)疫苗病毒中的應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞，命名為豬睪丸細胞懸浮適應株ST-2014S，已于2015年5月13日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC？C201567，本發(fā)明還公開了利用ST細胞懸浮適應株培養(yǎng)疫苗病毒的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開的一種適應全懸浮培養(yǎng)的ST細胞培養(yǎng)疫苗病毒自動化程度高，不需要載體介入，可以在無血清或低血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，解決病毒培養(yǎng)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的要求，開發(fā)能滿足GMP生產(chǎn)技術(shù)要求的大規(guī)?；a(chǎn)方法，擁有很好的工業(yè)化應用前景。CCTCC V20152520150708
【IPC分類】C12N5/071, C12R1/93, C12N7/00
【公開號】CN105112352
【申請?zhí)枴緾N201510407298
【發(fā)明人】李少英, 徐樹蘭, 吳華偉, 徐光科
【申請人】鄭州愛科生物科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年7月13日