一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，包括培養(yǎng)基制備、益生菌菌種活化、益生菌菌懸液的制備、益生菌固態(tài)發(fā)酵、益生菌孢子粉干燥、益生菌高孢粉抽提及粉碎和益生菌孢子粉成品質(zhì)檢及包裝共7個步驟，該方法采用固態(tài)發(fā)酵制備益生菌孢子粉，降低了生產(chǎn)過程中雜菌的污染率，發(fā)酵過程能耗低；產(chǎn)物濃度高，提取工藝簡單；整個生產(chǎn)過程零廢液排放；該方法采用集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器，簡化操作工序，縮短了生產(chǎn)周期，節(jié)約能耗，提高生產(chǎn)效率。
【專利說明】一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及益生菌發(fā)酵生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]益生菌是指當(dāng)攝入充足的數(shù)量后，能對宿主產(chǎn)生一種或多種由論證的功能性健康益處的活的微生物，主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸菌、芽孢桿菌、埃希氏菌以及酵母屬等。
[0003]益生菌能促進(jìn)機體微生物菌群和酶的平衡以及刺激特異性和非特異性的免疫機制，達(dá)到預(yù)防某些疾病、促進(jìn)發(fā)育、增強體質(zhì)、延緩衰老和延長壽命的目的。
[0004]CN 103146616 A公開了一種制備復(fù)合乳酸菌制劑的方法及應(yīng)用。所述方法包括農(nóng)副產(chǎn)品廢渣預(yù)處理、菌株擴大培養(yǎng)、復(fù)合菌株液態(tài)培養(yǎng)、復(fù)合菌株液固態(tài)偶聯(lián)發(fā)酵。該發(fā)明克服了當(dāng)前益生菌飼料添加劑產(chǎn)品存在的性能穩(wěn)定性差、生產(chǎn)成本高的問題，其不僅使復(fù)合乳酸菌制劑產(chǎn)品中的菌株競爭力增強，宿主定植率得到提高，而且，該方法能大幅度減小成本，并有效利用農(nóng)副產(chǎn)品廢渣資源，使其成為飼料添加劑成分中的重要組成部分，在一定程度上解決了資源浪費和環(huán)境污染等突出問題，可成功應(yīng)用于飼料方面。但該方法發(fā)酵效率低，成本高，得到的復(fù)合乳酸菌制劑的活菌總數(shù)僅達(dá)7.8~8.5 X IO9 cfu/ml，無法滿足市場的要求。
[0005]CN 103211085 A公開了一種飼用高效復(fù)合益生菌劑及制備方法,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述的復(fù)合益生菌劑由地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis),嗜熱乳酸鏈球菌{,Streptococcus thermophilus) >11 Mil{Saccharomycerevisiae Hansen)分另lj發(fā)酵培養(yǎng)后按比例混合而成，有效微生物數(shù)目達(dá)到8~120 X 108CFU/mL ;所述復(fù)合益生菌劑菌株間配伍科學(xué)合理，能殺死或抑制動物體內(nèi)的病原菌，促進(jìn)飼料的消化吸收，能大大減少飼料中抗生素的使用。但該方法制備工藝復(fù)雜，且益生菌含量偏低。
[0006]目前，益生菌制劑應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)，然而，在制備工藝上大部分采用液態(tài)發(fā)酵制備，發(fā)酵控制條件苛刻，生產(chǎn)成本高，少數(shù)采用固態(tài)發(fā)酵制備的工藝復(fù)雜，得到的益生菌含量低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，縮短發(fā)酵周期、降低生產(chǎn)能耗，提高益生菌的發(fā)酵效率，得到含菌量高的復(fù)合型益生菌。
[0008]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為:一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，包括以下步驟:
a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:組成成分為馬鈴薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖或蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.03%、瓊脂 1.5~2%、pH 為 6.5~7.0 ；種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為米糠7~10%或麥麩2~10%、花生柏或豆柏2~5%、蛋白胨0.5~1.0%、蔗糖2%、瓊脂2%，pH為6.0~7.0 ；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為3:7~5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50% wt ~60% wt, pH 自然；
b)益生菌菌種活化:將冷凍管中的菌體或斜面培養(yǎng)保存的菌種轉(zhuǎn)接至茄子瓶內(nèi)培養(yǎng)；
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌按l:10(Tl:50的接種量轉(zhuǎn)接至種子罐中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.01-0.2vvm,攪拌速度為
0.1-0.2rpm，細(xì)菌在34~39°C培養(yǎng)24~36h后轉(zhuǎn)至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在
1.(Tl.5X107cfu/g ;真菌在25~30°C培養(yǎng)44~60h至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在
3.0~5.0X106cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):
將步驟c)得到的細(xì)菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量f 2%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風(fēng)量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為34~39°C，物料濕度控制在55~65%，45~55h內(nèi)每4h取樣檢測物料的含菌量，當(dāng)含菌量<5.0X 109cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量21%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風(fēng)量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為25~30°C，物料濕度控制在55~65%，57~66h內(nèi)每2h取樣檢測物料的活菌量，當(dāng)活菌量<5.0X 108cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至60°C、攪拌速度調(diào)至3飛rpm，干燥至孢子粉的含水率低于12%，并通過提高攪拌速度進(jìn)行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:采用旋風(fēng)分離集孢器進(jìn)行抽提得到高孢粉，然后根據(jù)所需的含孢量，并在高孢粉中加入填充料，混合，再根據(jù)益生菌孢子粉的配方將細(xì)菌和真菌高孢粉按重量比例為8:2飛:5進(jìn)行混合過篩得到益生菌孢子粉；
g)益生菌孢子粉成品質(zhì)檢及包裝。
[0009]進(jìn)一步，步驟a)中的茄子瓶培養(yǎng)基和種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基在121°C，0.1MPa滅菌15~20min，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基在90~95°C，滅菌6(T80min，備用。
[0010]進(jìn)一步，步驟b)中益生菌活化培養(yǎng)條件為:細(xì)菌在32 土 1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在25± 1°C靜置培養(yǎng)48h。
[0011]進(jìn)一步，步驟c)中菌懸液含菌量采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)。
[0012]優(yōu)選，步驟c)中細(xì)菌的培養(yǎng)時間為24~28h，真菌的培養(yǎng)時間為48飛6h。
[0013]進(jìn)一步，步驟d)中的發(fā)酵罐為集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器。
[0014]進(jìn)一步，步驟drg)中物料的含菌量的檢測方法為:用500ml或250ml三角瓶裝IOOml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的營養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌冷卻后，放待測益生菌孢子粉0.1g或高孢粉4mg，置于140rpm搖床上28°C 土 TC培養(yǎng)24h，再用無菌水進(jìn)行梯度稀釋后，取樣制片鏡檢，鏡檢時用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，記錄每個中格發(fā)芽孢子(孢子膨脹比原孢大I倍或芽長度大于孢子半徑的)與未發(fā)芽孢子數(shù)，含菌量(XlO8 / g)= (4個中格孢子總數(shù)X4X10X稀釋倍數(shù))/ 100 ；
活菌率:物料的活菌率(%)=發(fā)芽孢子數(shù)/ (發(fā)芽孢子數(shù)+未發(fā)芽孢子數(shù))X 100%。[0015]進(jìn)一步，步驟f)益生菌高孢粉抽提操作為:先打開旋風(fēng)分離集孢器的抽風(fēng)機開關(guān)進(jìn)行抽風(fēng)，使集孢器內(nèi)形成負(fù)壓，然后打開進(jìn)料口投入步驟e)所得的益生菌孢子粉，關(guān)閉進(jìn)料口后，啟動集孢器，用正、反方向交替攪拌揚孢6~8min，得到高孢粉，打開殘渣出口，將殘渣排出即可。
[0016]進(jìn)一步，步驟a)、)中的所述益生菌中的細(xì)菌為益生菌中的細(xì)菌為枯草芽抱桿菌枯草亞種{Bacillus subtilis、、植物乳桿菌{Lactobacillus plan tarum)和雙歧桿菌{Bifidobacterium)中的一種或多種，益生菌中的真菌為釀酒酵母{Saccharomycere vi siae Hansen)或 / 和米曲霉{Aspergillus Orvzae) 0
[0017]進(jìn)一步，該方法發(fā)酵得到的益生菌孢子粉以0.05、.15%的劑量添加到獸禽類飼料，或以0.10-θ.20%的劑量添加到獸禽飲水中。
[0018]本發(fā)明一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法的有益效果:
1)方法采用固態(tài)發(fā)酵制備益生菌孢子粉，降低了生產(chǎn)過程中雜菌的污染率，發(fā)酵過程能耗低；
2)固態(tài)發(fā)酵過程采用稻殼和麥麩作為培養(yǎng)基，在發(fā)酵結(jié)束后還可以作為益生菌的吸附載體，減少益生菌孢子粉制備過程中填充料的用量；
3)產(chǎn)物濃度高，提取工藝簡單；
4)整個生產(chǎn)過程零廢液排放；
5)該方法采用集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器，簡化操作工序，縮短了生產(chǎn)周期，節(jié)約能耗，提高生產(chǎn)效率； 【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1—為本發(fā)明一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法采用的集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021]參照圖1:集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器(簡稱臥式固態(tài)生物反應(yīng)器)I，為雙錐圓筒臥式固態(tài)生物反應(yīng)器，公稱容積為3000L，裝料系數(shù)為0.6^0.70 ;臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I帶有雙向S型螺旋攪拌槳1-1 ;臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I頂部依次設(shè)有料液進(jìn)口 1-2、排氣口 1-3、壓力表1-4和進(jìn)氣口 1-5，臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I底部設(shè)有排污口1-6，臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I前端右上側(cè)設(shè)有進(jìn)料口 1-7，臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I前端左下側(cè)設(shè)有出料口 1-8，進(jìn)料口 1-7和出料口 1-8均設(shè)有視窗1-9 ;臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I外側(cè)設(shè)有夾套1-10，夾套1-10的下側(cè)設(shè)有進(jìn)水口 1-101，夾套110的上側(cè)設(shè)有出水孔1-102 ;臥式固態(tài)生物反應(yīng)器I中部連有濕度計、PH計、溶氧電極和溫度計。
[0022]物料的含菌量的檢測方法為:用500ml或250ml三角瓶裝IOOml含蛋白胨0.5%和
蔗糖2%的營養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌冷卻后，放待測益生菌孢子粉0.1g或高孢粉4mg，置于140rpm搖床上28°C ±1°C培養(yǎng)24h，再用無菌水進(jìn)行梯度稀釋后，取樣制片鏡檢，鏡檢時用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，記錄每個中格發(fā)芽孢子(孢子膨脹比原孢大I倍或芽長度大于孢子半徑的)與未發(fā)芽孢子數(shù)，含菌量(XlO8 / g)= (4個中格孢子總數(shù)X4X10X稀釋倍數(shù))/ 100。[0023]活菌率:物料的活菌率(%)=發(fā)芽孢子數(shù)/ (發(fā)芽孢子數(shù)+未發(fā)芽孢子數(shù))X 100%。
[0024]物料濕度的測定方法:先將玻皿在120°C干燥箱內(nèi)烘干，15min后取出稱重(用萬分之一的分析天平)，再稱5g孢子粉于皿內(nèi)，在120°C干燥箱內(nèi)定溫烘2h，取出立即將樣品和玻皿，一起稱重，每個樣品做三個重復(fù)，取其平均值，按公式:物料濕度) = [ (5-烘干后重量)/ 5] X 100%進(jìn)行計算物料濕度。
[0025]實施例1: a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:組成成分為馬鈴薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.03%、瓊脂 2.0%、ρΗ 為 7.0，121。。，0.1MPa 滅菌 15min，備用；
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為米糠10%、花生柏5%、蛋白胨1.0%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 6.5，121。。，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為3:7,固體培養(yǎng)基的含水率為60%wt, pH自然，95°C滅菌60min,備用；
b)益生菌菌種活化:將冷凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822(.Bacillus)、植物乳桿菌 CICC21790 {Lactobacillus plan tarum)以及釀酒酵母CICC31830 {Saccharomycerevisiae Hansen)轉(zhuǎn)接至爺子瓶內(nèi)靜置培養(yǎng)，細(xì)菌在34± 1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在27°C ±1°C靜置培養(yǎng)48h;
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌按1:100的接種量轉(zhuǎn)接至種子罐中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.1vvm,攪拌速度為0.2rpm,細(xì)菌在34± 1°C培養(yǎng)36h后轉(zhuǎn)至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.15X107 cfu/g ;真菌在27°C ± 1°C培養(yǎng)54h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在3.0 X 106cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器內(nèi)，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細(xì)菌和真菌；
將步驟c)得到的細(xì)菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量2.0%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02MPa，通風(fēng)量為0.2vvm，攪拌速度為1.0rpm，培養(yǎng)溫度控制在34土 1°C，物料濕度控制在56± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種在48h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
6.5X109cfu/g，活菌率為95.2%時，48h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，植物乳桿菌在46h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為7.2 X IO9Cfu/g，活菌率為96.4%時，46h停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的釀酒酵母菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量4.0%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02MPa，通風(fēng)量為0.2vvm，攪拌速度為0.8rpm，培養(yǎng)溫度為27±1°C，物料濕度控制在60± 1.0%，釀酒酵母在58h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為6.5X108cfu/g,活菌率為96.7%時，58h停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至60±1°C、攪拌速度調(diào)至5rpm，干燥12h后，孢子粉的含水率為11.70%，然后，通過提高攪拌速度至20rpm進(jìn)行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:采用旋風(fēng)分離集孢器進(jìn)行抽提得到高孢粉，先打開旋風(fēng)分離集孢器的抽風(fēng)機開關(guān)進(jìn)行抽風(fēng)，使集孢器內(nèi)形成負(fù)壓，然后打開進(jìn)料口投入步驟e)所得的益生菌孢子粉，關(guān)閉進(jìn)料口后，啟動集孢器，用正、反方向交替攪拌揚孢6~8min，得到高孢粉，打開殘渣出口，將殘渣排出即可；然后根據(jù)所需的含孢量，在抽提得到的高孢粉中加入填充料，混合，然后將細(xì)菌和真菌的高孢粉按重量5:5進(jìn)行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質(zhì)檢及包裝:對益生菌孢子粉的含菌量、活菌率及含水率進(jìn)行檢測，并將益生菌孢子粉按規(guī)定規(guī)格進(jìn)行包裝，包裝袋內(nèi)應(yīng)放孢子粉使用說明書，包裝外貼有標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容包括益生菌孢子粉的含菌量、活菌率及含水率、細(xì)度、生產(chǎn)日期、檢驗人、使用方法、毛重、凈重、有效期等。
[0026]通過該生產(chǎn)方法得到含4.55X1010cfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、5.13 X IO10Cfu/g植物乳桿菌和5.21 X 109cfu/g釀酒酵母，含水率為11.70%的益生菌孢子粉。
[0027]實施例2:
a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:葡萄糖改用蔗糖，其他同實施例1 ;
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為麥麩7%、豆柏3.0%、蛋白胨0.7%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 7.0，121。。，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50%wt, pH自然，90°C滅菌80min,備用；
b)益生菌菌種活化:將冷 凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822(.Bacillus subtil is、以及釀酒酵母 CICC31380 {Saccharomycere vi siae Hansen)和米曲霉CICC41383 {Aspergillus Orvzae)轉(zhuǎn)接至茄子瓶內(nèi)靜置培養(yǎng)，細(xì)菌在39± 1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在25°C ±1°C靜置培養(yǎng)48h;
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌按1:80的接種量轉(zhuǎn)接至種子罐中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.2vvm,攪拌速度為0.2rpm,細(xì)菌在39± 1°C培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.5X107 cfu/g;真菌在25°C ±1°C培養(yǎng)60h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在5.0 X IO6 cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器內(nèi)，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細(xì)菌和真菌；
將步驟c)得到的枯草芽孢桿菌枯草亞種菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量1.0%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.03MPa，通風(fēng)量為0.25vvm，攪拌速度為1.2rpm，培養(yǎng)溫度控制在39 ± I °C，物料濕度控制在65 ± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種52h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為8.4X109cfu/g,活菌率為95.8%時，52h停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量2.0%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.03MPa,通風(fēng)量為0.23vvm,攪拌速度為1.0rpm,培養(yǎng)溫度為25 ± I °C，物料濕度控制在57± 1.0%，釀酒酵母在61h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為6.9 X 108cfu/g,活菌率為96.1%時，61h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，米曲霉在65h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為6.5 X 108cfu/g,活菌率為97.3%時，65h停止發(fā)酵；e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至60±1.(TC、攪拌速度調(diào)至5rpm,干燥8h后,孢子粉的含水率為11.45%,然后,通過提高攪拌速度至15rpm進(jìn)行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:同實例1，然后將細(xì)菌和真菌的孢子粉按重量6:4進(jìn)行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質(zhì)檢及包裝:同實例I。
[0028]通過該生產(chǎn)方法得到含5.89X 10lclcfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、5.92X 109cfu/g釀酒酵母和5.21X109cfu/g米曲霉，含水率為11.45%的益生菌孢子粉。
[0029]實施例3:
a)培養(yǎng)基制備:
爺子瓶培養(yǎng)基:同實施例1 ;
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為麥麩10%、豆柏5.0%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 6.8，121 °C，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為4:6,固體培養(yǎng)基的含水率為55%wt, pH自然，92°C滅菌70min,備用；
b)益生菌菌種活化:將冷凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822(.Bacillus 仰況/7/5.)、植物乳桿菌 CICC21790plan tarum)和雙歧桿菌CICC6185 (Bi fi dobac teri um Breve)以及釀酒酵母 CICC31380 {Saccharomycere vi siaeHansen)和米曲霉CICC41383 Orvzae)轉(zhuǎn)接至爺子瓶內(nèi)靜置培養(yǎng),細(xì)菌在36±1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在28 °C ±1°C靜置培養(yǎng)48h ；
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌按1:50的接種量轉(zhuǎn)接至種子罐中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.2vvm,攪拌速度為0.15rpm,細(xì)菌在36±1°C培養(yǎng)28h后轉(zhuǎn)至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.30X 107 cfu/g ;真菌在28°C ± 1°C培養(yǎng)48h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在4.50 X IO6 cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器內(nèi)，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細(xì)菌和真菌；
將步驟c)得到的細(xì)菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量1.5%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.23vvm,攪拌速度為0.8rpm,培養(yǎng)溫度控制在36 ± I °C，物料濕度控制在60± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種在52h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
6.7 X 109cfu/g,活菌率為95.6%時，52h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，植物乳桿菌在45h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為5.95X 109cfu/g，活菌率為97.5%時，45h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，雙歧桿菌在50h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為7.35X IO9Cfu/g，活菌率為96.3%時，50h停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量3.0%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.25vvm,攪拌速度為0.8rpm,培養(yǎng)溫度為28°C ± I °C，物料濕度控制在64±1.0%，釀酒酵母在61h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為6.45X 108cfu/g,活菌率為97.0%時，61h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，米曲霉在65h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為5.80X 108cfu/g,活菌率為97.8%時，65h停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至60±1.(TC、攪拌速度調(diào)至5rpm,干燥IOh后,孢子粉的含水率為11.85%,然后,通過提高攪拌速度至18rpm進(jìn)行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:同實例1，然后將細(xì)菌和真菌的孢子粉按重量8:2進(jìn)行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質(zhì)檢及包裝:同實例I。
[0030]通過該生產(chǎn)方法得到含4.69 X IOltlCfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、4.16 X IO10Cfu/g植物乳桿菌、5.27X1010cfu/g雙歧桿菌、5.13X 109cfu/g釀酒酵母和4.78X 109cfu/g米曲霉，含水率為11.85%的益生菌孢子粉。
[0031]實施例4:
a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:葡萄糖改用蔗糖，其他同實施例1 ;
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為麥麩7%、豆柏3.0%、蛋白胨0.7%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 7.0，121。。，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50%wt, pH自然，90°C滅菌80min,備用；
b) 益生菌菌種活化:將冷凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822{Bacillus subtilis、、植物乳桿菌 CICC21790 {Lactobacillus plan tarum)、雙歧桿菌CICC6185 (Bi fi dobac teri um Breve)以及米曲霉 CICC41383 045/76?/及_/77"5.CrFzae)轉(zhuǎn)接至茄子瓶內(nèi)靜置培養(yǎng)，細(xì)菌在37± I°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在30°C ±1°C靜置培養(yǎng)48h ；
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌按1:60的接種量轉(zhuǎn)接至種子罐中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa，通風(fēng)量為0.15vvm，攪拌速度為0.lOrpm，細(xì)菌在37土 1°C培養(yǎng)26h后轉(zhuǎn)至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.35X IO7 cfu/g ;真菌在30°C ± 1°C培養(yǎng)44h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)，使菌懸液含菌量在4.75 X IO6 cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器內(nèi)，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細(xì)菌和真菌；
將步驟c)得到的細(xì)菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量1.2%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.04MPa,通風(fēng)量為0.22vvm,攪拌速度為1.2rpm,培養(yǎng)溫度控制在37土 TC，物料濕度控制在62± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種48h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
8.7X109cfu/g，活菌率為96.5%時，48h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，植物乳桿菌在46h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
7.85X 109cfu/g，活菌率為96.8%時，46h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，雙歧桿菌在52h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為6.94X IO9Cfu/g，活菌率為97.1%時，52h停止發(fā)酵；將步驟C)得到的米曲霉菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量2.5%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.04MPa,通風(fēng)量為0.23vvm,攪拌速度為0.8rpm,培養(yǎng)溫度為30 ± I °C，物料濕度控制在65 ±1.0%，米曲霉在62h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為7.15X108cfu/g，活菌率為96.4%時，62h停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至60±1.(TC、攪拌速度調(diào)至5rpm，干燥8h后，孢子粉的含水率為11.27%，然后，通過提高攪拌速度至15rpm進(jìn)行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:同實例1，然后將細(xì)菌和真菌的孢子粉按重量6:4進(jìn)行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質(zhì)檢及包裝:同實例I。
[0032] 通過該生產(chǎn)方法得到含6.09X1010cfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、5.47 X IO10Cfu/g植物乳桿菌、4.95X 101Qcfu/g雙歧桿菌和5.36X 109cfu/g米曲霉，含水率為11.27%的益生菌孢子粉。
【權(quán)利要求】
1.一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)培養(yǎng)基制備: 茄子瓶培養(yǎng)基:組成成分為馬鈴薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖或蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.03%、瓊脂 1.5~2%、pH 為 6.5~7.0 ； 種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為米糠7~10%或麥麩2~10%、花生柏或豆柏2飛％、蛋白胨0.5~1.0%、蔗糖2%、瓊脂2%，pH為6.0~7.0 ； 固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為3:7~5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50% wt ~60% wt, pH 自然； b)益生菌菌種活化:將冷凍管中的菌體或斜面培養(yǎng)保存的菌種轉(zhuǎn)接至茄子瓶內(nèi)培養(yǎng)； c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌按l:100:l:50的接種量轉(zhuǎn)接至種子罐中進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風(fēng)量為0.1-0.2vvm,攪拌速度為0.1-0.2rpm，細(xì)菌在34~39°C培養(yǎng)24~36h后轉(zhuǎn)至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在1.(Tl.5X107cfu/g ;真菌在25~30°C培養(yǎng)44~60h至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在3.0~5.0X106cfu/g ； d)益生菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng): 將步驟c)得到的細(xì)菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量f 2%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風(fēng)量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為34~39°C，物料濕度控制在55~65%，45~55h內(nèi)每2h取樣檢測物料的含菌量，當(dāng)含菌量≥5.0X 109cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵； 將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量21%轉(zhuǎn)接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風(fēng)量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為25~30°C，物料濕度控制在55~65%，57~66h內(nèi)每2h取樣檢測物料的活菌量，當(dāng)活菌量≥5.0X 108cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵； e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵罐的溫度調(diào)至60°C、攪拌速度調(diào)至3飛rpm，干燥至孢子粉的含水率低于12%，并通過提高攪拌速度進(jìn)行粉碎； f)益生菌高孢粉抽提:采用旋風(fēng)分離集孢器進(jìn)行抽提得到高孢粉，然后根據(jù)所需的含孢量，并在高孢粉中加入填充料，混合，再根據(jù)益生菌孢子粉的配方將細(xì)菌和真菌高孢粉按重量比例為8:2飛:5進(jìn)行混合過篩得到益生菌孢子粉； g)益生菌孢子粉成品質(zhì)檢及包裝。
2.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，其特征在于，所述步驟a)中的茄子瓶培養(yǎng)基和種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基在121°C，0.1MPa滅菌15~20min，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基在90~95°C，滅菌6(T80min，備用。
3.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，步驟b)中所述的益生菌活化培養(yǎng)條件為:細(xì)菌在32±1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在25±1°C靜置培養(yǎng)48h。
4.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，步驟c)中所述的菌懸液含菌量采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)。
5.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，所述步驟c)中細(xì)菌的培養(yǎng)時間為24~28h，真菌的培養(yǎng)時間為48~56h。
6.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，步驟d)中所述的發(fā)酵罐為集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應(yīng)器。
7.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，所述步驟d)、)中物料的含菌量的檢測方法為:用500ml或250ml三角瓶裝100ml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的營養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌冷卻后，放待測益生菌孢子粉0.1g或高孢粉4mg，置于140rpm搖床上28°C ± 1°C培養(yǎng)24h，再用無菌水進(jìn)行梯度稀釋后，取樣制片鏡檢，鏡檢時用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，記錄每個中格發(fā)芽孢子(孢子膨脹比原孢大1倍或芽長度大于孢子半徑的)與未發(fā)芽孢子數(shù)，含菌量(X108 / g)= (4個中格孢子總數(shù)X4X10X稀釋倍數(shù))/ 100 ； 活菌率:物料的活菌率(%)=發(fā)芽孢子數(shù)/ (發(fā)芽孢子數(shù)+未發(fā)芽孢子數(shù))X 100%。
8.如權(quán)利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，步驟f)所述的益生菌高孢粉抽提操作為:先打開旋風(fēng)分離集孢器的抽風(fēng)機開關(guān)進(jìn)行抽風(fēng)，使集孢器內(nèi)形成負(fù)壓，然后打開進(jìn)料口投入步驟e)所得的益生菌孢子粉，關(guān)閉進(jìn)料口后，啟動集孢器，用正、反方向交替攪拌揚孢6~8min，得到高孢粉，打開殘渣出口，將殘渣排出即可。
9.如權(quán)利要求廣8任一項所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，其特征在于，步驟a)-e)中的所述益生菌中的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種{Bacillus植物乳桿菌{Lactobacillus plantarum)和雙歧桿菌{Bifidobacterium)中的一種或多種，益生菌中的真菌為釀酒酵母{Saccharomycerevisiae Hansen)或/和米曲霉{AspergillusOrvzae)。
10.如權(quán)利要求1-8任一項所述一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)益生菌孢子粉的方法，其特征在于，所述方法發(fā)酵得到的益生菌孢子粉以0.05-0.15%的劑量添加到獸禽類飼料，或以0.10-0.20%的劑量添加到獸禽飲水中。
【文檔編號】C12R1/25GK103468630SQ201310464827
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】向洋, 向夢蘭 申請人:長沙理工大學(xué)