基于氧化石墨烯和限制性內(nèi)切酶的dna甲基化檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA甲基化檢測(cè)方法，包括以下步驟：1）DNA序列的選取，2）DNA雙鏈的雜交。本發(fā)明還公開了一種DNA甲基化檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明可以直接通過DNA鏈的雜交，借助氧化石墨烯和DNA的相互作用，在CpG島區(qū)通過各種甲基化過程使得胞嘧啶甲基化，利用限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特定位點(diǎn)并且切割CpG位置的功能，達(dá)到檢測(cè)甲基化DNA的目的，此方法與現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)比較具有操作簡(jiǎn)單，快速便捷的特點(diǎn)，同時(shí)本發(fā)明可以檢測(cè)一些對(duì)人體有害的化學(xué)試劑對(duì)DNA造成的影響是DNA的甲基化。
【專利說明】基于氧化石墨烯和限制性內(nèi)切酶的DNA甲基化檢測(cè)方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于氧化石墨烯和限制性內(nèi)切酶的DNA甲基化檢測(cè)方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA / TGG和GATC常被甲基化而真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。高等真核細(xì)胞通常是對(duì)DNA分子上5’ -CpG-3’序列的胞嘧啶進(jìn)行甲基化修飾，使CpG 二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調(diào)控了基因的表達(dá)。
[0003]DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要的作用，參與了動(dòng)物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白互相作用方式的改變，從而控制基因的表達(dá)。[0004]甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的還包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動(dòng)遺傳因子的激活、原癌基因的表達(dá))和抑癌基因的不表達(dá)。因此對(duì)甲基化的研究為腫瘤早期預(yù)測(cè)，分類，分級(jí)，以及預(yù)后評(píng)估提供了新的依據(jù)。
[0005]CpG島甲基化的檢測(cè)方法眾多。其原理大部分是基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法；基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法的方法。大部分方法會(huì)與PCR技術(shù)和高通量芯片技術(shù)聯(lián)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供基于氧化石墨烯和限制性內(nèi)切酶的DNA甲基化檢測(cè)方法。本發(fā)明還提供了該檢測(cè)方法的試劑盒。
[0007]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種DNA甲基化檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0008]I )DNA序列的選取:含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA、與探針DNA有一段互補(bǔ)的靶基因DNA，標(biāo)準(zhǔn)化甲基化靶基因DNA得到的序列1、甲基化轉(zhuǎn)移酶造成的甲基化靶基因DNA得到的序列2以及引起DNA甲基化化學(xué)試劑造成的甲基化靶基因DNA的序列3 ；
[0009]2) DNA雙鏈的雜交:探針DNA分別與靶基因DNA、序列1、序列2和序列3進(jìn)行雜交，再加入適量的氧化石墨烯，然后加入限制性內(nèi)切酶，通過觀察甲基化前后雙鏈DNA與氧化石墨烯作用后的熒光恢復(fù)程度不同來檢測(cè)是否甲基化。
[0010]其中，探針DNA與靶基因DNA進(jìn)行雜交，再加入適量的氧化石墨烯，由于雙鏈形成而且尾部還有一端多出堿基的單鏈DNA，雙鏈DNA不能脫離氧化石墨烯表面，因此熒光強(qiáng)度還是很弱。當(dāng)雙鏈DNA中加入限制性內(nèi)切酶，酶會(huì)識(shí)別并切斷CCGG的第二個(gè)胞嘧啶位置，從而在加入氧化石墨烯后，被切割的片段帶熒光的DNA就會(huì)脫離氧化石墨烯表面，熒光恢復(fù)。探針DNA比靶基因DNA多了 10個(gè)堿基，是為了使得雜交后的雙鏈DNA在氧化石墨烯的表面的熒光強(qiáng)度還是很弱的一種狀態(tài)。雜交后的雙鏈在和氧化石墨烯相互作用后仍然是熒光很弱的狀態(tài)，但當(dāng)在形成的雙鏈DNA中加入限制性內(nèi)切酶，識(shí)別并切割CpG位點(diǎn)，在氧化石墨烯表面被切割的小片段的帶熒光基團(tuán)的DNA會(huì)脫離氧化石墨烯表面，從而熒光恢復(fù)。
[0011]甲基化的過程是通過試劑間的化學(xué)反應(yīng)或者甲基化轉(zhuǎn)移酶(M.SssI)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)反應(yīng)產(chǎn)生甲基自由基從而使DNA的胞嘧啶C進(jìn)行甲基化。甲基化后的DNA與探針DNA雜交形成雙鏈DNA，在有限制性內(nèi)切酶存在的條件下，不會(huì)切割已經(jīng)被甲基化的DNA,雙鏈DNA仍然在石墨烯表面，熒光無法恢復(fù)。
[0012]其中，序列I是通過標(biāo)準(zhǔn)化甲基化靶基因DNA得到的序列，所述標(biāo)準(zhǔn)化甲基化靶基因DNA是直接人工合成的胞嘧啶位置進(jìn)行5’C位置甲基化得到的。選取標(biāo)準(zhǔn)化甲基化DNA與探針DNA雜交，具體檢測(cè)方法和上述一樣，得到結(jié)果是甲基化不影響雙鏈DNA的形成，與氧化石墨烯作用后雙鏈仍然在氧化石墨烯表面，熒光仍然是猝滅狀態(tài)且與酶識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)一個(gè)堿基錯(cuò)配的熒光強(qiáng)度是一致的，說明形成的甲基化雙鏈DNA并沒有被酶識(shí)別切割。
[0013]被處理過的DNA是被甲基化的，而不是斷鏈的。有報(bào)道亞鐵離子和雙氧水在與DNA反應(yīng)足夠時(shí)間是導(dǎo)致DNA斷鏈的，那么這時(shí)雙鏈DNA是無法形成的，此時(shí)在氧化石墨烯表面都是單鏈DNA的存在形式。那么在同樣氧化石墨烯量存在的條件下，雖然都是熒光猝滅的狀態(tài)，但帶有熒光基團(tuán)的單鏈探針DNA更容易在氧化石墨烯表面猝滅。雜交后的雙鏈DNA有脫離氧化石墨烯表面的趨勢(shì)，所以熒光強(qiáng)度要比單鏈在氧化石墨烯表面的強(qiáng)。
[0014]其中，序列2是甲基化轉(zhuǎn)移酶與S-腺苷甲硫氨酸作用形成甲基自由基從而使DNA堿基甲基化得到的序列。
[0015]一種常見的甲基化轉(zhuǎn)移酶(M.SssI)和S腺甲硫氨酸SAM與DNA反應(yīng)后會(huì)使得DNA胞嘧啶C位置甲基化。與之對(duì)比，化學(xué)常見有毒試劑二甲亞砜和乙醛在有亞鐵離子和雙氧水存在的條件下與DNA作用后，檢測(cè)方法同上述，根據(jù)熒光數(shù)值分析，甲基化處理后的DNA不影響雜交，雙鏈DNA未能完全脫離氧化石墨烯的表面，只是無法實(shí)現(xiàn)酶切過程，熒光信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)化的甲基化的檢測(cè)結(jié)果是接近的。由此可判斷DNA處理后是被甲基化的。
[0016]其中，序列3中引起DNA甲基化的化學(xué)試劑選自兩種，一種是DMS0，一種是乙醛。這兩種試劑都是常見的化學(xué)上具有一定毒性的化學(xué)藥品，對(duì)人體有一定的危害。二價(jià)亞鐵離子和雙氧水反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生羥基自由基然后與DMSO或者乙醛之類的化學(xué)試劑反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生甲基自由基從而得到序列3。
[0017]所述限制性內(nèi)切酶為Hpall。探針DNA中的CCGG序列中設(shè)計(jì)一個(gè)堿基的錯(cuò)配，第二個(gè)胞嘧啶換成腺嘌呤A。作為控制條件，在Hpa II的識(shí)別位置CCGG中設(shè)計(jì)一個(gè)堿基的錯(cuò)配，第二個(gè)胞嘧啶換成腺嘌呤A，當(dāng)探針DNA與靶基因DNA雜交后，再加入限制性內(nèi)切酶，最后發(fā)現(xiàn)熒光并沒有完 全恢復(fù)但是比單鏈探針DNA的要強(qiáng)，說明雙鏈DNA形成后并沒有被酶識(shí)別切割。
[0018]所述引起DNA甲基化化學(xué)試劑為二甲亞砜和乙醛。
[0019]所述胞嘧啶是CpG島區(qū)的胞嘧啶。[0020]本發(fā)明檢測(cè)DNA甲基化方法中，通過酶或者化學(xué)試劑的反應(yīng)產(chǎn)生甲基自由基使得DNA堿基甲基化。
[0021]一種DNA甲基化檢測(cè)試劑盒，包括以下成分:
[0022]I) 25微克/毫升的氧化石墨烯；
[0023]2)限制性內(nèi)切酶HpaII ；
[0024]3)含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA ；
[0025]4)與探針DNA有一段互補(bǔ)的靶基因DNA ；
[0026]5) pH為7.2的33mM tris-醋酸緩沖體系。
[0027]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明可以直接通過DNA鏈的雜交，借助氧化石墨烯和DNA的相互作用，在CpG島區(qū)通過各種甲基化過程使得胞嘧啶甲基化，利用限制性內(nèi)切酶的識(shí)別特定位點(diǎn)并且切割CpG位置的功能，達(dá)到檢測(cè)甲基化DNA的目的，此方法與現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)比較具有操作簡(jiǎn)單，快速便捷的特點(diǎn)，同時(shí)本發(fā)明可以檢測(cè)一些對(duì)人體有害的化學(xué)試劑對(duì)DNA造成的影響是DNA的甲基化；與現(xiàn)有檢測(cè)DNA甲基化的方法比較，此方法實(shí)現(xiàn)了非標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)試劑造成的特定的DNA的甲基化。而且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，利用雙鏈DNA在氧化石墨烯上仍然是熒光很弱的猝滅狀態(tài)，再加入限制性內(nèi)切酶后熒光是否恢復(fù)的檢測(cè)方法來檢測(cè)DNA的甲基化。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是本發(fā)明檢測(cè)DNA CpG島區(qū)甲基化的示意圖。
[0029]圖2探針DNA和靶基因DNA雜交形成的雙鏈DNA在隨著氧化石墨烯的量從a到h:O, 1.25，2.5，5，10，25，50，100微克/毫升變化而變化的熒光強(qiáng)度圖；可以看出當(dāng)氧化石墨烯的量為25微克/毫升時(shí)，熒光減弱已經(jīng)接近到最低。
[0030]圖3探針DNA與靶基因DNA形成的雙鏈加酶后在不同的氧化石墨烯表面的熒光恢復(fù)強(qiáng)度。a代表氧化石墨烯濃度是25微克每毫升，b代表的是50微克每毫升，c代表的是100微克每毫升?？梢娭挥醒趸┑牧吭?5微克每毫升的時(shí)候，酶切后的熒光恢復(fù)是最強(qiáng)的，有利于酶切前后熒光信號(hào)的對(duì)比，所以選取氧化石墨烯的量為25微克/毫升。
[0031]圖4雙鏈DNA (—端多出10個(gè)堿基)隨著加入25微克/毫升的氧化石墨烯的時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度變化圖；可以看出雙鏈熒光強(qiáng)度隨氧化石墨烯的加入的減弱是非常迅速的。雜交的雙鏈并未完全脫離氧化石墨烯表面。
[0032]圖5實(shí)驗(yàn)方案原理驗(yàn)證圖；a代表探針DNA和靶基因DNA雜交后的熒光強(qiáng)度，c代表雙鏈DNA雜交后在氧化石墨烯表面的熒光強(qiáng)度，熒光大幅度減弱，b代表雙鏈DNA在加入限制性內(nèi)切酶后在氧化石墨烯表面的熒光強(qiáng)度，熒光恢復(fù)。
[0033]圖6實(shí)驗(yàn)方案原理驗(yàn)證圖；只有探針DNA:只有探針DNA:a代表探針DNA的熒光強(qiáng)度，c代表單鏈DNA在氧化石墨烯表面的熒光強(qiáng)度，熒光大幅度減弱，b代表單鏈DNA在加入限制性內(nèi)切酶后在氧化石墨烯表面的熒光強(qiáng)度，熒光未恢復(fù)。
[0034]從圖5和圖6結(jié)果證明單鏈探針DNA在加入氧化石墨烯后的熒光減弱強(qiáng)度比雜交后形成的雙鏈DNA的熒光減弱程度大，并且只有雜交后的雙鏈DNA在加入限制性內(nèi)切酶酶切后熒光恢復(fù)。
[0035]圖7靶基因DNA的特異性控制實(shí)驗(yàn)圖；a是完全互補(bǔ)的靶基因DNA，b代表的是在限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的CCGG中的單個(gè)堿基錯(cuò)配，第二個(gè)胞嘧啶C錯(cuò)配成腺嘌呤A，c代表的是完全不互補(bǔ)的靶基因DNA。由此可知，在限制性內(nèi)切酶位置出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，是不會(huì)被酶特定識(shí)別切割的。
[0036]圖8體系中不同的靶基因DNA情況導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度的變化圖。a代表的是無靶基因DNA，b代表的是完全不互補(bǔ)的靶基因DNA，c代表作為控制的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)CCGG中第二個(gè)胞嘧啶被腺嘌呤A取代的熒光強(qiáng)度，d代表的是作為標(biāo)準(zhǔn)的甲基化DNA，與c的熒光強(qiáng)度應(yīng)該是相似的，不會(huì)被酶切，e代表的是甲基化轉(zhuǎn)移酶形成的DNA甲基化，f代表的是靶基因DNA在亞鐵離子和雙氧水存在條件下，造成DNA斷鏈從而不能形成雜交雙鏈DNA的熒光強(qiáng)度，g代表的是f的基礎(chǔ)上再加入二甲亞砜的熒光強(qiáng)度，h代表的是f的基礎(chǔ)上在加入乙醛的熒光強(qiáng)度，i代表的是完全互補(bǔ)的靶基因DNA。可知，由甲基化轉(zhuǎn)移酶，二甲亞砜，乙醛形成的靶基因DNA甲基化在試劑量一樣情況下，甲基化程度是不一樣的，而且與DNA斷鏈有明顯區(qū)別。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0038]儀器:熒光分析儀
[0039]主要試劑:限制性內(nèi)切酶Hpa II，甲基化轉(zhuǎn)移酶，S-腺甲硫氨酸，二甲亞砜，乙醛，
氧化石墨烯
[0040]DNA甲基化檢測(cè)方法如下:
[0041 ] UDNA序列的選取:合成的寡核苷酸鏈探針DNA序列:
[0042]5’-FAM ACCCGGATAAGATGCTACTTACTCAC-3’
[0043]靶基因DNA 序列:5’ -AGCATCTTATCCGGGT-3’
[0044]2、DNA雙鏈的雜交。修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA (26個(gè)堿基)與靶基因DNA(16個(gè)堿基)，在pH為7.2的33mM tris-醋酸(IOmM Mg2+, 66mM Na+)緩沖體系中雜交，濃度為I μ M
[0045]3、取雜交后的DNA溶液25 μ L到250 μ L Hpa II的特定的緩沖溶液中，pH為7.9的 33mM 的 tris-醋酸(IOmM Mg2+, 66mM 醋酸鉀，0.lmg/mL 的 BSA)。加入 HpaII 酶 0.5 μ L，37攝氏度反應(yīng)2個(gè)小時(shí)。作為控制的DNA溶液中不加HpaII酶，分別在熒光分析儀測(cè)試之ill加入氧化石墨稀250 μ L50 μ g/mL震湯。
[0046]4、靶基因DNA的基因化過程。分為兩種方法，一種是甲基化轉(zhuǎn)移酶的甲基化過程，甲基化轉(zhuǎn)移酶和S腺甲硫酸銨提供甲基自由基與DNA作用后使得DNA甲基化。另一種方法是化學(xué)試劑造成的DNA甲基化。有毒化學(xué)試劑二甲亞砜和乙醛在雙氧水和亞鐵離子存在條件下，會(huì)反應(yīng)提供甲基自由基從而使DNA甲基化。所有甲基化過程都是控制在37攝氏度反應(yīng)4個(gè)小時(shí)?；瘜W(xué)試劑甲基化的反應(yīng)環(huán)境是氮?dú)夥諊?，ImL反應(yīng)體積，IOmMpH為7.3的PBS緩沖液(抗壞血酸10mM、EDTA-2Na3mM、FeS045mM、H20219mM)，二甲亞砜與乙醛濃度為100mM。檢測(cè)過程與步驟2相同。只是將靶基因DNA分別用標(biāo)準(zhǔn)化的甲基化DNA，以及甲基轉(zhuǎn)移酶處理的和化學(xué)試劑處理的靶基因DNA來代替。
[0047]5、證明上述過程是造成DNA甲基化的因素。在只有亞鐵離子和雙氧水沒有二甲亞砜和乙醛存在的條件下，DNA發(fā)生的是Fenton反應(yīng)，造成的是DNA的斷鏈，在靶基因DNA發(fā)生斷鏈的情況下在37攝氏度的反應(yīng)溫度下是不能和修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA雜交形成DNA雙鏈的。其他反應(yīng)條件和步驟3—樣。檢測(cè)結(jié)果與甲基化的熒光強(qiáng)度比有很明顯的下降。
[0048]實(shí)施例2采用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)的過程
[0049]DNA甲基化檢測(cè)試劑盒:
[0050]I) 25微克/毫升的氧化石墨烯；
[0051]2)限制性內(nèi)切酶HpaII ；
[0052]3)含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA ；
[0053]4)與探針DNA有一段互補(bǔ)的靶基因DNA。
[0054]1、甲基化轉(zhuǎn)移酶的DNA甲基化的檢測(cè):
[0055]在pH為7.2的33mM tris-醋酸(IOmM Mg2+,66mM Na+)緩沖體系中雜交，濃度為I μ Μ，將甲基化轉(zhuǎn)移酶造成的甲基化靶基因DNA序列與含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA進(jìn)行雜交；逐漸加入25微克/毫升的氧化石墨烯，然后加入限制性內(nèi)切酶HpaII，觀察雙鏈DNA與氧化石墨烯作用后的熒光恢復(fù)程度。
[0056]2、化學(xué)試劑造成的DNA甲基化的檢測(cè):
[0057]在pH為7.2的33mM tris-醋酸(IOmM Mg2+, 66mM Na+)緩沖體系中雜交，濃度為
Iμ Μ，將化學(xué)試劑造成的DNA甲基化靶基因DNA序列與含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA進(jìn)行雜交；逐漸加入25微克/毫升的氧化石墨烯，然后加入限制性內(nèi)切酶，觀察雙鏈DNA與氧化石墨烯作用后的熒光恢復(fù)程度。
[0058]通過雙鏈DNA在酶切后熒光恢復(fù)的強(qiáng)弱來判斷DNA的甲基化程度，加酶后，熒光恢復(fù)越強(qiáng)，甲基化程度越低，反之，甲基化程度越高。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA甲基化檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)DNA序列的選取:含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA、與探針DNA有一段互補(bǔ)的靶基因DNA，標(biāo)準(zhǔn)化甲基化靶基因DNA得到的序列1、甲基化轉(zhuǎn)移酶造成的甲基化靶基因DNA得到的序列2以及引起DNA甲基化化學(xué)試劑造成的甲基化靶基因DNA的序列3 ； 2)DNA雙鏈的雜交:探針DNA分別與靶基因DNA、序列1、序列2和序列3進(jìn)行雜交，再加入適量的氧化石墨烯，然后加入限制性內(nèi)切酶，通過觀察甲基化前后雙鏈DNA與氧化石墨烯作用后的熒光恢復(fù)程度不同來檢測(cè)是否甲基化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA甲基化檢測(cè)方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)化甲基化靶基因DNA是直接人工合成的胞嘧啶位置進(jìn)行5’ C位置甲基化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA甲基化檢測(cè)方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶為HpaI10
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA甲基化檢測(cè)方法，其特征在于，所述探針DNA中的CCGG序列中設(shè)計(jì)一個(gè)堿基的錯(cuò)配，第二個(gè)胞嘧啶換成腺嘌呤A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA甲基化檢測(cè)方法，其特征在于，所述引起DNA甲基化化學(xué)試劑為二甲亞砜和乙醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA甲基化檢測(cè)方法，其特征在于，所述胞嘧啶是CpG島區(qū)的胞嘧啶。
7.—種DNA甲基化檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下成分: . 1)25微克/毫升的氧化石墨烯； .2)限制性內(nèi)切酶HpaII； . 3)含有CCGG序列的一端修飾有熒光基團(tuán)的探針DNA； .4)與探針DNA有一段互補(bǔ)的靶基因DNA； . 5)pH為7.2的33mM tris-醋酸緩沖體系。
【文檔編號(hào)】C12Q1/44GK103509872SQ201310472714
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】衛(wèi)偉, 熊艷翔, 劉松琴 申請(qǐng)人:東南大學(xué)