一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌及其在生物基化學品合成中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌及其在生物基化學品合成中的應用，將來自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes?eutrophus）的分泌型脂酶（slipase）基因構建到原核表達載體pUC19上，然后導入敲除了fadR基因的大腸桿菌得到的重組菌，利用該菌株以甘油三酯為底物進行發(fā)酵，結果表明，在甘油三酯作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，該菌株能夠正常生長。本發(fā)明為脂類化合物的生物利用開辟了一條新的途徑。
【專利說明】一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌及其在生物基化學品合成中的應用
【技術領域】[0001]本發(fā)明涉及一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌的構建方法及其構建得到的基因工程菌，以及利用該基因工程菌在以甘油三酯為碳源發(fā)酵生產(chǎn)目標產(chǎn)物的應用。
【背景技術】
[0002]廢棄油脂是指餐飲業(yè)、食品加工業(yè)在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的不能再食用的動植物油月旨，包括煎炸廢油、泔水油和地溝油等。廢棄油脂主要指常見的植物油、動物油兩大剩余和排放的廢棄油渣和泔水，據(jù)專家計算，這些廢棄油脂的量約占食用油消費總量的20-30%。以我國年均消費食用油量為2100萬噸計,則每年產(chǎn)生廢油400-600萬噸。目前,我國廢棄食用油脂沒有得到合理利用，相反，廢棄食用油脂已成為一種環(huán)境污染物，并沖擊食品安全。
[0003]廢棄油脂的主要成分為甘油三酯，目前其主要利用技術是制備生物柴油(中國發(fā)明專利201210329282.0)，但其成本過高，限制了生物柴油工業(yè)的發(fā)展。因此，探索餐飲廢棄油高值化利用新途徑具有十分重要的意義。從資源利用及經(jīng)濟合理性的角度看，把餐飲廢棄油脂轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)物是值得探索的研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌，是將分泌型脂酶導入大腸桿菌得到的重組菌。
[0005]所述分泌型脂酶導入可以是通過載體導入宿主細胞，也可直接將分泌型脂酶整合到大腸桿菌染色體上，優(yōu)選將分泌型脂酶整合到大腸桿菌染色體上。
[0006]所述編碼分泌型脂酶的基因來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌或與該基因具有類似功能的基因。
[0007]優(yōu)選地，所述編碼分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該基因來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16 (Alcaligenes eutrophus H16)或與該基因具有類似功能的基因。
[0008]所述大腸桿菌為已知常用大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌K-12或大腸桿菌BW25113，更進一步地，優(yōu)選上述大腸桿菌為敲除了 fadR基因的大腸桿菌。
[0009]本發(fā)明還提供了一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌的構建方法，是將分泌型脂酶導入大腸桿菌。
[0010]所述構建方法，步驟如下:
[0011]I)將脂酶基因連接到原核表達載體相應的多克隆位點上；
[0012]2)將該表達載體導入大腸桿菌。
[0013]上述大腸桿菌為大腸桿菌缺失突變株，通過如下方法改造得到:(a)采用Red重組敲除大腸桿菌基因組上的fadR基因，(b)采用翻轉(zhuǎn)酶消除抗性標記。
[0014]本發(fā)明還提供了一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的應用，是將甲羥戊酸合成酶基因?qū)肷鲜鲋亟M大腸桿菌。[0015]具體而言，構建表達質(zhì)粒pACY-mva (Yang et al., 2012PL0S ONE, 7: e33509)。將表達載體pACY-mva通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入上述大腸桿菌基因工程菌，利用得到的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
[0016]本發(fā)明還提供以甘油三脂作為唯一碳源對大腸桿菌進行發(fā)酵的方法，包括(a)在適宜條件下培養(yǎng)大腸桿菌，活化菌株，(b)將大腸桿菌轉(zhuǎn)接至添加甘油三酯的M9培養(yǎng)基中，(c)加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導脂酶的表達，Cd)大腸桿菌利用外源甘油三酯生長。
[0017]-
[0018]有益效果:
[0019]I)本發(fā)明所提供的工程大腸桿菌可以高效利用甘油三酯，而甘油三酯是廢棄油脂的主要成分，因此，本發(fā)明提供的工程菌株為廢棄油脂的再利用提供了一條新的途徑；
[0020]2)大腸桿菌作為一種模式生物，其遺傳背景清楚，易于進行基因操作，因此，與常見的廢棄油脂降解菌株相比，本發(fā)明提高的大腸桿菌可以進行進一步改造，用于合成高附加值的化合物。
[0021]3)在本發(fā)明中，我們將甲羥戊酸合成的代謝途徑與甘油三酯分解的代謝途徑進行整合，實現(xiàn)了工程大腸桿菌利用甘油三酯直接合成甲羥戊酸，為廢棄油脂的高值化利用提供了一條新的出路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖lpUC-slipase表達載體圖譜。
[0023]圖2pUC-slipase載體的酶切鑒定圖；
[0024](M =DNA分子量標記，1:對照質(zhì)粒pUC19經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切，2:重組質(zhì)粒pUC-slipase 經(jīng) HindIII 和 EcoRI 雙酶切)。
[0025]圖3大腸桿菌fadR基因敲除的PCR驗證圖；
[0026](M:DNA分子量標記，1:敲除fadR后菌株BW25113 Λ fadR的PCR擴增圖譜，2:對照菌株BW25113的PCR擴增圖譜)。
[0027]圖4不同菌株利用甘油三酯發(fā)酵的情況。
[0028]圖5不同菌株利用甘油三酯的生長曲線。
[0029]圖6不同菌株發(fā)酵液中殘留甘油三酯的檢測；
[0030](A:對照菌株 BW25113，B:工程菌株 BW25113 Λ fadR/pUC-slipase)。
【具體實施方式】
[0031]實施例1:
[0032]真養(yǎng)產(chǎn)喊桿菌H16 (Alcaligenes eutrophus H16)分泌型脂酶基因(slipase, Genbank 登錄號:AM260479REG10N:965025..966251)的克隆及表達載體構建，具體過程如下:
[0033]以寡核苷酸5’-CCCAAG CTT GAT GTC TCG CGC TCC TGG CAT G-3’和5’_CCG GAATTC CTA TGG GCA CTC GGA TAC CGC-3’為引物，以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16(購自德國微生物菌種保藏中心，DSM N0.:428)的總DNA為模版，采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增出真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的分泌型脂酶基因(序列1)，并在5’端和3’端分別引入HindIII和EcoRI酶切位點，擴增體系和條件如下:
[0034]PCR擴增體系:
[0035]
【權利要求】
1.一種以甘油三酯為碳源的大腸桿菌，是將分泌型脂酶基因?qū)氪竽c桿菌得到的重組菌。
2.如權利要求1所述大腸桿菌，其特征在于，是將來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的分泌型脂酶基因?qū)肭贸?fadR基因的大腸桿菌。
3.如權利要求1所述大腸桿菌，其特征在于，所述分泌型脂酶整合到大腸桿菌染色體上，編碼分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述大腸桿菌為敲除了 fadR基因的大腸桿菌。
4.權利要求1所述大腸桿菌的構建方法，其特征在于，步驟如下: 1)將來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的分泌型脂酶基因連接到原核表達載體相應的多克隆位點上； 2)將該表達載體導入敲除了fadR基因的大腸桿菌得到重組菌。
5.如權利要求4所述方法，其特征在于，所述敲除了fadR基因的大腸桿菌為大腸桿菌缺失突變株，通過如下方法改造得到:(a)采用Red重組敲除大腸桿菌基因組上的fadR基因，(b)采用翻轉(zhuǎn)酶消除抗性標記。
6.如權利要求4所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Hl6的總DNA為模版,擴增出真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的分泌型脂酶基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，將上述PCR產(chǎn)物及載體pUC19酶切后的產(chǎn)物進行電泳回收，然后進行連接反應構建重組質(zhì)粒pUC-slipase ；· 2)利用Red重組系統(tǒng)對fadR基因(GeneID:948652)進行敲除，根據(jù)基因序列設計帶有50bp的fadR基因同源臂的引物，以pKD4質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增帶有卡那霉素抗性的重組片段，擴增產(chǎn)物采用DpnI內(nèi)切酶消化后，瓊脂糖凝膠電泳回收濃縮，采用電擊轉(zhuǎn)化法將濃縮后的擴增片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25113感受態(tài)細胞，電擊后的細胞涂布含卡那霉素的選擇性平板，篩選陽性克隆，將用于消除卡那霉素抗性的質(zhì)粒PCP20熱擊轉(zhuǎn)化陽性菌落的感受態(tài)細胞，誘導翻轉(zhuǎn)酶的表達，消除卡那抗性片段，得到工程菌株BW25113 Δ fadR ； 3)提取pUC-slipase質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pUC_slipase轉(zhuǎn)化步驟2)構建的工程菌株BW25113 Δ fadR的感受態(tài)細胞，制得最終工程菌株BW25113 Δ fadR/pUC-slipase。
7.權利要求1所述大腸桿菌利用甘油三酯為碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學品。
8.一種利用權利要求1所述大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸的方法，其特征在于，步驟如下: 1)敲除大腸桿菌fadR基因； 2)將來源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的分泌型脂酶基因?qū)肭贸薴adR基因的大腸桿菌； 3 )將羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因?qū)氩襟E2)構建的重組大腸桿菌； 4)步驟4)構建的重組大腸桿菌利用甘油三酯發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
9.如權利要求8所述方法，其特征在于，編碼分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
10.如權利要求8所述方法，其特征在于，具體步驟如下: I)以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Hl6的總DNA為模版,擴增出真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的分泌型脂酶基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，將上述PCR產(chǎn)物及載體pUC19酶切后的產(chǎn)物進行電泳回收，然后進行連接反應構建重組質(zhì)粒pUC-slipase ； 2)利用Red重組系統(tǒng)對fadR基因(GeneID:948652)進行敲除，根據(jù)基因序列設計帶有50bp的fadR基因同源臂的引物，以pKD4質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增帶有卡那霉素抗性的重組片段，擴增產(chǎn)物采用DpnI內(nèi)切酶消化后，瓊脂糖凝膠電泳回收濃縮，采用電擊轉(zhuǎn)化法將濃縮后的擴增片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25113感受態(tài)細胞，電擊后的細胞涂布含卡那霉素的選擇性平板，篩選陽性克隆，將用于消除卡那霉素抗性的質(zhì)粒PCP20熱擊轉(zhuǎn)化陽性菌落的感受態(tài)細胞，誘導翻轉(zhuǎn)酶的表達，消除卡那抗性片段，得到工程菌株BW25113 Δ fadR ； 3)提取pUC-slipase質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pUC-slipase轉(zhuǎn)化步驟2)構建的工程菌株BW25113AfadR的感受態(tài)細胞，制得最終工程菌株BW25113 Λ fadR/pUC-slipase ； 4)根據(jù)糞腸球菌羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因序列，構建表達質(zhì)粒pACY-mva,將pACY_mva通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25113AfadR/pUC-slipase來構建利用甘油三酯為底物產(chǎn)甲羥戊酸的工程菌，重組菌利用甘油三酯發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊 酸。
【文檔編號】C12N1/21GK103571786SQ201310474480
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權日:2013年10月12日
【發(fā)明者】咸漠, 曹玉錦, 張汝兵, 曹志峰 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所