專利名稱：一種棒桿菌屬菌種以及發(fā)酵生產(chǎn)l－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棒桿菌屬菌種以及L-賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體涉及一種通過微生物發(fā)酵的生產(chǎn)方法。
目前，已有許多專利和文獻(xiàn)公開了采用微生物發(fā)酵法制造生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，如日本專利申請55213/1967號公告所公開的技術(shù)，其利用的是一種S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(稱之AEC)抗性細(xì)菌；如日本專利申請36888/1974號公告利用的是一種具有AEC抗性并L-亮氨酸、L-高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型的變種；如日本專利申請19235/1981號公告利用的是一種γ-甲基賴氨酸抗性變種。
上述公開的技術(shù)均存在著一個十分明顯的缺陷，其生產(chǎn)成本較高，難以規(guī)模化生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的
發(fā)明者對棒桿菌屬并具有生產(chǎn)L-賴氨酸能力的細(xì)菌進(jìn)行變異處理，然后從得到的變種中選擇單氟醋酸(簡稱MF)抗性，α-噻唑-DL-丙氨酸(簡稱TA)抗性菌種，便可大大提高L-賴氨酸的生產(chǎn)率。
使用的微生物本發(fā)明用于生產(chǎn)L-賴氨酸的微生物是一種屬于棒桿菌屬的菌種，棒桿菌(拉丁文屬名Corynebacterium glutamicum)[SNGBL 8(FH128菌株)]即為具有這種能力的菌種，以下簡稱SNGBL 8，該菌種已于2002年8月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCCNo.0785。
本發(fā)明者對谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)野生菌株進(jìn)行變異處理，在得到的變種中選擇具有高絲氨酸缺陷型，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性菌種(A111)，以A111菌種為親本再變異處理，從變種中選擇單氟醋酸(簡稱MF)、α-噻唑-DL-丙氨酸(簡稱TA)抗性菌株SNGBL8(FH128)，即上述的SNGBL 8菌株。
上述的菌種具有如下的性質(zhì)1.形態(tài)特征用普通光學(xué)顯微鏡觀察在肉湯斜面上培養(yǎng)12-24hr的染色培養(yǎng)物，細(xì)胞通常為短桿狀，兩端鈍圓，不分枝，細(xì)胞呈單個、成對及“V”字形排列，細(xì)胞大小0.3-0.4×0.5-0.8μm，革蘭氏染色細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，在顯微鏡下懸滴培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)有運(yùn)動能力，不形成芽孢，抗酸性等全為負(fù)反應(yīng)。
2.在各種培養(yǎng)基上的特征
a.普通肉湯瓊脂斜面中間劃直線培養(yǎng)，呈中度生長，菌苔線狀，24小時呈淺黃色，表面光滑、濕潤、無粘性。
b.普通肉湯瓊脂平板單菌落圓形，培養(yǎng)24-30小時，菌落為淡黃色，直徑約1mm，48小時約2mm，表面濕潤、光滑并有光澤，邊緣整齊，無粘性。
c.普通肉湯瓊脂穿刺表面發(fā)育良好，沿穿刺線生長弱，并且不向四周擴(kuò)散。
3.生理生化特征a.對氧要求表現(xiàn)為好氧及兼性厭氧。
b.對溫度關(guān)系菌株的生長溫度為20-35℃，26-33℃培養(yǎng)生長良好。
菌株在45、55、65、70、80℃條件下處理10分鐘，迅速冷卻后置于32℃培養(yǎng)48小時，發(fā)現(xiàn)65℃熱處理10分鐘菌體已全部死亡。
c.PH值的影響菌體在pH5-9均能生長，在pH6-7.5時生長最好。
d.不水解油脂，不水解淀粉，不分解纖維素e.不利用液體石蠟油為碳源。
f.V.P.試驗(yàn)，陰性反應(yīng)。
g.M.R.試驗(yàn)，陽性反應(yīng)。
h.H2S試驗(yàn)， 陽性反應(yīng)。
i.NO2試驗(yàn)， 陽性反應(yīng)。
j.必需生長因子生物素生物素濃度在30μg/L以下時，菌體生長量與生物素濃度呈正比。
L-高絲氨酸(或L-蘇氨酸+L-蛋氨酸)高絲氨酸(或L-蘇氨酸+L-蛋氨酸)濃度在350μg/ml以下時，菌體生長與高絲氨酸的添加濃度呈正比。
k.對氨基酸結(jié)構(gòu)類似物的耐性在補(bǔ)充基本培養(yǎng)基C中分別添加以下氨基酸結(jié)構(gòu)類似物(100μg/L)，菌體生長良好。
S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC) +α-噻唑-DL-丙氨酸(TA) +單氟乙酸(MF)+4.碳源利用葡萄糖 +蔗糖 +果糖 +麥芽糖 +半乳糖 -甘露糖 +木糖 +海藻糖 -乳糖 -L-阿拉伯糖 -淀粉 -甘露糖醇 -丙三醇 -山梨糖醇 -根據(jù)文獻(xiàn)“伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊”，(Brrgey’s Manual of SystematicBacteriology)提供的鑒定方法和上述的試驗(yàn)結(jié)果表明，上述菌種屬于棒桿菌屬的菌種，但又與原棒桿菌屬的菌種有明顯的不同，其主要不同之處在于增加必需生長因子高絲氨酸；在含有必需生長因子的基本培養(yǎng)基中添加一定濃度的AEC、MF、TA，菌體仍生長良好。
本發(fā)明的菌種是這樣獲得的采用的誘變劑為N-硝基-N’-甲基-N-亞硝基胍(NTG)；采用的培養(yǎng)基為培養(yǎng)基A(完全培養(yǎng)基)蛋白胨 1％；牛肉膏 1％；NaCl 0.5％。pH7.0(固體培養(yǎng)基加2％瓊脂粉)；培養(yǎng)基B(基本培養(yǎng)基)葡萄糖 1％；硫酸銨 0.2％；K2HPO40.1％；KH2PO40.1％；MgSO4·7H2O 0.04％；生物素50μg/L；B1·HCl 100μg/L；MnSO42mg/L；FeSO42mg/L。pH7.0(固體培養(yǎng)基加1.6％瓊脂粉)。
培養(yǎng)基C(補(bǔ)充基本培養(yǎng)基)在培養(yǎng)基B中添加高絲氨酸150μg/ml(或L-蘇氨酸、L-蛋氨酸各250μg/ml)；誘變方法將親本菌株新鮮斜面菌苔細(xì)胞一環(huán)移于20ml液體培養(yǎng)基A中，于30℃培養(yǎng)過夜，離心。菌體洗滌后用pH6.0緩沖液制成108個細(xì)菌濃度的懸浮液，用300μg/ml的NTG在30℃處理30～60分鐘。處理后的菌液經(jīng)離心、細(xì)胞洗滌后適當(dāng)稀釋，取0.1ml涂布于含有親本菌株不能生長的濃度的TA、MF物質(zhì)的固體培養(yǎng)基C上，于30℃培養(yǎng)5～7日。收集生長的菌落。MF濃度為300～600μg/ml；TA濃度為50～150μg/ml。
將親本菌株和變種分別接種于各含不同濃度MF、TA的液體培養(yǎng)基C中，32℃培養(yǎng)24小時。觀察其生長程度。結(jié)果如下化學(xué)物質(zhì)濃度(μg/ml) 菌株相對生長度A111 SNGBL8MF 0 10010050 17.2 1001000 1005000 1001000 0 98TA 0 10010050 0 1001000 1005000 1001000 0 100可采用常規(guī)的發(fā)酵方法，利用上述菌種產(chǎn)生L-賴氨酸。
作為培養(yǎng)基，可用含有不同碳源、氮源、無機(jī)離子等普通培養(yǎng)基。
作為碳源如葡萄糖、淀粉類(包括大米、玉米、木薯、甘薯等)水解物、廢糖蜜等。
使用氮源包括氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸氨等、各種其他無機(jī)酸銨鹽、尿素和其他含氮化合物如玉米漿、毛發(fā)(人發(fā)、家畜發(fā)、家禽羽毛等)水解物、大豆粉(豆粕)水解物、酪蛋白水解物等。
根據(jù)需要適當(dāng)添加無機(jī)離子如磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉等化合物。
如果需要，培養(yǎng)基中可以含有適量的對所使用的微生物生長特別需要的營養(yǎng)物。一般情況，這些營養(yǎng)物存在于上述的天然氮源中。
培養(yǎng)條件可以是常規(guī)的，最好在好氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)。例如，用振蕩或通氣深層培養(yǎng)，溫度范圍一般在25～35℃，優(yōu)選在28～33℃。發(fā)酵過程中pH一般在5.6～8.5范圍，優(yōu)選在6.5～7.5。對pH的調(diào)節(jié)，可以采用無機(jī)或有機(jī)的酸性或堿性物質(zhì)，以及氨、脲、碳酸鈣等。
發(fā)酵完成后，可以用常規(guī)方法從發(fā)酵液中收集L-賴氨酸。
培養(yǎng)結(jié)束后，采用有機(jī)或無機(jī)絮凝劑絮凝、離心機(jī)離心或膜分離等方法進(jìn)行發(fā)酵液預(yù)處理，除去發(fā)酵液中細(xì)胞體和其他蛋白質(zhì)。賴氨酸可以從上述清液中用離子交換、等電點(diǎn)法、濃縮結(jié)晶等方法回收。
采用本發(fā)明的菌種生產(chǎn)賴氨酸，可使賴氨酸的產(chǎn)率、對糖轉(zhuǎn)化率有較大幅度提高，從而顯著降低賴氨酸的生產(chǎn)成本。
將該培養(yǎng)基于120℃滅菌15分鐘。分別從培養(yǎng)基A斜面上取一環(huán)已預(yù)先培養(yǎng)24小時的親本菌株和SNGBL 8菌接入上述培養(yǎng)基中，在32℃振蕩培養(yǎng)68小時。結(jié)果如下表。使用菌株特性 產(chǎn)量(g/L)*對糖轉(zhuǎn)化率(％)2305 野生型 1.4 0.8A111 HS-、AECr58.1 33.2SNGBL8HS-、AECr、MFr、82.6 47.2TAr*L-賴氨酸量以賴氨酸鹽酸鹽計實(shí)施例2玉米淀粉經(jīng)雙酶法水解，制成約25％水解糖液。部分水解糖液通過減壓薄膜濃縮裝置濃縮成55％糖液。
在二個體積為5L的三角瓶中，分別裝入0.8L培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有30g/L玉米淀粉水解糖液、10g/L硫酸銨、3g/L尿素、1g/L磷酸二氫鉀、1g/L磷酸氫二鉀、0.4g/L硫酸鎂、0.3g/L(以含氮量計)豆粕水解液、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.03mg/L生物素。將該培養(yǎng)基于120℃滅菌15分鐘。分別從培養(yǎng)基A斜面上取一環(huán)已預(yù)先培養(yǎng)24小時的親本菌株和SNGBL8菌接入上述培養(yǎng)基中，然后于32℃培養(yǎng)14小時。上述步驟用于種子培養(yǎng)。
在二只體積為16L的小型發(fā)酵罐中，每罐分別裝入7.0L培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有140g/L玉米淀粉水解糖液、20g/L硫酸銨、1g/L磷酸二氫鉀、1g/L磷酸氫二鉀、0.5g/L硫酸鎂、5g/L玉米漿、0.2g/L(以含氮量計)豆粕水解液、0.005g/L消泡劑，于120℃滅菌15分鐘。冷卻至32℃后，各發(fā)酵罐中加入上述的種子培養(yǎng)液0.8L，在下列條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度32℃，空氣流速為1.0VVM，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分。
發(fā)酵過程中以氨水調(diào)節(jié)pH，使pH控制在7.5。
當(dāng)培養(yǎng)液中糖濃度降至15g/L，流加55g/L玉米淀粉水解糖液(連續(xù)或間歇)，以使培養(yǎng)液中糖濃度保持在15g/L。培養(yǎng)時間65小時，結(jié)果如下表菌株 L-賴氨酸產(chǎn)量(g/L) 對糖轉(zhuǎn)化率(％)A111 85.6 36.2SNGBL8 128.2 44.8
二罐發(fā)酵液分別進(jìn)行賴氨酸回收。
在發(fā)酵液中添加聚丙烯酰胺使菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)沉淀，過濾。上清液用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂吸附L-賴氨酸，然后用氨水洗脫。洗脫液濃縮結(jié)晶、離心，得濕晶體，然后分別于65℃干燥得到飼料級L-賴氨酸鹽酸鹽856.4克和1282.6克。
權(quán)利要求
1.一種棒桿菌CGMCCNo.0785。
2.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，該方法包括先培養(yǎng)棒桿菌CGMCCNo.0785，然后在培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，然后從發(fā)酵液中收集L-賴氨酸，溫度為25～35℃，pH為5.6～8.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于溫度為28～33℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于pH為6.5～7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的方法，其特征在于培養(yǎng)結(jié)束后，先采用有機(jī)或無機(jī)絮凝劑絮凝、離心機(jī)離心或膜分離方法進(jìn)行發(fā)酵液預(yù)處理，除去發(fā)酵液中細(xì)胞體和其他蛋白質(zhì)，然后清液中用離子交換、等電點(diǎn)法或濃縮結(jié)晶方法收集賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棒桿菌CGMCCNo.0785以及采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)L－賴氨酸的方法。該方法包括先培養(yǎng)棒桿菌CGMCCNo.0785，然后在培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，然后從發(fā)酵液中收集L－賴氨酸，溫度為25～35℃，pH為5.6～8.5。采用本發(fā)明的菌種生產(chǎn)賴氨酸，可使賴氨酸的產(chǎn)率、對糖轉(zhuǎn)化率有較大幅度提高，從而顯著降低賴氨酸的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P13/00GK1415742SQ0213768
公開日2003年5月7日 申請日期2002年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者富英華, 沈永喜, 勞含章 申請人:上海新立工業(yè)微生物科技有限公司, 錢志良