羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明以羊布魯氏菌M5基因組為模板，PCR得到znuA基因的上、下游同源臂，并將其連接，得到片段ΔznuA；將片段ΔznuA克隆至載體pRE112上，得到重組質(zhì)粒pRE-ΔznuA；將該質(zhì)粒導(dǎo)入羊布魯氏菌M5-Δbp26細(xì)胞中，分別通過氯霉素和蔗糖選擇培養(yǎng)基篩選，得到同源重組雙交換子，為重組菌株M5-Δbp26-ΔznuA。該菌株較M5親本菌株，生長特性一致，遺傳穩(wěn)定使其不易返祖，毒力小且免疫效果保持良好，并因bp26基因缺失標(biāo)記可應(yīng)用于區(qū)分檢測自然感染或人工免疫。因此，該菌株可作為一種效果更佳的標(biāo)記疫苗應(yīng)用于臨床。
【專利說明】羊布魯氏菌重組菌株M5- A bp26- A znuA及制備方法與應(yīng)
用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于重組細(xì)菌疫苗領(lǐng)域，特別涉及一株羊布魯氏菌(Brucellamelitensis)重組菌株M5- A bp26- A znuA及制備方法與應(yīng)用。該菌株是在羊型5號弱毒菌株(M5)缺失其bp26基因的基礎(chǔ)上缺失znuA基因得到。
【背景技術(shù)】
[0002]布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患傳染病，由于布魯菌胞內(nèi)寄生的特點(diǎn)，防控該病一直是以弱毒疫苗免疫預(yù)防為主。目前用于布魯菌病防控的減毒菌株主要有國外的牛型19號(S19)弱毒菌株和羊型ReV.1弱毒菌株，國內(nèi)研制的羊型5號(M5)弱毒菌株和豬型2號(S2)弱毒菌株。這些經(jīng)典的減毒疫苗株在預(yù)防和控制布魯菌病的蔓延和擴(kuò)散中起到了重要作用。弱毒苗雖造價(jià)便宜，免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間長，免疫保護(hù)效率高，但同樣存在缺陷，致使人們不敢、不愿也不能對其廣泛應(yīng)用。其主要原因一是弱毒苗在接種后無法區(qū)別自然感染和人工免疫，廣泛應(yīng)用將對該病流行病學(xué)調(diào)查、探查疫源及疾病控制和治療產(chǎn)生很大的障礙；二是弱毒苗毒性相對較大，返祖現(xiàn)象嚴(yán)重，會對人與動物機(jī)體造成傷害，甚至發(fā)病。所以研制一種能在臨床上區(qū)分是自然感染還是人工免疫，免疫保護(hù)性能好，毒力弱、安全性能高的布魯氏菌病弱毒疫苗具有重要的實(shí)踐意義。
[0003]此外，布魯氏菌的生存和增殖必須依賴于環(huán)境或宿主之中的多種過渡金屬離子。尤其鋅離子，是布魯氏菌結(jié)構(gòu)所必須的金屬離子，是菌體內(nèi)催化反應(yīng)的輔助因子，因此，獲得適當(dāng)程度的鋅對細(xì)菌來說非常重要。但是由于宿主體內(nèi)游離的鋅離子含量非常少，為了攝取足夠的鋅保證細(xì)菌自身的新陳代謝，并在宿主體內(nèi)大量增殖，各種細(xì)菌如布魯氏菌進(jìn)化出幾種類型的蛋白參與攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子，這些轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子的蛋白操縱系統(tǒng)被命名為ZnuABC，此系統(tǒng)包括ZnuA、znuB、znuC基因編碼的多種蛋白，其中ZnuA是一種細(xì)胞周質(zhì)-溶質(zhì)結(jié)合蛋白，目前對該基因的機(jī)理研究仍較少，僅推測該ZnuA蛋白與布魯菌毒力因子相關(guān)。其次，BP26蛋白是一種具有強(qiáng)免疫原性的周質(zhì)蛋白，且?guī)缀醮嬖谟谒胁剪斁曛校摰鞍拙哂辛己玫拿庖呋钚?，自然感染或人工免疫后都可以在血清中檢測出針對此抗原的特異性抗體，因此常用來作為血清學(xué)檢驗(yàn)的靶蛋白。
[0004]為獲得一株既能減低毒力、提高安全性，又能維持疫苗的高效免疫原性，且能在臨床應(yīng)用中可進(jìn)行區(qū)分檢測診斷的布魯氏菌病弱毒疫苗，我們將表達(dá)BP26和ZnuA蛋白的基因分別敲除，以獲得一株羊布魯氏菌(Brucella melitensis)重組菌株M5- A bp26_ A znuA及制備方法和應(yīng)用，為制備更為安全有效的新型基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究布魯菌外膜蛋白BP26與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZnuABC的協(xié)同作用提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有疫苗的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株羊布魯氏菌重組菌株M5- A bp26- A znuA的制備方法。[0006]本發(fā)明另一目的在于提供通過上述制備方法得到的羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-AznuA。
[0007]本發(fā)明再一目的在于提供上述羊布魯氏菌重組菌株M5- A bp26- A znuA在制備用于預(yù)防和/或治療布魯氏菌病的疫苗中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn):
[0009]一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26_ AznuA的制備方法，包括以下步驟:
[0010](I)自殺性同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建 [0011]①以羊布魯氏菌(Brucella melitensis) M5基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，使用的弓丨物為Pl和P2時(shí)，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物為P3和P4時(shí)，得到znuA基因的下游同源臂；
[0012]Pl:5' -GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC~3/ (橫線部分為 KpnI 酶切位點(diǎn))；
[0013]P2:5' -TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3'；
[0014]P3:5' -GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3'；
[0015]P4:5' -AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3'(橫線部分為 Sacl 酶切位點(diǎn))；
[0016]②利用Overlap PCR的方法，以步驟①中制備的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂為模板，Pl和P4為引物對，得到用于同源重組的目的片段AznuA ；
[0017]③用KpnI和SacI分別對自殺性質(zhì)粒載體pRE112和用于同源重組的目的片段A znuA進(jìn)行雙酶切，純化；將純化回收的片段A znuA和載體片段pRE112連接，得到自殺性同源重組質(zhì)粒pRE- A znuA ；
[0018](2)羊布魯氏菌重組菌株的構(gòu)建及篩選
[0019]①將自殺性同源重組質(zhì)粒pRE-AznuA導(dǎo)入羊布魯氏菌M5_Abp26的感受態(tài)細(xì)胞中；接著涂布于含有氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)平板上，在氯霉素的選擇壓力下，得到同源重組單交換子JfPCR鑒定正確的同源重組單交換子在胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)中培養(yǎng)，松弛質(zhì)?？剐?；
[0020]②接著將松弛質(zhì)?？剐院蟮耐粗亟M單交換子涂布于TSA-YE-Sucrose選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，利用自殺性同源重組質(zhì)粒pRE- A znuA中sacB基因?qū)φ崽堑拿舾行?，對自殺質(zhì)粒進(jìn)行消除，利用引物Pl和P4對TSA-YE-Sucrose選擇培養(yǎng)基上生長的菌落進(jìn)行PCR篩選，獲得同源重組雙交換子，即得到羊布魯氏菌重組菌株M5- A bp26- A znuA ；
[0021]步驟(1)①中所述的PCR的條件優(yōu)選為94°C 2min預(yù)變性；98°C 10s,56°C 30s、68°C 1.5min, 30 個循環(huán)；68°C 5 ~IOmin 終延伸；
[0022]步驟(1)②中所述的Overlap PCR的條件優(yōu)選為94°C 2min預(yù)變性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min,30 個循環(huán)；68°C 5 ~IOmin 終延伸；
[0023]步驟(2)①中所述的導(dǎo)入的方式優(yōu)選為通過電轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入；
[0024]所述的電轉(zhuǎn)化的條件優(yōu)選為1mm電極杯，1.8kv，400 Q ；
[0025]步驟(2)①中所述的氯霉素在所述的胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基中的終濃度優(yōu)選為5 ii g/mL ;
[0026]步驟(2)①中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為37°C、200r/min搖床上培養(yǎng)18h ；
[0027]步驟(2)①中所述的PCR鑒定為通過引物Pl和P4進(jìn)行鑒定；
[0028]步驟(2)①中所述的PCR鑒定的條件優(yōu)選如下:94°C 2min預(yù)變性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min，30 個循環(huán)；68°C 5 ~IOmin ；
[0029]步驟(2)②中所述的TSA-YE-SuCTose選擇培養(yǎng)基的組成如下:胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE) +終濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 7%的蔗糖；
[0030]所述的TSA-YE-SuCTose選擇培養(yǎng)基優(yōu)選通過如下步驟制備得到:將配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)滅菌后，降溫至60~70°C時(shí)加入經(jīng)過濾除菌的濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 50%的蔗糖，使得蔗糖的終濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 7%，混合均勻后分裝入滅菌平皿內(nèi)，凝固后4°C保存。
[0031]步驟(2)②中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為37°C培養(yǎng)48~96h ；
[0032]一株羊布魯氏菌重組菌株M5- Δ bp26- Δ znuA,通過上述制備方法得到。
[0033]上述羊布魯氏菌重組菌株M5-Λ bp26_ AznuA在制備用于預(yù)防和/或治療布魯氏菌病的疫苗中的應(yīng)用。
[0034]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0035](I)本發(fā)明提供的羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26_AznuA由于bp26基因的缺失可以作為一種標(biāo)記疫苗株用于臨床，從而有效的區(qū)分自然感染與人工免疫。由于znuA基因的缺失使得該株較親本株M5毒力降低、安全性提高；遺傳穩(wěn)定不易返祖；同時(shí)，還能保持較好的免疫原性。
[0036](2)本發(fā)明提供的羊布魯氏菌重組菌株M5-Λ bp26_ AznuA這種雙缺失疫苗株較單缺失株M5- Δ bp26和M5- Δ znuA也均有明顯的毒力減弱、安全性高，保持良好免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。
[0037](3)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-AznuA具有良好的遺傳穩(wěn)定性，其生長特性和免疫保護(hù)效果與羊布魯氏菌M5相比無明顯差異。
[0038](4)本發(fā)明提供的羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-AznuA為制備更為安全有效的新型基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究布魯菌外膜蛋白BP26與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZnuA的協(xié)同作用提供參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1是znuA基因的上、下游同源臂基因片段及其上、下游同源臂基因片段OverlapPCR得到的基因片段AznuA的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中:泳道M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為znuA的上游同源臂基因片段，泳道2為znuA的下游同源臂基因片段，泳道3為znuA基因的上、下游同源臂基因片段相連得到的基因片段AznuA。
[0040]圖2是pRE- Δ znuA酶切驗(yàn)證結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中:泳道M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為未經(jīng)酶切的pRE-AznuA質(zhì)粒，泳道2為使用KpnI和SacI雙酶切P RE- Δ znuA質(zhì)粒后得到的片段。
[0041]圖3是羊布魯氏菌基因缺失株M5-Abp26-AznuA同源重組單交換子篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中:泳道M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為pRE- Δ znuA陽性對照，泳道2為M5陽性對照，泳道3~8為M5- Λ bp26_ Δ znuA株同源重組單交換子；泳道9為空白對照。
[0042]圖4是羊布魯氏菌基因缺失株M5-Abp26-AznuA同源重組雙交換子篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中:泳道M為·DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為pRE- Δ znuA陽性對照，泳道2為M5陽性對照，泳道3~20為同源重組雙交換子，泳道21為空白對照。[0043]圖5是羊布魯氏菌重組菌株M5-Δ bp26_ Δ znuA遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證結(jié)果圖，其中:泳道M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泳道I為pRE- Δ znuA陽性對照，泳道2為M5陽性對照，泳道3 ~12 分別為 M5-Abp26-AznuA 第 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 代菌落，泳道 13 為空白對照。
[0044]圖6是羊布魯氏菌親本株M5和重組菌株M5- Δ bp26_ Δ znuA生長曲線的測定結(jié)果圖。
[0045]圖7是羊布魯氏菌親本株M5、重組菌株M5_Abp26、M5- Δ znuA和M5- Δ bp26- Δ znuA分別免疫小鼠后對小鼠脾臟重量影響的結(jié)果圖。
[0046]圖8是羊布魯氏菌親本株M5、重組菌株M5_Abp26、M5- Δ znuA和M5- Δ bp26- Δ znuA分別免疫小鼠后對小鼠脾臟菌數(shù)量檢測的結(jié)果圖。
[0047]圖9是羊布魯氏菌重組菌株M5-Λ bp26_ AznuA免疫小鼠后小鼠血清特異性抗體的ELISA檢測結(jié)果圖。
[0048]圖10是羊布魯氏菌親本株M5、重組菌株M5_Abp26、M5_ AznuA和M5-Abp26-AznuA免疫小鼠6周后小鼠血清特異性抗體的間接ELISA檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0050]實(shí)施例中所涉及的材料:
[0051]①KOD FX DNA Polymerase高保真酶購自Τ0Υ0Β0公司；限制性內(nèi)切酶Kpn 1、Sac
1、T4DNA連接酶、DNA Marker等購于Ta`KaRa公司；膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；QIAamp DNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、瓊脂粉購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母提取物(Yeast Extract，簡稱YE)購自O(shè)XOID公司。
[0052]胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)通過如下步驟制備得到:胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 30g、YE2g，溶解于1000mL三蒸水中，加熱攪拌均勻，121 °C高壓滅菌15min，冷卻后置于4°C保存。
[0053]胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)通過如下步驟制備得到:胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)30g、YE2g，溶解于1000mL三蒸水中，加入瓊脂粉至終濃度為1.5% (w/v)，加熱攪拌均勻后，121°C高壓滅菌15min，待冷卻至60°C左右分裝入滅菌平皿內(nèi)，凝固后4°C保存。
[0054]含氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)通過如下步驟制備得到:將配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)滅菌后，降溫至40~50°C時(shí)加入氯霉素(終濃度為5μ g/mL)，混合均勻后分裝入滅菌平皿內(nèi)，凝固后4°C保存。
[0055]TSA-YE-Sucrose選擇培養(yǎng)基通過如下步驟制備得到:將配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基(TSA-YE)滅菌后，降溫至60~70°C時(shí)加入經(jīng)過濾除菌的濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 50%的蔗糖，使得蔗糖的終濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 7%，混合均勻后分裝入滅菌平皿內(nèi)，凝固后4 °C保存。
[0056]②羊布魯氏菌(Brucella melitensis)M5株購于新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。
[0057]③以下生物材料均已在文獻(xiàn)“布魯氏菌bp26基因缺失株的構(gòu)建，中國獸醫(yī)科學(xué)，2011,41 (03):280-286”中公開:羊布魯氏菌基因缺失株M5-Abp26、大腸桿菌DH5a Apir(基因型為 supE44 Δ lacU169 ( Φ 801acZ Δ M15) hsdR17recAlendAlgyrA96th1-relAl λ pi )、及 pRE112 自殺質(zhì)粒(cat, sacB, oriTep4, oriV腿，MCS)。
[0058]④以下方法均已在專利申請“牛布魯氏菌重組菌株S19-Abp26_BL及其制備方法與應(yīng)用，201310153715.6”中公開:BL融合蛋白的制備方法。
[0059]實(shí)施例1
[0060](I)自殺性同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0061]①布魯氏菌基因組DNA的提取:按照QIAamp DNA抽提試劑盒說明提取羊布魯氏菌M5株基因組DNA。
[0062]②引物的設(shè)計(jì)與合成:參考Genbank中羊布魯氏菌(CP001489.1)的基因序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求設(shè)計(jì)引物，如表1所示。其中引物Pl和P2用于擴(kuò)增znuA基因的上游同源臂、引物P3和P4用于擴(kuò)增znuA基因的下游同源臂，并分別于引物Pl和P4的5'端引入KpnI和SacI的酶切位點(diǎn)。上述引物均由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。
[0063]表1用于擴(kuò)增不同基因片段的PCR引物序列
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-AznuA的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)自殺性同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ①以羊布魯氏菌(Brucellame I i tens i s ) M5基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，使用的引物為Pl和P2時(shí)，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物為P3和P4時(shí)，得到znuA基因的下游同源臂；
Pl:5' -GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3'；
P2:5' -TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3'；
P3:5' -GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3'；
P4:5' -AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3'； ②利用OverlapPCR的方法，以步驟①中制備的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂為模板，Pl和P4為引物對，得到用于同源重組的目的片段AznuA ； ③用KpnI和SacI分別對自殺性質(zhì)粒載體pRE112和用于同源重組的目的片段AznuA進(jìn)行雙酶切，純化；將純化回收的片段A znuA和載體片段PRE112連接，得到自殺性同源重組質(zhì)粒 pRE- A znuA ； (2)羊布魯氏菌重組菌株的構(gòu)建及篩選 ①將自殺性同源重組質(zhì)粒pRE-A znuA導(dǎo)入羊布魯氏菌M5- A bp26的感受態(tài)細(xì)胞中；接著涂布于含有氯霉素的TSA-YE平板上，在氯霉素的選擇壓力下，得到同源重組單交換子；將PCR鑒定正確的同源重組單交換`子在TSB-YE中培養(yǎng)，松弛質(zhì)?？剐裕? ②接著將松弛質(zhì)?？剐院蟮耐粗亟M單交換子涂布于TSA-YE-Sucrose選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，利用自殺性同源重組質(zhì)粒pRE- A znuA中sacB基因?qū)φ崽堑拿舾行裕瑢ψ詺①|(zhì)粒進(jìn)行消除，利用引物Pl和P4對TSA-YE-Sucrose選擇培養(yǎng)基上生長的菌落進(jìn)行PCR篩選，獲得同源重組雙交換子，即得到羊布魯氏菌重組菌株M5- A bp26- A znuA ； 所述的TSA-YE-Sucrose選擇培養(yǎng)基的組成如下:胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基+終濃度為質(zhì)量體積比7%的蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-AznuA的制備方法，其特征在于:步驟(1)①中所述的 PCR 的條件為 94°C 2min ；98°C 10s、56°C 30s,68°C 1.5min，30個循環(huán)；68°C 5~IOmin終延伸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-A bp26- A znuA的制備方法，其特征在于:步驟(1)②中所述的Overlap PCR的條件為94°C 2min預(yù)變性；98°C 10s,56°C 30s、68°C 3min,30 個循環(huán)；68°C 5 ~IOmin 終延伸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-A bp26- A znuA的制備方法，其特征在于:步驟(2)①中所述的導(dǎo)入的方式為通過電轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-A bp26- A znuA的制備方法，其特征在于:所述的電轉(zhuǎn)化的條件為1mm電極杯，1.8kv，400Q。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-A bp26- A znuA的制備方法，其特征在于:步驟(2)①中所述的氯霉素在所述的TSA-YE培養(yǎng)基中的終濃度為5 u g/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-A bp26- A znuA的制備方法，其特征在于:步驟(2)①中所述的培養(yǎng)的條件為37°C、200r/min搖床上培養(yǎng)36~48h ；步驟(2)②中所述的培養(yǎng)的條件為37°C培養(yǎng)48~96h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-A bp26- A znuA的制備方法，其特征在于:步驟(2)①中所述的PCR鑒定為通過引物Pl和P4進(jìn)行鑒定； 所述的PCR鑒定的條件如下:94°C 2min預(yù)變性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min，30個循環(huán)；68°C 5 ~lOmin。
9.一株羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-A znuA,其特征在于:通過上述制備方法得到。
10.權(quán)利要求9所述的羊布魯氏菌重組菌株M5-Abp26-AznuA在制備用于預(yù)防和/或治療布魯氏菌病的疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/74GK103667334SQ201310542901
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】陳金頂, 馬思思, 劉翠翠, 吳云燕, 王佳瑩, 趙明秋 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)