一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量rt-pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，包括：（1）陽性標(biāo)準(zhǔn)品；（2）陰性對(duì)照；（3）RT-PCR反應(yīng)液；（4）反應(yīng)酶混合液；（5）探針溶液；（6）無RNase水。本試劑盒對(duì)甘蔗條紋花葉病毒的檢測(cè)有高度的特異性，與其他植物病毒無交叉反應(yīng)；檢測(cè)的靈敏度達(dá)102拷貝，可直接用于甘蔗植株、脫毒種苗等樣本的定量檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒；利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果可靠穩(wěn)定。
【專利說明】一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)植物病毒的試劑盒，具體涉及一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，屬于植物病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】[0002]甘鹿條紋花葉病毒streakmosaic virus, SCSMV)屬于馬鈴薯 Y 病毒科/7Oacerirw1S屬，是引起甘鹿花葉病的病原物之一。感病植株一般出現(xiàn)黃綠相間不規(guī)則的花紋、條斑或斑駁，長(zhǎng)短、大小不一，布滿整個(gè)葉片，尤以新葉基部癥狀最為明顯。感病植株葉片黃化，植株矮化，分蘗減少，節(jié)間縮短，造成甘蔗產(chǎn)量及蔗莖含糖量降低。SCSMV主要通過植株無性繁殖材料長(zhǎng)距離傳播的，傳播蟲媒尚未確定。該病毒有著廣泛的寄主范圍，可以侵染玉米、高粱、狼尾草等植物。目前該病毒主要分布于印度、巴基斯坦、泰國、緬甸、越南、孟加拉、斯里卡蘭、印尼等亞洲國家。在我國的廣東、云南、海南甘蔗種質(zhì)資源圃有檢測(cè)到SCSMV，生產(chǎn)蔗區(qū)種植的甘蔗尚未發(fā)現(xiàn)。
[0003]為防止國外SCSMV株系隨著蔗莖種苗引種入境以及在國內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散傳播，為我國甘蔗脫毒種苗質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐，必需具有一種快速、可靠、靈敏的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。國內(nèi)外有關(guān)SCSMV檢測(cè)技術(shù)主要利用血清學(xué)反應(yīng)和常規(guī)的RT-PCR技術(shù)。血清學(xué)反應(yīng)方法具有操作簡(jiǎn)單、高通量的優(yōu)點(diǎn)，但需要制備高質(zhì)量的血清和靈敏度不高等缺點(diǎn)，在實(shí)際中很難應(yīng)用。常規(guī)的RT-PCR方法需要進(jìn)行PCR后處理，接觸溴化乙錠(EB)等有毒試劑，且只能終點(diǎn)定性檢測(cè)，無法對(duì)病毒滴度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR以其高靈敏度、高特異性和高準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物病害的檢測(cè)。與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、檢測(cè)周期更短、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。有關(guān)檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒及其方法未見報(bào)道。
[0004]本發(fā)明選擇甘蔗條紋花葉病毒外殼蛋白(CP)基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)用于熒光定量RT-PCR檢測(cè)的引物及探針，通過對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光RT-PCR試劑盒。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，該試劑盒能快速準(zhǔn)確的對(duì)待測(cè)樣品的甘蔗條紋花葉病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。該試劑盒不僅可使用于目前市場(chǎng)上的所有類型熒光定量PCR儀，而且能夠靈敏、特異的對(duì)甘蔗條紋花葉病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明采用Taqman探針建立熒光定量RT-PCR檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒試劑盒，通過制備RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品同時(shí)檢測(cè)得到待測(cè)樣品的初始病毒拷貝數(shù)，對(duì)病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明提供了一種利用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的引物對(duì)QPCR-Fl、QPCR-Rl和Taqman探針QPCR-P1，所述的引物對(duì)序列如下:
QPCR-Fl:5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’，
QPCR-Rl:5’ -GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’ ；
Taqman探針QPCR-Pl的序列如下:
5，-FAM-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-TAMRA-3，。
[0009]本發(fā)明還提供一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成:
(1)陽性標(biāo)準(zhǔn)品:采用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成含有目的檢測(cè)基因的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，I X 101°拷貝/ μ L，50 μ L/瓶，-20°C冷凍保存；
(2)陰性對(duì)照:采用無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性對(duì)照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> (3)町-?0?反應(yīng)液:每個(gè)反應(yīng)包括2\1?1'-?0?緩沖液10μ LUO mmol dNTPs 0.4 μ L、25 mmol MgCl2 1.6 μ L 以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對(duì) QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 各0.4 μ L,共12.8 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)640 μ L，-20 1:保存?zhèn)溆茫?br> (4)反應(yīng)酶混合液:每個(gè)反應(yīng)體系包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶液0.4μL、Taq酶0.4 yL，含量為5 U/ μ L，共0.8 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)40 μ L，_20°C保存?zhèn)溆?；` (5 )探針溶液:Taqman探針QPCR-PI采用5 ’ -FAM和3 ’ -TAMRA修飾，合成后采用無RNase水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個(gè)反應(yīng)體系0.8 μ L, 50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)40 yL,_20°C保存?zhèn)溆?
(6)無 RNase 水:2X IOmL/ 瓶。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果主要體現(xiàn)在:本試劑盒對(duì)甘蔗條紋花葉病毒的檢測(cè)有高度的特異性，與其他甘蔗病毒無交叉反應(yīng)；檢測(cè)的靈敏度達(dá)IO2拷貝，可以在甘蔗田間樣品和脫毒種苗等樣本中檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒；利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快速，從樣品病毒核酸提取至完成檢測(cè)，耗時(shí)不超過3小時(shí)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是甘蔗條紋花葉病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量RT-PCR的動(dòng)力學(xué)曲線。圖中橫坐標(biāo)代表熒光定量RT-PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光信號(hào)強(qiáng)度，擴(kuò)增曲線分別是RNA標(biāo)準(zhǔn)品 IXlO9 拷貝 / μ UlXlO8 拷貝 / μ UlXlO7 拷貝 / μ UlXlO6 拷貝 / μ UlXlO5 拷貝 /μ UlXlO4 拷貝 / μ UlXlO3 拷貝 / μ L 和 IX IO2 拷貝 /yL。
[0012]圖2是甘蔗條紋花葉病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)x代表標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)y代表RT-PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；y= -3.243x+42.12 ;R代表相關(guān)系數(shù)，決定系數(shù)R2=0.997。
【具體實(shí)施方式】
[0013]為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。
[0014]實(shí)施例1 一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，包括Taqman 探針 QPCR-Pl 和引物對(duì) QPCR-Fl、QPCR-Rl，其中 Taqman 探針 QPCR-Pl 序列為5，- CACCATCACGAAATCAATGCAGCA _3 ’，探針的5 ’端和3 ’端分別采用熒光基團(tuán)FAM和TAMRA 進(jìn)行修飾；引物對(duì) QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 序列為 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和5’ -GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’ ；該試劑盒包括下列試劑:
(I)陽性標(biāo)準(zhǔn)品:利用常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增獲得甘蔗條紋花葉病毒CP完整基因，PCR產(chǎn)物純化克隆到pGEM-T載體，然后用&0RI酶切線性化重組質(zhì)粒，采用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成含有CP基因的RNA，用DNase I酶消化剩余的DNA，然后將轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物純化，得到甘蔗條紋花葉病毒的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。用核酸蛋白分析儀測(cè)定體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的含量為100 ng/μ L，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小為913 bp，根據(jù)公式計(jì)算RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)為1.94X IO11拷貝/ μ L，并稀釋成標(biāo)準(zhǔn)樣品I X 101°拷貝/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存。
[0015](2)陰性對(duì)照:采用無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性對(duì)照，用核酸蛋白分析儀測(cè)定提取的總RNA濃度，并稀釋成濃度為100 ng/yL作為陰性樣品，50 μ L/瓶，-20 1:冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0016](3)RT-PCR 反應(yīng)液:每個(gè)反應(yīng)包括 2XRT-PCR 緩沖液 10 μ LUO mmol dNTPs 0.4μ L.25 mmol MgCl2 1.6 μ L，以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對(duì) QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 各 0.4μ L，共12.8 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)640 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0017](4)反應(yīng)酶混合液:每個(gè)反應(yīng)體系包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶液0.4 yL、Taq酶0.4 μ L，含量為5 U/μ L，共0.8 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)40 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0018](5)探針溶液=T`aqman探針QPCR-Pl采用5’ -FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無RNase水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個(gè)反應(yīng)體系0.8 μ L, 50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)40 μ L,-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0019](6)無 RNase 水:2X 10 mL/瓶。
[0020]實(shí)施例2甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒檢測(cè)應(yīng)用
I)標(biāo)準(zhǔn)品RNA稀釋:將甘鹿條紋花葉病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品用無RNase水按10倍稀釋成I X IO9^l X IO2拷貝/ μ L的一系列RNA標(biāo)準(zhǔn)品。
[0021]2)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程建立
以此稀釋后RNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品處理重復(fù)3次。并以無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片總RNA為陰性對(duì)照，以無RNase水為空白對(duì)照。按上述試劑盒內(nèi)組分，熒光定量RT-PCR反應(yīng)總體系為20 μ L，包括RT-PCR反應(yīng)液12.8 μ L，反應(yīng)酶混合液0.8 yL，探針溶液0.8 μ L，標(biāo)準(zhǔn)樣品RNA 1.0 μ L，無RNases水補(bǔ)至20 μ L ;然后放于ABI公司7500定量PCR儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)擴(kuò)增程序?yàn)?第一階段為RNA樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):42 V 5 min反轉(zhuǎn)錄，95 V 10 s終止反轉(zhuǎn)錄；第二階段為PCR反應(yīng):95 V 5 S，60 V 34s，40個(gè)循環(huán)，在60 °C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。獲得如圖1所示的擴(kuò)增曲線，然后繪制如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。本實(shí)施例構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Υ=_3.2436Χ+42.127，決定系數(shù)R2為0.9976，擴(kuò)增效率為103.37%，滿足熒光定量RT-PCR正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。檢測(cè)靈敏度可IO2拷貝/yL。將熒光定量RT-PCR方法獲得產(chǎn)物用常規(guī)電泳檢測(cè)，只能檢測(cè)到IO4拷貝/ μ L，比常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)靈敏度至少高100倍。[0022]3)待測(cè)樣品RNA提取:采用TEIZOL--試劑盒提取幾份待測(cè)甘蔗葉片rna，在核酸蛋白分析儀上測(cè)定RNA的光吸收值，計(jì)算提取的RNA濃度，然后統(tǒng)一稀釋成100 ng/ μ L。
[0023]4)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增:以待測(cè)樣品的RNA為模板，熒光定量RT-PCR反應(yīng)總體系和擴(kuò)增程序同上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程建立。在ABI公司7500定量PCR儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，獲得待測(cè)樣品的甘蔗條紋花葉病毒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量RT-PCR的動(dòng)力學(xué)曲線。將待測(cè)樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程轉(zhuǎn)化成初始病毒分子拷貝數(shù)，即一個(gè)分子拷貝數(shù)代表一個(gè)甘蔗條紋花葉病毒，從而定量分析甘蔗樣品中感染甘蔗條紋花葉病毒的數(shù)量，結(jié)果如表1所示。檢測(cè)結(jié)果表明，具有花葉病癥狀的福農(nóng)39號(hào)、云蔗07-2384、新臺(tái)糖22、云蔗05-49這4個(gè)田間樣品證實(shí)感染了甘蔗條紋花葉病毒，病毒含量達(dá)IO4IO7拷貝/μ L。為了進(jìn)一步證實(shí)感染的病毒是甘蔗條紋花葉病毒，我們將熒光定量RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，核苷酸序列提交http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/比對(duì),結(jié)果證實(shí)是甘鹿條紋花葉病毒,屬于馬鈴薯Y病毒科禾本科屬(Foacevirus)。本發(fā)明建立的檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒熒光定量RT-PCR方法具有很好的重復(fù)性，同一樣品的Ct值變異系數(shù)小于2 %。
[0024]利用本發(fā)明的Taqman探針熒光定量一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以準(zhǔn)確快速的得到樣品的甘蔗條紋花葉病毒初始拷貝數(shù)，可以應(yīng)用于甘蔗田間樣品檢測(cè)、脫毒種苗質(zhì)量監(jiān)控和甘蔗抗性鑒定。
[0025]表1待測(cè)樣品Ct值及穩(wěn)定性
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，包括Taqman探針QPCR-Pl和引物對(duì)QPCR-Fl、QPCR-Rl，其中Taqman探針QPCR-Pl序列為5’ -CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-3’，探針的5’端和3’端分別采用熒光基團(tuán)FAM和TAMRA 進(jìn)行修飾；引物對(duì) QPCR-Fl 和 QPCR-Rl 序列為 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和5’ -GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3’。
2.一種用于甘蔗條紋花葉病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)的試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成 : (1)陽性標(biāo)準(zhǔn)品:采用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成含有目的檢測(cè)基因的RNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，I X 101°拷貝/ μ L，50 μ L/瓶，-20°C冷凍保存； (2)陰性對(duì)照:采用無甘蔗條紋花葉病毒感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總RNA為陰性對(duì)照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫? (3)町-?0?反應(yīng)液:每個(gè)反應(yīng)包括2\1?1'-?0?緩沖液10μ LUO mmol dNTPs 0.4 μ L、.25 mmol MgCl2 1.6 μ L，以及權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，10 ymol/L的QPCR-Fl和QPCR-Rl各0.4 μ L，共12.8 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)640 μ L，-20 1:保存?zhèn)溆茫? (4)反應(yīng)酶混合液:每個(gè)反應(yīng)體系包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶液0.4μL、Taq酶0.4 yL，含量為5 U/ μ L，共0.8 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)40 μ L，-20 1:保存?zhèn)溆茫? (5)探針溶液:如權(quán)利要求1所述的Taqman探針QPCR-P1，采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無RNase水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個(gè)反應(yīng)體系0.8 μ L, 50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)40 μ L，_20°C保存?zhèn)溆茫? (6)無RNase 水:2X 10 mL/ 瓶。
【文檔編號(hào)】C12R1/94GK103555859SQ201310548333
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】高三基, 付衛(wèi)林, 肖勝華, 劉營(yíng)航, 陳復(fù)資, 陳如凱, 傅華英 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)