一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)步驟如下：（1）提取病原微生物基因組和基因組片段化；（2）設(shè)計(jì)和制備探針；（3）探針與基因組DNA片段進(jìn)行雜交反應(yīng)；（4）探針與雜交體固定于丙烯酰胺膠中，電泳去除未雜交上去的片段和未膠連上去的分子；（5）核酸分子固相原位擴(kuò)增；（6）信號(hào)檢測(cè)，判斷病原菌是否存在。本發(fā)明采用單個(gè)核苷酸分子捕獲、擴(kuò)增與檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了原病微生物快速高效檢測(cè)的目的，具有十分重要的應(yīng)用前景和使用價(jià)值。本發(fā)明不僅可用于微生物鑒定，還可用于實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)和臨床中某些含量較低，且具有重要分析或診斷意義的分子的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】—種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視，致病微生物對(duì)食品的污染問(wèn)題歷來(lái)是人們關(guān)注的首要食品安全問(wèn)題。要從根本上解決食品安全問(wèn)題，就必須對(duì)食品的生產(chǎn)、加工、流通和銷售等各環(huán)節(jié)實(shí)施全程管理和監(jiān)控，這就需要大量能夠滿足這一要求的快速、方便、準(zhǔn)確、靈敏的食品安全分析檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)一旦發(fā)生食源性致病微生物中毒事件，也需要在最短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)，以制定科學(xué)合理的治療方案，贏得治療時(shí)間。這些快速分析檢測(cè)技術(shù)的推廣應(yīng)用，不僅是對(duì)傳統(tǒng)的食品安全分析檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)和提高，也使食品的質(zhì)量安全有了進(jìn)一步的保證。
[0003]近年來(lái)，隨著各項(xiàng)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，食品安全快速分析檢測(cè)技術(shù)也得到了一定程度的發(fā)展。目前，食品安全快速分析檢測(cè)方法主要有三類:培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。[0004]培養(yǎng)法是最早發(fā)展起來(lái)的鑒定細(xì)菌的方法。目前，該種方法已改進(jìn)為在培養(yǎng)基中加入特異性的生化反應(yīng)底物、抗體、熒光反應(yīng)底物、酶反應(yīng)底物等，使目標(biāo)培養(yǎng)物的選擇、分離和鑒定一次性完成。紙片法就是在培養(yǎng)法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型檢測(cè)方法。該方法以紙片、紙膜和膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在培養(yǎng)基載體上，通過(guò)微生物在培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)上的生長(zhǎng)、顯色來(lái)測(cè)定食品微生物。目前雖然已有紙片法產(chǎn)品運(yùn)用于臨床檢測(cè)，但該方法仍存在較多不足之處，如培養(yǎng)檢測(cè)仍需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間(約24小時(shí))；顯色指示劑系統(tǒng)單一，不能對(duì)細(xì)菌有區(qū)別地分類分析；測(cè)試紙檢測(cè)的指標(biāo)較少，通量低等。由于這些不足，紙片法產(chǎn)品的生產(chǎn)和臨床運(yùn)用仍然較少。
[0005]免疫學(xué)方法通過(guò)抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，再輔以免疫放大技術(shù)來(lái)鑒別細(xì)菌。酶聯(lián)免疫吸附法是一種固相酶免疫分析方法，其是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)方法。該方法既可測(cè)抗原，也可測(cè)抗體，還可以進(jìn)行定性和定量。但該方法也存在著如檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、致病菌單克隆抗體難以制備、使用多抗容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽(yáng)性以及一次只能檢測(cè)一種或幾種致病菌等缺點(diǎn)和不足。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)具有高度的敏感性，可同時(shí)對(duì)目的菌進(jìn)行定性和定量。但該方法的成本較高，不僅流式細(xì)胞儀極為昂貴，而且對(duì)操作者的要求也較高。
[0006]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)與手段也開始應(yīng)用于食品致病微生物的檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)直接測(cè)定PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，利用電腦分析軟件對(duì)PCR過(guò)程中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和自動(dòng)定量，從而成功地實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。然而，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)常由于受到寡核苷酸雜交特異性、TaqMan探針比例和染料濃度大等因素的影響，引起定量結(jié)果出現(xiàn)偏差或?qū)е录訇?yáng)性和假陰性結(jié)果。[0007]基因芯片技術(shù)基于芯片上的探針與樣品中的靶基因片段之間發(fā)生特異性核酸雜交，具有高通量、高靈敏度、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)。其不足之處是芯片技術(shù)本身具有較多問(wèn)題，如特異性問(wèn)題、假陰性和假陽(yáng)性問(wèn)題、芯片的產(chǎn)品質(zhì)量和可靠性問(wèn)題等。
[0008]因此，目前還需要開發(fā)可快速、高效檢測(cè)致病菌的新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，能夠快速、高效檢測(cè)致病菌。
[0010]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)步驟如下:
(O分離待檢測(cè)食品中的微生物，并提取基因組DNA ;采用超聲波或DNA破碎酶將上述基因組DNA隨機(jī)打斷成200~1000bp的片段；
(2)用DNA合成儀合成一條探針，并用丙烯酰胺對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記；
(3)將步驟(2)中標(biāo)記后的探針與步驟(1)中打斷的基因組DNA片段雜交；
(4)將步驟(3)中雜交后的溶液與丙烯酰胺貯存液混合，將均勻混合液平鋪于基片上進(jìn)行凝固形成膠，然后用非變性電 泳液電泳去除未雜交上去的片段和未膠連上去的分子；
(5)向步驟(4)中電泳后的膠上滴加核酸分子擴(kuò)增反應(yīng)液、核酸熒光染料混合液，將混合液與膠一起密封在基片上并置于控溫裝置中，進(jìn)行核酸分子原位擴(kuò)增；
(6)用分辨率高于2048X2048的熒光顯微鏡或掃描儀進(jìn)行熒光信號(hào)采集，根據(jù)陽(yáng)性點(diǎn)的數(shù)量判斷待檢測(cè)樣本的病原菌是否存在。
[0011]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述病原微生物為細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、病毒、支原體和藻類，來(lái)自于食品、水、空氣和患者排瀉物。
[0012]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述病原微生物是含有特征核酸分子的病原體。
[0013]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述特征核酸分子為單鏈或雙鏈RNA，DNA, cDNA直鏈核酸分子或環(huán)形核酸分子。
[0014]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述步驟(3)中的基片為載玻片、硅片或芯片。
[0015]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述步驟(5)中的核酸分子原位擴(kuò)增技術(shù)為PCR原位擴(kuò)增或恒溫原位擴(kuò)增。
[0016]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述原位擴(kuò)增采用原位單分子在三維膠內(nèi)進(jìn)行。
[0017]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述步驟(5)中的核酸熒光染料為SYBR Green 1、Genefinder 和 Geneview 中的至少一種。
[0018]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述核酸分子熒光染料與核酸分子擴(kuò)增反應(yīng)混合物一起添加或在擴(kuò)增反應(yīng)后添加。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)目前市場(chǎng)上對(duì)于快速高效病原微生物檢測(cè)技術(shù)的需要，采用單個(gè)核苷酸分子捕獲、擴(kuò)增與檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了原病微生物快速高效檢測(cè)的目的，具有十分重要的應(yīng)用前景和使用價(jià)值。本發(fā)明不僅可用于微生物鑒定，還可用于實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)或臨床中某些含量較低，而具有重要分析或診斷意義的分子的檢測(cè)。?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是本發(fā)明一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)的示意圖； 圖2是單個(gè)核酸分子擴(kuò)增與檢測(cè)結(jié)果圖；
附圖中各部件的標(biāo)記如下:1.基因組片段化處理；2.探針與靶向分子在溶液中雜交；
3.通過(guò)探針上的化學(xué)基團(tuán)將靶向分子與探針的雜交體、以及引物/探針連接固定在固相載體膠中；4.采用電泳等技術(shù)將非靶向分子去除；5.采用固相PCR將靶向分子進(jìn)行單分子原位擴(kuò)增；6.擴(kuò)增后的DNA分子簇直接顯色后檢測(cè)；a.細(xì)菌基因組DNA ;b.打碎成200-1000bp的非靶向DNA片段；c.打碎成200_1000bp的靶向DNA片段；d.標(biāo)記有化學(xué)基團(tuán)的探針?lè)肿?；e.探針與靶向分子的雜交體；f.鋪在載玻片或其他固相載體上的丙烯酰胺膠，該膠體中固定有標(biāo)記了丙烯酰胺分子的引物/探針，以及引物/探針與靶向分子的雜交體，膠孔內(nèi)還含有未雜交上去的非靶向片段；g.去除非靶向分子之后的膠體，及固定下來(lái)的引物與雜交體；h.擴(kuò)增后的膠體與被擴(kuò)增的靶向分子；1.信號(hào)采集圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。
[0022]請(qǐng)參閱附圖,本發(fā)明實(shí)施例包括:
實(shí)施例1
采用聚丙烯酰胺凝膠捕獲靶片段和PCR原位擴(kuò)增鑒定病原微生物 (I)探針/引物的設(shè)計(jì)與制備:
菌種特異DNA序列片段選擇:采用Mega或Clustal W等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)比較,并選擇食品病原微生物的特異基因。
[0023]探針的設(shè)計(jì):采用primerf.0軟件，針對(duì)微生物的特異片段設(shè)計(jì)探針。
[0024]探針的合成與標(biāo)記:一條探針/引物采用DNA合成儀進(jìn)行合成，同時(shí)在5'端標(biāo)記一個(gè)丙烯酰胺基團(tuán)，前后引物都要進(jìn)行標(biāo)記。
[0025](2)病原微生物基因組提取、基因組片段化:
病原微生物基因組DNA提取:采集冷卻肉及經(jīng)屠宰加工后的鴨肉系列產(chǎn)品，用無(wú)菌棉拭子進(jìn)行六面50cm2取樣,然后將棉拭子上的微生物用PBS緩沖液(phosphate buffersaline,磷酸鹽緩沖液)沖洗下來(lái)，14000rpm離心10分鐘,分離微生物。采用試劑盒或本研究室優(yōu)化后的微生物DNA抽提方法，抽提微生物全基因組DNA。
[0026]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x，將基因組DNA隨機(jī)打斷成500-1000bp大小的基因片段。
[0027](3)片段化的基因組與探針雜交并固定于聚丙烯酰胺凝膠中
基因組與探針的雜交反應(yīng):雜交反應(yīng)采用的雜交體系為:5XSSC (saline sodiumcitrate,朽1樣酸緩沖液),25%去離子甲酸胺,0.1% SDSCSodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸鈉)，50yg/ml sheared salmon sperm和兩條5'-丙烯酰胺-引物/探針為lpmol。將雜交反應(yīng)液與基因組1: 2混合均勻，95°C變性5分鐘，然后半小時(shí)內(nèi)降至室溫進(jìn)行復(fù)性。
[0028] 硅片的表面修飾:
(A)選擇大小合適的低熒光背景的硅片，置于80°C的piranha洗液(濃硫酸與30% H2O2按體積比7: 3混合)中超聲洗滌2小時(shí)，然后依次用洗滌劑和去離子蒸餾水徹底清洗，烘干備用;
(B)硅烷化處理:將步驟(A)中烘干后的硅片置于含有2% APTES (3-Aminopro-pyltriethoxysilane, 3_氨丙基三乙氧基硅烷)的丙酮溶液中浸泡5~10分鐘,然后分別用丙酮、乙醇和去離子蒸餾水徹底清洗兩次，氮?dú)獯蹈桑?80°C烘烤I~2小時(shí)。
[0029]探針/引物及雜交體固定于丙烯酰胺膠中，電泳去除未雜交上去的DNA片段: 探針/引物固定于丙烯酰胺膠中:配制摻有雜交溶液的丙烯酰胺溶液，該溶液包含:丙
烯酰胺(3%)、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺(0.15%)、過(guò)硫酸銨(0.05%)、TEMED (0.05%)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混勻后滴加到硅烷化處理的載玻片上，然后用排斥硅烷處理過(guò)的蓋玻片蓋在丙烯酰胺溶液上，形成5~20微米的薄層溶液，最后，將含有薄層溶液的玻片置于飽和濕度的真空環(huán)境中凝集0.5小時(shí)，形成凝膠。
[0030]電泳法去除非靶向片段:將帶有凝膠的玻片取出，用去離子水沖洗幾遍后，將其置于電泳液(0.5XTBE)中電泳5分鐘，取出后用洗液(Tris.HCL 10 mmol/L, PH 7.5 ；KCL50mmol/L,EDTA 2mmol/L,0.01% Triton X-100)沖洗 2 次，最后用去離子水沖洗 2 ~4 次，
氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br> [0031](4)固相原位PCR擴(kuò)增與信號(hào)檢測(cè)
固相PCR擴(kuò)增:制備30微 升PCR反應(yīng)液，其中包含I XPCR反應(yīng)液緩沖液，Mg2+L 8mmol/L, dNTPs 200 mol/L, Taq DNA 聚合酶 I U 和 10XSYBR Green I。將適量的 PCR 反應(yīng)用液滴加到膠上，在膠上覆蓋一個(gè)密封的蓋盒，使PCR反應(yīng)體系得以在密閉的環(huán)境中完成。置于玻片溫控體系中進(jìn)行如下PCR擴(kuò)增:95°C預(yù)變性2分鐘，然后95°C變性I分鐘，Tm復(fù)性I分鐘，72°C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后，72°C再延伸5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，去除PCR反應(yīng)液。
[0032]信號(hào)檢測(cè):將玻片貼有丙烯酰胺膠的一面放置于高分辨率(高于2048X2048)的熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)量。
[0033]實(shí)施例2
采用聚丙烯酰胺凝膠捕獲靶片段和恒溫原位擴(kuò)增鑒定病原微生物 (I)探針/引物的設(shè)計(jì)和制備:
菌種特異DNA序列片段選擇:采用Mega或Clustal W等軟件比較生物信息學(xué),并選擇食品病原微生物的特異基因。
[0034]探針/引物的設(shè)計(jì):采用primerf.0軟件，針對(duì)微生物的特異片段設(shè)計(jì)探針。
[0035]探針/引物的合成與標(biāo)記:一條探針/引物采用DNA合成儀進(jìn)行合成，同時(shí)在5'端標(biāo)記一個(gè)丙烯酰胺基團(tuán)，前后引物都要進(jìn)行標(biāo)記。
[0036](2)病原微生物基因組提取、基因組片段化和環(huán)化
病原微生物基因組DNA提取:采集冷卻肉及經(jīng)屠宰加工后的鴨肉系列產(chǎn)品，用無(wú)菌棉拭子進(jìn)行六面50cm2取樣，然后將棉拭子上的微生物用PBS沖洗下來(lái)，HOOOrpm離心10分鐘，分離微生物。采用試劑盒或本研究室優(yōu)化后的微生物DNA抽提方法，抽提微生物全基因組 DNA。
[0037]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x，將基因組DNA隨機(jī)打斷成200-500bp大小的基因片段。[0038]基因組DNA片段的通用連接子連接:將超聲波獲取的隨機(jī)片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機(jī)片段產(chǎn)生一個(gè)TA粘性末端，然后與一個(gè)通用連接子(I inker 1: 5 '-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT-3 ' ； l inker2:5' -GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3')連接，形成一個(gè)雙鏈的環(huán)，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成單鏈環(huán)。
[0039](3)片段化的基因組與探針雜交并固定于聚丙烯酰胺凝膠中
基因組與探針的雜交反應(yīng):雜交反應(yīng)采用的雜交體系為:5XSSC，25%去離子甲酰胺，
0.1% SDS, 50 μ g/ml sheared salmon sperm和兩條 5'-丙烯酰胺-引物 / 探針為 lpmol。將雜交反應(yīng)液與基因組1: 2混合均勻，在95°C時(shí)變性5分鐘，然后再在半小時(shí)內(nèi)降至室溫進(jìn)行復(fù)性。
[0040]硅片的表面修飾:
(A)選擇大小合適的低熒光背景的硅片，置于80°C的piranha洗液(濃硫酸與30%H2O2按體積比7: 3混合)中超聲洗滌2小時(shí)，然后依次用洗滌劑和去離子蒸餾水徹底清洗，烘干備用;
(B)硅烷化處理:將步驟(A)中烘干后的硅片置于含有2%APTES (3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5~10分鐘,然后用丙酮、乙醇和去離子蒸懼水分別徹底清洗兩次，氮?dú)獯蹈珊笤?80°C烘烤I~2小時(shí)。
[0041]探針/引物及雜交體固定于丙烯酰胺膠中，電泳去除未雜交上去的DNA片段: 探針/引物固定于丙烯酰胺膠中:配制摻有雜交溶液的丙烯酰胺溶液，該溶液包含:丙
烯酰胺(3%)、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺(0.15%)、過(guò)硫酸銨(0.05%)、TEMED (0.05%)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混勻后滴加到硅烷化處理的載玻片上，然后用排斥硅烷處理過(guò)的蓋玻片蓋在丙烯酰胺溶液上，形成5~20微米的薄層溶液，最后，將含有薄層溶液的玻片置于飽和濕度的真空環(huán)境中凝集0.5小時(shí)，形成凝膠。
[0042]電泳法去除非靶向片段:將帶有凝膠的玻片取出，并用去離子水沖洗幾遍后，將其置于電泳液(0.5XTBE)中電泳5分鐘，取出后用洗液(Tris.HCL 10 mmol/L,PH 7.5 ；KCL 50mmol/L, EDTA 2 mmol/L,0.01% Triton X-100)沖洗2次，最后用去離子水沖洗2~4次，
氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br> [0043](4)固相恒溫原位擴(kuò)增與信號(hào)檢測(cè)
恒溫原位擴(kuò)增:制備30微升恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)液，其中包含10 X SYBR Green 1、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/yL)、lXBst DNA大片段聚合酶緩沖液、dNTP(800 μ mol/L)。將適量的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液滴加到膠上，在膠上覆蓋一個(gè)密封的蓋盒，使擴(kuò)增反應(yīng)體系得以在密閉的環(huán)境中完成。將芯片放置于50°C條件下，擴(kuò)增30分鐘，去除擴(kuò)增反應(yīng)液。
[0044]信號(hào)檢測(cè):將玻片貼有丙烯酰胺膠的一面放置于高分辨率(高于2048X2048)的熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)量。
[0045]實(shí)施例3
采用流道式芯片進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠捕獲靶片段和PCR原位擴(kuò)增鑒定病原微生物 (1)探針/引物的設(shè)計(jì)和制備:
菌種特異DNA序列片段選擇:采用Mega或Clustal W等軟件比較生物信息學(xué),并選擇食品病原微生物的特異基因。
[0046]探針/引物的設(shè)計(jì):采用primerf.0軟件，針對(duì)微生物的特異片段設(shè)計(jì)探針。
[0047]探針/引物的合成與標(biāo)記:一條探針/引物采用DNA合成儀進(jìn)行合成，同時(shí)在5'端標(biāo)記一個(gè)丙烯酰胺基團(tuán)，前后引物都要進(jìn)行標(biāo)記。
[0048](2)病原微生物基因組提取、基因組片段化:
病原微生物基因組DNA提取:采集冷卻肉及經(jīng)屠宰加工后的鴨肉系列產(chǎn)品，用無(wú)菌棉拭子進(jìn)行六面50cm2取樣，然后將棉拭子上的微生物用PBS沖洗下來(lái)，HOOOrpm離心10分鐘，分離微生物。采用試劑盒或本研究室優(yōu)化后的微生物DNA抽提方法，抽提微生物全基因組 DNA。[0049]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x，將基因組DNA隨機(jī)打斷成500-1000bp大小的基因片段。
[0050](3)流道式芯片制備 娃片的表面修飾:
(A)選擇大小合適的低熒光背景的硅片，置于80°C的piranha洗液(濃硫酸與30%H2O2按體積比7: 3混合)中超聲洗滌2小時(shí)，然后依次用洗滌劑和去離子蒸餾水徹底清洗，烘干備用;
(B)硅烷化處理:將步驟(A)中烘干后的硅片置于含有2%APTES (3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5~10分鐘,然后用丙酮、乙醇和去離子蒸懼水分別徹底清洗兩次，氮?dú)獯蹈珊笤?80°C烘烤I~2小時(shí)。
[0051](C)將耐高溫的PE材料刻成一定的形狀，兩邊涂上耐高溫膠水，將兩片玻片粘合在一起，兩玻片中間形成多條流道，流道兩端有進(jìn)樣孔和出樣孔。
[0052](4)片段化的基因組與探針雜交于聚丙烯酰胺凝膠混合液并固定于芯片流道中 基因組與探針/引物的雜交反應(yīng):雜交反應(yīng)采用的雜交體系為:5XSSC，25%去離子甲
酰胺，0.1% SDS, 50 μ g/mL sheared salmon sperm和兩條5'-丙烯酰胺-引物/探針為Ipmol0將雜交反應(yīng)液與基因組1: 2混合均勻，在95°C時(shí)變性5分鐘，然后再在半小時(shí)內(nèi)降至室溫進(jìn)行復(fù)性。
[0053]探針/引物、雜交體與丙烯酰胺混合液灌注芯片，電泳去除未雜交的DNA片段:配制摻有雜交溶液的丙烯酰胺溶液，該溶液包含:丙烯酰胺(3%)、N, N'-甲叉雙丙烯酰胺(0.15%)、過(guò)硫酸銨(0.05%)、TEMED (0.05%)，其中，TEMED最后再加到溶液中，混勻后，采用微量注射器將上述混合液注入芯片的流道中形成5~20微米的薄層溶液，最后，將含有薄層溶液的芯片置于飽和濕度的真空環(huán)境中凝集0.5小時(shí)，形成凝膠。
[0054]電泳法去除非靶向片段:將芯片置于電泳液(0.5XTBE)中，電極插入進(jìn)樣孔和出樣孔，電泳 5 分鐘，取出后再用洗液(Tris.HCL 10 mmol/L, PH 7.5 ；KCL 50mmol/L, EDTA2mmol/L,0.01% Triton X-100)沖洗2次，然后用去離子水沖洗2~4次，抽干流道中的溶液，備用。
[0055](5)固相原位PCR擴(kuò)增與信號(hào)檢測(cè)
固相PCR擴(kuò)增:制備30微升PCR反應(yīng)液，其中包含I X PCR反應(yīng)液緩沖液，Mg2+ 1.8mmol/L, dNTPs 200 mol/L, Taq DNA 聚合酶 I U 和 10 X SYBR Green I。將適量的 PCR 反應(yīng)液灌注到芯片內(nèi)，兩端加樣孔用封口膠密封，然后將其置于溫控體系中進(jìn)行如下PCR擴(kuò)增:95°C預(yù)變性2分鐘，然后95°C變性I分鐘，Tm復(fù)性I分鐘，72 °C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后，72°C再延伸5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，去除PCR反應(yīng)液。
[0056]信號(hào)檢測(cè):將玻片貼有丙烯酰胺膠的一面放置于高分辨率(高于2048X2048)的熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)量。
[0057]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
(I)實(shí)現(xiàn)了病原微生物的快速檢測(cè)與鑒定:該檢測(cè)方法無(wú)需增菌培養(yǎng)，直接分離食品表面的細(xì)菌，并抽提細(xì)菌基因組DNA，將抽提的DNA首先進(jìn)入靶序列的捕獲，然后進(jìn)行原位擴(kuò)增和檢測(cè)，整個(gè)流程在3~5小時(shí)內(nèi)即可完成，分子分析過(guò)程速度較快。本發(fā)明采取的樣品如果含有5個(gè)以上的細(xì)菌即可以檢測(cè)出來(lái)。通常，對(duì)于大部分病原菌，5個(gè)以下的細(xì)菌不足以引起疾病。
[0058](2)實(shí)現(xiàn)了病原微生物的高靈敏度檢測(cè):采用捕獲的方法將目標(biāo)片段與其他非特異DNA片段分開，實(shí)現(xiàn)了單分子擴(kuò)增與檢測(cè)技術(shù)。DNA擴(kuò)增效率與被擴(kuò)增分子與引物分子之間的碰撞機(jī)會(huì)呈正相關(guān)，理論上，PCR擴(kuò)增反應(yīng)可以將溶液中的單個(gè)分子擴(kuò)增出來(lái)，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)的靈敏度是100-100000個(gè)分子，一般的反應(yīng)體系需要10000個(gè)分子以上。本發(fā)明在進(jìn)行單分子擴(kuò)增之前，首先通過(guò)電泳或沉淀等技術(shù)將非目標(biāo)片段去除，剩余的片段只有引物和目標(biāo)分子，這樣大大增加了目標(biāo)分子與引物之前的碰撞機(jī)會(huì)，也大大提高了目標(biāo)分子的擴(kuò)增效率。
[0059]另外，本發(fā)明針對(duì)同一種病原微生物采用多個(gè)捕獲探針，檢測(cè)部位含有5個(gè)以上的細(xì)胞即可以被檢測(cè)到。理論上有一個(gè)DNA分子即可以被捕獲并檢測(cè)到，但由于操作過(guò)程中有一定的消耗，因此該 項(xiàng)研究檢測(cè)的靈敏度為大約為5個(gè)細(xì)胞。
[0060](3)實(shí)現(xiàn)了進(jìn)行多種病原微生物或多個(gè)樣本同時(shí)檢測(cè):由于單個(gè)分子擴(kuò)增需要一塊很小的區(qū)域(一平方毫米可以有1000個(gè)以上分子的擴(kuò)增點(diǎn))，在一張載玻片上可以制作50以上的凹槽，每個(gè)凹槽至少可以檢測(cè)一種微生物或一個(gè)樣品，因此，該項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)多種病原微生物同時(shí)檢測(cè)。
[0061](4)采用分子的溶液內(nèi)雜交捕獲，以及捕獲探針膠固定模式，具有較高的雜交效率和較高的捕獲探針固定效率:以往的捕獲探針與目標(biāo)片段雜交采用固液相雜交，也就是將探針?lè)肿庸潭ㄔ诠滔噍d體上，然后將含有目標(biāo)分子的片段與探針在固液相中進(jìn)行雜交，由于固液相條件下，探針與靶向片段分子的碰撞機(jī)會(huì)與液相雜交相比要少很多，因此液相雜交效率明顯高于固液相雜交；對(duì)于液相雜交結(jié)束后捕獲探針的固定，目前效率最好的是磁珠上包被親和素與探針上連接有生物素相結(jié)合，固定效率最高達(dá)30%，而本發(fā)明所采用的丙烯酰銨凝膠固定，其固定效率至少為50%，最高可達(dá)到95%以上，也就是10個(gè)分子中至少有5個(gè)分子被捕獲。
[0062](5)采用三維膠內(nèi)原位擴(kuò)增模式，大大提高了原位擴(kuò)增效率:截止到目前所報(bào)導(dǎo)的原位擴(kuò)增只有三種類型，一種是在一個(gè)平面上進(jìn)行橋式PCR原位擴(kuò)增，一種是在磁珠上進(jìn)行PCR原位擴(kuò)增，還有一種是在三維膠內(nèi)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。前兩種原位擴(kuò)增由于平面上所固定引物數(shù)量有限，引物與模板鏈相碰撞的機(jī)會(huì)相應(yīng)較少；而且擴(kuò)增產(chǎn)物還會(huì)產(chǎn)生一定的空間位阻，阻止了引物與模板鏈的有效結(jié)合，導(dǎo)致這兩種原位擴(kuò)增效率較低，條件較難控制。在三維空間內(nèi)進(jìn)行的滾環(huán)擴(kuò)增，由于擴(kuò)增模板是一個(gè)環(huán)形的模板，應(yīng)用面較窄，另外由于連接成環(huán)的效率不是很高，所以檢測(cè)的靈敏度也受到較多限制。本發(fā)明在三維結(jié)構(gòu)的膠內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物提前固定在三維膠上，增加了引物與模板的接觸機(jī)會(huì)和接觸空間，使得原位擴(kuò)增易于實(shí)現(xiàn)。
[0063](6)采用原位單分子擴(kuò)增技術(shù)，能夠定量檢測(cè)食品中病原微生物的含量:在模板分子數(shù)量較少的情況下，一個(gè)擴(kuò)增點(diǎn)只有一個(gè)原模板分子，因此，每一個(gè)擴(kuò)增點(diǎn)代表一個(gè)拷貝的DNA分子，而每一個(gè)拷貝的DNA模板分子來(lái)自于一個(gè)細(xì)菌或一個(gè)生命個(gè)體(對(duì)于單拷貝基因來(lái)說(shuō))，因此，根據(jù)原位擴(kuò)增位點(diǎn)能夠大體進(jìn)行定量分析。
[0064](7)檢測(cè)方法多樣，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇，成本相對(duì)較低:首先，可以采用DNA熒光染料(如SYBR Green I)進(jìn)行顯色，有DNA的位點(diǎn)會(huì)有熒光發(fā)出，然后通過(guò)掃描儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單快速，成本較低；第二種檢測(cè)方法為探針雜交的方法，即針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)探針，探針一端連接有熒光，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后進(jìn)行電泳，去除未雜交上去的探針，然后通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)信號(hào)分子。該方法更為準(zhǔn)確，但操作起來(lái)較為繁瑣；第三種檢測(cè)方法是測(cè)序法，測(cè)序法也就是以擴(kuò)增產(chǎn)物為測(cè)序模板，進(jìn)行延伸測(cè)序，這種方法對(duì)于儀器要求較高，成本相應(yīng)的也較高，但是檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)可靠，而且還可以進(jìn)行微生物的分型與突變檢測(cè)。
[0065]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，檢測(cè)步驟如下: (1)分離待檢測(cè)食品中的微生物，并提取基因組DNA;采用超聲波或DNA破碎酶將上述基因組DNA隨機(jī)打斷成200~1000bp的片段； (2)用DNA合成儀合成一條探針，并用丙烯酰胺對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記； (3)將步驟(2)中標(biāo)記后的探針與步驟(1)中打斷的基因組DNA片段雜交； (4)將步驟(3)中雜交后的溶液與丙烯酰胺貯存液混合，將均勻混合液平鋪于基片上進(jìn)行凝固形成膠，然后用非變性電泳液電泳去除未雜交上去的片段和未膠連上去的分子； (5)向步驟(4)中電泳后的膠上滴加核酸分子擴(kuò)增反應(yīng)液、核酸熒光染料混合液，將混合液與膠一起密封在基片上并置于控溫裝置中，進(jìn)行核酸分子原位擴(kuò)增； (6)用分辨率高于2048X2048的熒光顯微鏡或掃描儀進(jìn)行熒光信號(hào)采集，根據(jù)陽(yáng)性點(diǎn)的數(shù)量判斷待檢測(cè)樣本的病原菌是否存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述病原微生物為細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、病毒、支原體和藻類，來(lái)自于食品、水、空氣和患者排?與物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述病原微生物是含有特征核酸分子的病原體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述特征核酸分子為單鏈或雙鏈RNA，DNA, cDNA直鏈核酸分子或環(huán)形核酸分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述步驟(3)中的基片為載玻片、硅片或芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述步驟(5)中的核酸分子原位擴(kuò)增技術(shù)為PCR原位擴(kuò)增或恒溫原位擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述原位擴(kuò)增采用原位單分子在三維膠內(nèi)進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述步驟(5)中的核酸突光染料為SYBR Green 1、Genefinder和Geneview中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于食品病原微生物鑒定的單個(gè)核酸分子檢測(cè)技術(shù)，其特征在于，所述核酸分子熒光染料與核酸分子擴(kuò)增反應(yīng)混合物一起添加或在擴(kuò)增反應(yīng)后添加。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103740808SQ201310563819
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】周東蕊, 張紅琳, 白志茂, 嚴(yán)勇, 陸祖宏, 肖鵬峰, 李清寧 申請(qǐng)人:東南大學(xué)