一種具有自生固氮、解磷和解鉀能力的土壤桿菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株具有自生固氮、解磷和解鉀能力的土壤桿菌，其分類命名為土壤桿菌（Agrobacteriumrsp.）X.L.Zhu.SGD06-8-33，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.5457。該菌株固氮酶活性較高，具有較高的解磷和解鉀能力，能夠產(chǎn)生一定量的吲哚乙酸和鐵載體，無ACC脫氨酶活性。用含有該菌株的液體或固體菌劑接種玉米、油菜和芥菜等農(nóng)作物，可以明顯促進(jìn)其生長，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。該方法工藝簡(jiǎn)便，原料來源豐富，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】—種具有自生固氮、解磷和解鉀能力的土壤桿菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株具有自生固氮、解磷解鉀能力的土壤桿菌及其應(yīng)用，該菌株用紫外線-等離子體復(fù)合誘變獲得，能夠促進(jìn)農(nóng)作物的生長，屬于農(nóng)業(yè)微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]氮素是作物生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一，對(duì)作物最終產(chǎn)量的貢獻(xiàn)為40%-50%。作物每年都要從土壤中帶走大量的氮素，為補(bǔ)充土壤氮素的損失，工業(yè)化學(xué)氮肥至今仍然是人類向土壤補(bǔ)給氮素的重要來源。雖然化學(xué)肥料在促進(jìn)作物生長、提高糧食產(chǎn)量中發(fā)揮了巨大的作用，但長期過量使用化肥會(huì)產(chǎn)生一系列問題，如酸沉降、土壤板結(jié)、水體富營養(yǎng)化、全球變暖、同溫層臭氧耗竭、顆粒物和光化學(xué)煙霧形成、飲水和食物中硝酸鹽積累等，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003]生物固氮可以將空氣中的氮?dú)庵苯愚D(zhuǎn)化為植物可利用的氨，供植物生長之需。與施用化學(xué)肥料相比，生物固氮毋需消耗非再生能源，固氮產(chǎn)物可直接被植物吸收利用，且不易因揮發(fā)、反硝化、淋溶損失而引起農(nóng)業(yè)環(huán)境污染。因此開發(fā)利用生物固氮資源成為世界各國的研究熱點(diǎn)。
[0004]生物固氮包括共生固氮、聯(lián)合固氮和自生固氮。多年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)根瘤菌等共生固氮微生物研究較多，如含莖瘤固氮根瘤菌微生物肥料、慢生根瘤菌、根瘤菌DZY-N33固氮菌劑和固氮噬麥芽窄食單胞菌等均為固氮根瘤菌。根瘤菌肥在低產(chǎn)田或新種植區(qū)應(yīng)用，效果比較顯著。但是，一種根瘤菌肥料往往只適用于一種特定的作物，應(yīng)用范圍較窄，且不適于在禾本科糧食作物和非豆科蔬菜作物上應(yīng)用。
[0005]自生固氮菌是一類能夠在土壤中獨(dú)立進(jìn)行固氮的細(xì)菌。據(jù)報(bào)道，土壤中自生固氮菌的固氮量可達(dá)60 kg.hm_ 2.a_ \雖然與共生固氮體系相比，其固氮量相對(duì)較低，但它不需要與特定的植物配合，同時(shí)具有資源總量大、分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)、生產(chǎn)和使用都較為方便等特點(diǎn)。自生固氮微生物可以通過生物固氮途徑為水稻、玉米、小麥、棉花、蔬菜、果樹等多種農(nóng)作物提供氮素養(yǎng)分，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有巨大的應(yīng)用潛力。目前，我國用于生產(chǎn)的固氮菌株，其固氮量較低，應(yīng)用效果不穩(wěn)定，而且從自然界分離的大部分野生的固氮菌都存在生長緩慢、存活率低、有效期短、固氮和促生長能力較低以及對(duì)土壤環(huán)境要求苛刻等缺點(diǎn)，不能滿足作為促生微生物肥料的需要。為此，需要采用物理和化學(xué)誘變進(jìn)行野生菌種的改性，打破野生菌種的正常代謝，使之產(chǎn)生所需要的目標(biāo)代謝產(chǎn)物(如提高固氮酶活性)、提高其抗性能力等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是通過紫外線-等離子體復(fù)合誘變獲得一株具有較高自生固氮能力和較高的解磷和解鉀能力的土壤桿菌，該菌株能夠產(chǎn)生一定量的吲哚乙酸和鐵載體，促進(jìn)植物生長。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供含有上述土壤桿菌的微生物菌劑及其制備方法。[0008]本發(fā)明的目的之三是提供上述土壤桿菌在制備生物固氮菌肥中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下:
一種具有自生固氮、解磷和解鉀能力的土壤桿菌，其分類命名為土壤桿菌(.Agrobacterium sp.) X.L.Zhu.S⑶06-8-33，以下簡(jiǎn)稱 S⑶06-8-33，已于 2011 年 11 月 10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5457。
[0010]該菌株具有以下特性:G_，好氧或兼性厭氧，呈長桿狀；在固體培養(yǎng)基A上菌落呈淡黃色，圓形凸起，邊緣整齊，菌落周圍有透明圈，在無氮固體培養(yǎng)基B上菌落呈白色，圓形，中央凹陷，邊緣整齊；其最適的生長溫度28~32°C，最適的pH值為6.0-8.0，其固氮酶活性為38.92~49.97nmol.mg-1.1T1,解無機(jī)磷能力為322.2mg/l，解鉀能力為38.6 mg/1,產(chǎn)口引哚乙酸的能力為33.25^45.62μ g/ml，產(chǎn)鐵載體的能力為0.406、.63，無ACC脫氨酶活性；
所述固體培養(yǎng)基A組成為:酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4.7H200.005-0.01g，Na2MoO4.2Η20 0.0025-0.005 g，瓊脂粉 15_20g，蒸餾水 1000ml, pH 7.0~7.2 ；所述的無氮固體培養(yǎng)基B組分為:葡萄糖10-20 g,KH2PO4 0.2 g,MgSO4.7Η20 0.1-0.2g，NaCl 0.15-0.25 g，CaSO4.2H20 0.15- 0.25 g，CaCO3 5-8 g，瓊脂 15-18 g，蒸餾水1000ml, pH 7.0~7.2。
[0011]本發(fā)明土壤桿菌采用紫外線-等離子體復(fù)合誘變選育方法獲得，為了鑒定S⑶06-8-33的系統(tǒng)發(fā)育地位，測(cè)定了所分離的菌株16Sr RNA序列。
[0012]為了鑒定S⑶06-8-33的系統(tǒng)發(fā)育地位，對(duì)所分離的菌株16Sr RNA序列測(cè)定。
[0013]16Sr RNA 序列采用通用引物 27FP1 (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ )和 1429R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR 反應(yīng)體系為:IOmMol 的 dNTP 0.5 μ 1，模板 DNAl μ 1，10XPCR buffer 5 μ l,25mMol MgCl2 3“1，引物各1“1，TaqDNA 聚合酶 0.25 μ 1，ddH2037.5 μ I ;預(yù)變性:95°C 3分鐘，循環(huán)一次；變性:95°C I分鐘，退火55°C I分鐘，延伸72°C2分鐘，循環(huán)35次；終延伸:72°C 5分鐘。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離、提取目標(biāo)條帶，送北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如SEQ ID No:l所示。
[0014]SEQ ID No: I
TGGGGGGAGCTTACACATGCAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAC
ATACCCTTTCCTGCGGAATAGCTCCGGGAAACTGGAATTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGG
GAAGGATTGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAG
AGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATG
GGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATA
ATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTT
CGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACT
GCCTTTGATACTG GGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTC
GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG
ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTA
ACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG
GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTTTGGGCAGTGAGACATTGTCCTTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGGTCGTGAAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCGGGGAAAAGCCGAGAAGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCTCATGGTCTTACGGGCTGGGCTACCACCGGTGCTACAATGGTGGGTGACGGTGGCAGCGAGAACAGCGAATGTCCGGCCTAATCTCAAGGCATTCCAGTCGGAATGCACTCTGCAACTCGAGGTGCATGAAAATTGGGAAATGC。
[0015]該序列與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中土壤桿菌ierittTzr 5/?.)同源性達(dá)到99%，因此鑒定S⑶06-8-33屬于土壤桿菌屬。
[0016]本發(fā)明在具體使用時(shí)，是將其制成微生物菌劑。
[0017]含有土壤桿菌teria? sp.)X.L.Zhu.S⑶06_8_33的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟:
1)菌種發(fā)酵
①將凍存的S⑶06-8-33在37°C條件下快速解凍，按照0.5-1%的接種量接入裝有10-15ml液體培養(yǎng)基A的試管中，28-30°C，靜置培養(yǎng)15-20小時(shí)，得到S⑶06-8-33的一級(jí)種子液；
所述的液體培養(yǎng)基A組成為:酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4.7H200.005-0.01g, Na2MoO4.2H20 0.0025-0.005 g，蒸餾水 1000ml, pH 7.0~7.2 ；
②二級(jí)三角瓶液體培養(yǎng)
將一級(jí)種子液按照3-5%的接種量接入裝有50-100ml發(fā)酵培養(yǎng)基C的三角瓶中，28-30°C，130-150rpm，培養(yǎng) 15-20 小時(shí)，得到 SGD06-8-33 的二級(jí)種子液；· 所述的培養(yǎng)基C組成為:蔗糖5-10g，淀粉2-3g，豆柏20-30g，KH2PO4 0.2-0.41g, K2HPO4 0.3-0.52 g, CaCl2 0.1-0.2 g, MgSO4.7H20 0.1-0.2 g，Na2MoO4.2H200.0025-0.005 g，水 1000ml, pH 7.0~7.2。
[0018]③三級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵
發(fā)酵罐體積10L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基C 7.0L,滅菌并冷卻后，將二級(jí)培養(yǎng)液按照5-10%的接種量接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為250-280rpm，通風(fēng)比1:(0.4-0.6)，培養(yǎng)48-50小時(shí)，所得即為S⑶06-8-33菌懸液；
2)將秸桿粉、草炭土、稻糠用高速粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，按照質(zhì)量百分比為50-70:20-30:10-20的比例混合，再加入30-50%的發(fā)酵培養(yǎng)基C，再加入一定濃度的鑰酸鈉和硫酸亞鐵，使其中鑰酸鈉含量為0.2^0.5g/Kg，硫酸亞鐵含量為0.05、.08g/Kg,混合均勻后，用布袋或耐高溫塑料袋裝，1-1.5Kg/袋，0.1MPa高壓滅菌2_3小時(shí)，取出冷卻備用。
[0019]3)將步驟I)中得到的S⑶06-8-33菌懸液打入儲(chǔ)液罐即得固氮液體菌劑，將發(fā)酵液按照100-200ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28_30°C吸附發(fā)酵5_7天，達(dá)到每克菌劑中活菌數(shù)不低于IO9CFU,包裝后即得到固體固氮菌劑產(chǎn)品。
[0020]2、微生物菌劑的使用方法
根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于使用方法為:在植物浸種時(shí)或植物移栽時(shí)以50-100倍的液體菌劑稀釋液浸泡種子或植物根部2-4小時(shí)，育苗期或生長期灌根采用200-500倍的液體菌劑稀釋液10-40ml/Kg 土壤劑量澆灌稀釋液，整個(gè)生長期灌根1_3次；固體固氮菌劑作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-20g/Kg 土壤。
[0021]所述的液體菌劑稀釋液為步驟3)所得的固氮液體菌劑與發(fā)酵培養(yǎng)基C按照1:50-100或1:200-500的比例混合制備所得；固體固氮菌劑為步驟3)所得的固體固氮菌劑。
[0022]本發(fā)明土壤桿菌可制備成生物固氮菌肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
1)采用等離子體誘變和紫外誘變多次循環(huán)處理的方法，傳代15次遺傳性狀穩(wěn)定，保證了突變菌株的穩(wěn)定性；
2)提供的自生固氮菌與現(xiàn)有自生固氮菌相比，既具有較高的固氮能力，又具有一定的解磷解鉀能力，能夠分泌吲哚乙酸、產(chǎn)生鐵原子，具有ACC脫胺酶活性等，能夠促進(jìn)植物的生長，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
[0024]3)本發(fā)明的菌劑營養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、易培養(yǎng)、生長周期短、能夠進(jìn)行規(guī)模化的大生產(chǎn)?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0025]圖1:A為S⑶06-8-33在培養(yǎng)基上A的菌落形態(tài)；B為在培養(yǎng)基B上的菌落形態(tài)；C為SGD06-8-33掃描電鏡照片；D為S⑶06-8-33革蘭氏染色照片；
圖2為SGD06-8-33傳代過程中固氮酶活性的穩(wěn)定性測(cè)定；
圖3為施用供試菌劑或肥料后，油菜鮮重、干重和地上部分含氮量的比較，其中A為油菜鮮重比較；B為油菜干重比較；C為油菜地上部分含氮量的比較；
圖4為施用供試菌劑或肥料后，玉米鮮重、干重和地上部分含氮量的比較，其中A為玉米鮮重比較；B為玉米干重比較；C為玉米地上部分含氮量的比較；
圖5為施用供試菌劑或肥料后，芥菜鮮重、干重和地上部分含氮量的比較，其中A為芥菜鮮重比較；B為芥菜干重比較；C為芥菜地上部分含氮量的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027]實(shí)施例1
本發(fā)明固氮菌株采用紫外線-等離子體復(fù)合誘變選育方法獲得，具體步驟如下:
O以實(shí)驗(yàn)室從植物根際篩選的土壤桿菌SGD06作為出發(fā)菌株；
2)誘變選育
(O制備出發(fā)菌株S⑶06的單細(xì)胞懸液
將出發(fā)菌株S⑶06接種于液體培養(yǎng)基A中，28-32°C，120-150rpm培養(yǎng)15-20小時(shí)，離心，用無菌生理鹽水洗滌，置于裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，振蕩，使其分散成單細(xì)胞的菌懸液；
所述的培養(yǎng)基A組成為:酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4.7H200.005-0.01g, Na2MoO4.2H20 0.0025-0.005 g，蒸餾水 1000ml, pH 7.0~7.2。
[0028](2)紫外線誘變
將步驟(1)所得的菌懸液分別調(diào)節(jié)濃度至IO5-1O7個(gè)/ml，取0.1ml分別涂布于無氮固體培養(yǎng)基B上，進(jìn)行紫外誘變，紫外誘變的頻率為10-18W，照射距離為25-50cm，照射時(shí)間5-10min ;28_32°C靜置培養(yǎng)5_7天，各挑選20-30個(gè)較大的單菌落，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，用乙炔還原法測(cè)定各菌株的固氮酶活性，選擇5株固氮酶活性最高的菌株，再分別作搖瓶復(fù)篩，選出一株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株SGD06-8，制成菌懸液用于下一步等離子體的誘變；
所述的無氮固體培養(yǎng)基B組分為:葡萄糖10-20g，KH2PO4 0.2g，MgSO4.7H200.l-0.2g, NaCl 0.15-0.25g, CaSO4.2H20 0.15- 0.25g, CaCO3 5_8g，瓊脂 15_18g，蒸餾水1000ml, pH 7.0~7.2 ；
所述的搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的步驟是:首先對(duì)上述分離得到的20-30個(gè)接種到100ml上述的液體培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)15-20小時(shí)。各取5ml菌液接種到裝有100ml液體培養(yǎng)基D的250ml的錐形瓶中，28°C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后，將棉塞換成橡膠塞，封口膜滴蠟密封，注射器抽取10-15%的空氣，注入10-15%的乙炔氣體，繼續(xù)反應(yīng)，用乙炔還原法測(cè)定固氮酶活性；
所述的液體培養(yǎng)基D所含組分為:葡萄糖10-20 g，KH2PO4 0.2-0.41 g, K2HPO40.3-0.52g, CaCl2 0.1-0.2g, MgSO4.7H20 0.1-0.2g, FeSO4.7H20 0.005-0.01g,Na2MoO4.2H20 0.0025-0.005 g,蒸餾水 1000ml, pH 7.0~7.2。
[0029](3)等離子體誘變
將步驟(2)所得的S⑶06-8菌株，制成IO5-1O7個(gè)/ml的菌懸液，取0.1-0.2ml分別均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到等離子下面的電極上，調(diào)節(jié)上電極的位置，使得上下電極之間的距離控制在3-8_左右，調(diào)節(jié)電壓為3-5V，電流為0.5-0.8A，使空氣或氬氣放電，得到均勻的空氣或氬氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電時(shí)間為2-7min。誘變后立即用無菌生理鹽水或磷酸鹽洗脫，涂布于無氮固體培養(yǎng)基B上，再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，挑出一株固氮酶活性最高的一株菌SGD06-8-33，制成菌懸液用于下一步的誘變；所述的搖瓶復(fù)篩的方法同步驟
(2)。
[0030](4)將步驟(3)所得的S⑶06-8-33菌懸液活菌數(shù)調(diào)至IO5-1O7個(gè)/ml，循環(huán)重復(fù)紫外線誘變一等離子體誘變1-2次，最后得到一株固氮酶活性最高的菌株X.L.Zhu.S⑶06-8-33 (簡(jiǎn)稱 S⑶06-8-33)。
【權(quán)利要求】
1.一種具有自生固氮能力的土壤桿菌，其分類命名為土壤桿菌sp.)X.L.Zhu.S⑶06-8-33,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為 CGMCC N0.5457。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有自生固氮能力的土壤桿菌，其特征在于該菌株具有以下特性:G_，好氧或兼性厭氧，呈長桿狀；在固體培養(yǎng)基A上菌落呈淡黃色，圓形凸起，邊緣整齊，菌落周圍有透明圈，在無氮固體培養(yǎng)基B上菌落呈白色，圓形，中央凹陷，邊緣整齊；其最適的生長溫度28~32 °C，最適的pH值為6.0-8.0，其固氮酶活性為38.92~49.97nmol.mg-1.1T1,解無機(jī)磷能力為322.2mg/l，解鉀能力為38.6 mg/1,產(chǎn)吲哚乙酸的能力為33.25~45.62 μ g/ml，產(chǎn)鐵載體的能力為0.406~0.63，無ACC脫氨酶活性； 所述固體培養(yǎng)基A組成為:酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4.7H200.005-0.01g，Na2MoO4.2Η20 0.0025-0.005 g，瓊脂粉 15_20g，蒸餾水 1000ml, pH 7.0~7.2 ； 所述的無氮固體培養(yǎng)基B組分為:葡萄糖10-20 g,KH2PO4 0.2 g,MgSO4.7Η20 0.1-0.2g，NaCl 0.15-0.25 g，CaSO4.2H20 0.15- 0.25 g，CaCO3 5-8 g，瓊脂 15-18 g，蒸餾水1000ml, pH 7.0~7.2。
3.含有權(quán)利要求1所述土壤桿菌的微生物菌劑。
4.權(quán)利要求3所述微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟: 1)菌種發(fā)酵 ①將凍存的土壤桿菌iAgrobacteriunisp.) X.L.Zhu.S⑶06-8-33在37°C條件下快速解凍，按照0.5-1%的接種量接入裝有10-15ml液體培養(yǎng)基A的試管中，28_30°C，靜置培養(yǎng)15-20小時(shí)，得到一級(jí)種子液； 所述的液體培養(yǎng)基A組成為:酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4.7H200.005-0.01g, Na2MoO4.2H20 0.0025-0.005 g，蒸餾水 1000ml, pH 7.0~7.2 ； ②二級(jí)三角瓶液體培養(yǎng) 將一級(jí)種子液按照3-5%的接種量接入裝有50-100ml發(fā)酵培養(yǎng)基C的三角瓶中，28-30°C，130-150rpm，培養(yǎng)15-20小時(shí)，得到二級(jí)種子液； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基C組成為:蔗糖5-10g,淀粉2-3g，豆柏20-30g, KH2PO4 0.2-0.41g, K2HPO4 0.3-0.52 g, CaCl2 0.1-0.2 g, MgSO4.7H20 0.1-0.2 g, Na2MoO4.2H200.0025-0.005 g，水 1000ml, pH 7.0~7.2 ； ③三級(jí)發(fā)酵罐發(fā)酵 發(fā)酵罐體積10L，加入發(fā)酵培養(yǎng)基C 7.0 L，滅菌并冷卻后，將二級(jí)培養(yǎng)液按照5-10%的接種量接入發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為250-280rpm，通風(fēng)比1:(0.4-0.6)，培養(yǎng)48-50小時(shí)，得菌懸液，即為固氮液體菌劑； 2)將秸桿粉、草炭土、稻糠用高速粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，按照質(zhì)量百分比為20-30:40-60:20-30的比例混合，加入30-50%的發(fā)酵培養(yǎng)基C，再加入鑰酸鈉和硫酸亞鐵，使其中鑰酸鈉含量為0.2^0.5g/Kg，硫酸亞鐵含量為0.05、.08g/Kg，混合均勻后，用布袋或耐高溫塑料袋裝，1-1.5Kg/袋，0.1MPa高壓滅菌2_3小時(shí)，取出冷卻得固態(tài)基質(zhì)； 3)將菌懸液按照100-200ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28_30°C吸附發(fā)酵5-7天，達(dá)到每克菌劑中活菌數(shù)不低于IO9CFU,包裝后即得到固體固氮菌劑。
5.權(quán)利要求1所述土壤桿菌在制備生物固氮菌肥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103789224SQ201310565249
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】朱曉麗, 朱燕云, 董立平 申請(qǐng)人:西北大學(xué)