一種玉米基因組定點(diǎn)改造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米基因組定點(diǎn)改造方法。本發(fā)明的方法包含以下步驟：使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶，然后在向?qū)NA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標(biāo)片段被剪切，再通過玉米細(xì)胞的自身DNA修復(fù)功能，最終實(shí)現(xiàn)玉米目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明方法能夠成功地對(duì)玉米進(jìn)行基因突變。
【專利說明】一種玉米基因組定點(diǎn)改造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種玉米基因組定點(diǎn)改造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米是世界上最重要且廣泛種植的農(nóng)作物之一，對(duì)玉米基因組的改造有利于玉米基因組的研究，對(duì)提高產(chǎn)量，增強(qiáng)其對(duì)病蟲害的抗性和農(nóng)業(yè)發(fā)展有重要意義。目前，玉米突變體的創(chuàng)制和染色體改造主要是通過EMS誘變，物理誘變，轉(zhuǎn)座子插入和染色體工程來獲得，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，盲目性較大。當(dāng)前的植物基因組工程(Genome engineering)技術(shù)中，主要通過鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)來做基因改造，但是這些技術(shù)操作過程復(fù)雜，成本高，技術(shù)難度較大，因此，亟待開發(fā)更加高效、廉價(jià)并且簡單的玉米基因改造新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種玉米基因組定點(diǎn)改造方法。
[0004]本發(fā)明提供的一種實(shí)現(xiàn)玉米目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的基因改造方法，是利用gRNA:Cas9系統(tǒng)在玉米中對(duì)目的基因進(jìn)行改造的，該系統(tǒng)包括向?qū)NA和Cas9核酸酶；該方法包含以下步驟:使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶，然后在向?qū)NA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標(biāo)片段被剪切，再通過玉米細(xì)胞的自身DNA修復(fù)功能，最終實(shí)現(xiàn)玉米目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失；
[0005]所述靶標(biāo)片段位于所述目的基因上；所述雙鏈靶標(biāo)片段中的一條鏈具有如下結(jié)構(gòu):5’ -Nx-NGG-3，，NGG中N表示A、G、C和T中的任一種，Nx中N表示A、G、C和T中的任意種，x=20 ；`
[0006]所述向?qū)NA依次由能夠與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段和骨架RNA片段連接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成類似發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，所述骨架RNA片段可與Cas9核酸酶結(jié)合。
[0007]上述方法中，所述向?qū)NA中能夠與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段為能與所述5’ -Nx-NGG-3’中Nx片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段。
[0008]上述任一所述的方法中，所述向?qū)NA中骨架RNA片段是由SEQ ID N0.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示DNA轉(zhuǎn)錄出來的RNA。
[0009]上述任一所述的方法中，所述使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶的方法為:向玉米組織中直接轉(zhuǎn)入所述向?qū)NA和帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶。
[0010]上述任一所述的方法中，所述使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶的方法為:向玉米組織中導(dǎo)入含有所述向?qū)NA的表達(dá)盒的重組克隆載體和含有所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達(dá)載體，所述向?qū)NA的表達(dá)盒在玉米組織中表達(dá)出向?qū)NA，所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因在玉米組織中表達(dá)出帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶。
[0011]上述任一所述的方法中，所述向?qū)NA的表達(dá)盒由U3啟動(dòng)子和所述向?qū)NA的編碼基因組成；所述向?qū)NA的編碼基因由所述能夠與所述靶標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段的編碼基因和所述骨架RNA片段的編碼基因組成。
[0012]上述任一所述的方法中，所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因中，所述Cas9核酸酶的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示；
[0013]所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因的核苷酸序列具體如SEQ IDN0.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示；
[0014]所述玉米組織具體為玉米原生質(zhì)體。
[0015]一種用于實(shí)現(xiàn)玉米目的基因的靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的基因改造試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下(I)和(2 ):
[0016](I)SEQ ID N0.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的編碼基因、或SEQ ID N0.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因、含有SEQ ID N0.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達(dá)載體、或含有SEQ ID N0.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達(dá)載體；
[0017](2)含有如下DNA片段的重組克隆載體:依次由U3啟動(dòng)子、兩個(gè)BbsI酶切位點(diǎn)和骨架RNA片段的編碼DNA依 次連接而成；
[0018]所述骨架RNA片段的編碼DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示。
[0019]上述試劑盒中，所述(2)中所述DNA片段如SEQ ID N0.3中自5’末端起第I位至第876位核苷酸所示。
[0020]本發(fā)明的方法能夠成功地對(duì)玉米進(jìn)行定點(diǎn)改造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為gRNA:Cas9系統(tǒng)對(duì)玉米內(nèi)源基因ZmIPK的target-sgRNA-l定點(diǎn)突變結(jié)果。
[0022]圖2為gRNA:Cas9系統(tǒng)對(duì)玉米內(nèi)源基因ZmIPK的target_sgRNA_2定點(diǎn)突變結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0025]表達(dá)載體pJIT163 在文獻(xiàn) “Guerineau, F., Lucy, A.&Mullineaux, P.Effect oftwo consensus sequences preceding the translation initiator codon on geneexpression in plant protoplasts.Plant Molecular Biologyl8，815-818 (1992)，，中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0026]pEasy-Blunt載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0027]玉米品種HiII 在文獻(xiàn)“Armstrong，C.L，Green, C.Ε.&Phillips，R.L Developmentand availability of germplasm with high type II culture formation response.MaizeGenet.Coop.News Lett.65, 92 - 93 (1991) ”中公開過,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。
[0028]玉米原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化所用溶液如表1-表5所示。
[0029]表150ml酶解液
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種實(shí)現(xiàn)玉米目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的基因改造方法，是利用gRNA:Cas9系統(tǒng)在玉米中對(duì)目的基因進(jìn)行改造的，該系統(tǒng)包括向?qū)NA和Cas9核酸酶；該方法包含以下步驟:使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶，然后在向?qū)NA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的雙鏈靶標(biāo)片段被剪切，再通過玉米細(xì)胞的自身DNA修復(fù)功能，最終實(shí)現(xiàn)玉米目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失； 所述靶標(biāo)片段位于所述目的基因上；所述雙鏈靶標(biāo)片段中的一條鏈具有如下結(jié)構(gòu):5，-NX-NGG-3，，NGG中N表示A、G、C和T中的任一種，Nx中N表示A、G、C和T中的任意種，x=20 ； 所述向?qū)NA依次由能夠與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段和骨架RNA片段連接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成類似發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，所述骨架RNA片段可與Cas9核酸酶結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述向?qū)NA中能夠與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段為能與所述5’ -Nx-NGG-3’中Nx片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述向?qū)NA中骨架RNA片段是由SEQ ID N0.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示DNA轉(zhuǎn)錄出來的RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶的方法為:向玉米組織中直接轉(zhuǎn)入所述向?qū)NA和帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述使玉米組織中含有向?qū)NA和Cas9核酸酶的方法為:向玉米組織中導(dǎo)入含有所述向?qū)NA的表達(dá)盒的重組克隆載體和含有所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達(dá)載體，所述向?qū)NA的表達(dá)盒在玉米組織中表達(dá)出向?qū)NA，所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因在玉米組織中表達(dá)出帶有核定位信號(hào)肽的Cas9`核酸酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法,其特征在于:所述向?qū)NA的表達(dá)盒由U3啟動(dòng)子和所述向?qū)NA的編碼基因組成；所述向?qū)NA的編碼基因由所述能夠與所述靶標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段的編碼基因和所述骨架RNA片段的編碼基因組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因中，所述Cas9核酸酶的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示； 所述帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因的核苷酸序列具體如SEQ ID N0.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示； 所述玉米組織具體為玉米原生質(zhì)體。
8.一種用于實(shí)現(xiàn)玉米目的基因的靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的基因改造試劑盒，包括如下(I)和(2): (I)SEQ ID N0.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的編碼基因、或SEQ ID N0.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因、含有SEQ ID N0.1中自5’末端起第37-4161位核苷酸所示Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達(dá)載體、或含有SEQ ID N0.1中自5’末端起第7-4212位核苷酸所示的帶有核定位信號(hào)肽的Cas9核酸酶的編碼基因的重組表達(dá)載體；(2)含有如下DNA片段的重組克隆載體:依次由U3啟動(dòng)子、兩個(gè)BbsI酶切位點(diǎn)和骨架RNA片段的編碼DNA依次連接而成； 所述骨架RNA片段的編碼DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.3中自5’末端起第787-870位核苷酸所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于:所述(2)中所述DNA片段如SEQ IDN0.3中自5’末端起第I位至第876位核苷酸所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103667338SQ201310625372
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】高彩霞, 梁振, 陳坤玲 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所