一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明采用人胃癌細(xì)胞BGC-823為誘導(dǎo)對(duì)象，采用大劑量沖擊法，后采用逐步遞增ADR濃度、間歇作用的體外誘導(dǎo)法，建立了人胃癌細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞株人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR該細(xì)胞株已經(jīng)于2013年11月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNO.8454。本發(fā)明的細(xì)胞株具有典型多藥耐藥特性，為進(jìn)一步研究耐藥逆轉(zhuǎn)途徑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種人類細(xì)胞株，具體涉及一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，致死率居各類腫瘤的第二位，我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，胃癌年患病率和死亡率均為世界平均水平的2倍多。
[0003]由于早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率低，大約2/3患者的病情在確診時(shí)已屬于進(jìn)展期胃癌，而單純性手術(shù)治療常難以根治，化療在綜合治療中發(fā)揮了重要作用，因此成為治療胃癌的主要方法之一。但鑒于多藥耐藥(multi drug resistance, MDR)對(duì)胃癌化療的影響,相當(dāng)一部分病例化療效果不理想。故研究胃癌的多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制對(duì)提高胃癌的化療效果、延長(zhǎng)病人的生存期有著重要的意義。
[0004]多藥耐藥是指腫 瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥?？朔[瘤多藥耐藥性，尋找逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的新途徑，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性是當(dāng)前腫瘤領(lǐng)域的重要課題之一。成功建立耐藥腫瘤細(xì)胞模型是開(kāi)展此研究的前提和基礎(chǔ)。
[0005]瘤細(xì)胞耐藥株的建立方法通常有兩種，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導(dǎo)法，二是大劑量沖擊法。通過(guò)耐藥細(xì)胞株的建立可以進(jìn)一步構(gòu)建體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，從而深入研究MDR耐藥機(jī)制，甚至發(fā)現(xiàn)其他新的耐藥機(jī)制。通過(guò)耐藥細(xì)胞株的建立的體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，可以用于抗腫瘤藥物的篩選。
[0006]通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于以人胃癌細(xì)胞BGC-823為誘導(dǎo)對(duì)象，建立人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株及其建立方法。本發(fā)明的細(xì)胞株具有典型多藥耐藥特性，為進(jìn)一步研究耐藥逆轉(zhuǎn)途徑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[0008]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明采用人胃癌細(xì)胞株BGC-823為誘導(dǎo)對(duì)象，前期誘導(dǎo)采用大劑量沖擊法，后期誘導(dǎo)采用持續(xù)誘導(dǎo)法，建立了一種人胃癌細(xì)胞阿霉素耐藥株BGC-823/ADR。該細(xì)胞株已經(jīng)于2013年12月24日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.8454。
[0010]具體地，本發(fā)明涉及的人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR是按照如下方法建立獲得:
[0011](I)人胃癌細(xì)胞株BGC-823用培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液)，5% C02, 37°C條件下，培養(yǎng)至70%~90 %貼壁率時(shí)，去上清，加入ADR50ng/ml沖擊培養(yǎng)I小時(shí)，去ADR50ng/ml培養(yǎng)液，空白R(shí)PM1-1640培養(yǎng)液洗滌2次后，更換增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)72_96h擴(kuò)增存活細(xì)胞。至存活細(xì)胞擴(kuò)增至70%~90%貼壁率時(shí)，再重復(fù)用ADR1000ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時(shí)9次，即總共完成10次ADR50ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時(shí)，進(jìn)一步以此細(xì)胞為基礎(chǔ)，1000ng/ml持續(xù)培養(yǎng)7天。
[0012](2)重復(fù)上述操作，將篩選條件依次改為ADR100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培養(yǎng)液。
[0013]本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線和群體倍增時(shí)間測(cè)定、藥物敏感試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)Rh-123研究及細(xì)胞周期的測(cè)定，評(píng)價(jià)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR的生物學(xué)特性，結(jié)果成功建立了 BGC-823/ADR耐藥株，耐藥指數(shù)為55.635，對(duì)順鉬(cDPP)、紫杉醇(Taxo I)、長(zhǎng)春新堿(YCR)、氟尿嘧啶(5-FU )和依托泊苷(VP16 )產(chǎn)生了明顯的交叉耐藥性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為BGC-823、BGC-823/ADR的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。
[0015]圖2為BGC-823細(xì)胞株的細(xì)胞周期圖
[0016]圖3為BGC-823/ADR細(xì)胞株的細(xì)胞周期圖
[0017]圖4為羅丹明123在BGC-823細(xì)胞內(nèi)的含量圖
[0018]圖5為羅丹明123在BGC-823/ADR細(xì)胞內(nèi)的含量圖
[0019]圖6為本發(fā)明BGC-823/ADR細(xì)胞株的顯微圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)施例僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明方法的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0021]實(shí)施例1人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR的誘導(dǎo)建立
[0022]采用逐步遞增ADR濃度、間歇作用的體外誘導(dǎo)法建立人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR，具體步驟如下:
[0023]((I)人胃癌細(xì)胞株BGC-823用培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液)，5% C02,37°C條件下，培養(yǎng)至70%~90%貼壁率時(shí)，去上清，加入ADR50ng/ml沖擊培養(yǎng)I小時(shí)，去ADR50ng/ml培養(yǎng)液，空白R(shí)PM1-1640培養(yǎng)液洗滌2次后，更換增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)72_96h擴(kuò)增存活細(xì)胞。至存活細(xì)胞擴(kuò)增至70%~90%貼壁率時(shí)，再重復(fù)用ADR1000ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時(shí)9次，即總共完成10次ADR50ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時(shí)，進(jìn)一步以此細(xì)胞為基礎(chǔ)，1000ng/ml持續(xù)培養(yǎng)7天。
[0024](2)重復(fù)上述操作，將篩選條件依次改為ADR100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培養(yǎng)液。
[0025](3)敏感細(xì)胞逐漸死亡，而耐藥細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。如此反復(fù)誘導(dǎo)、換液、傳代，歷時(shí)約6月，最終得到在800ng / mL ADR中穩(wěn)定生長(zhǎng)增殖的耐藥株，命名為BGC-823/ADR。將該細(xì)胞凍存2月后復(fù)蘇，在不含ADR的培養(yǎng)液中反復(fù)傳代2月以上仍基本保持原來(lái)的耐藥性。
[0026]實(shí)施例2耐藥株形態(tài)學(xué)觀察
[0027]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC-823/ADR，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖6所示:細(xì)胞形態(tài)變大，核皺縮，細(xì)胞易堆積成團(tuán)。[0028]實(shí)施例3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定
[0029]細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為5 X 103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液(每孔500個(gè)細(xì)胞);6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2d、4d、6d、8d、IOd ;將96孔板進(jìn)行MTT染色，λ =490nm,測(cè)定OD值；每孔加入20 μ L MTT(5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μ L DMSO溶解，搖床10分鐘輕輕地混勻；λ =490nm,酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。BGC-823、BGC-823/ADR的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。
[0030]實(shí)施例4、PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期
[0031]用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細(xì)胞；用4°C保存的0.01M PBS洗滌細(xì)胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室溫離心5min,重懸于冷PBSlml,備用；用流式細(xì)胞儀檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，接收波長(zhǎng)為575nm。結(jié)果顯示，BGC-823G1期、S期、G2期細(xì)胞分別為70.96%、16.09%、12.95%, BGC-823/ADR Gl 期、S 期、G2 期細(xì)胞分別為 38.32%,28.91%,32.78%,BGC-823/ADR Gl期細(xì)胞減少，G2期、S期細(xì)胞增多，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。
[0032]實(shí)施例5流式細(xì)胞儀檢測(cè)羅丹明123蓄積
[0033]用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細(xì)胞；用4°C保存的0.01M PBS洗滌細(xì)胞3次，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1父1071111，每管加入濃度為5呢/1111的羅丹明123500uL，37°C保溫30min，500rpm離心2min，去除培養(yǎng)液，再用新培養(yǎng)液洗去細(xì)胞外的羅丹明染料，在37°C保溫IOmin,使P-gp糖蛋白功能得以發(fā)揮，把藥物泵出，再用培養(yǎng)液洗I次，放在冰冷的培養(yǎng)液中待檢測(cè)，流式細(xì)胞儀用488nm的激發(fā)光，測(cè)試細(xì)胞熒光強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。BGC-823細(xì)胞熒光強(qiáng)度為7727，BGC-823/ADR細(xì)胞熒光強(qiáng)度為113，BGC-823/ADR細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞羅丹明123比BGC-823減少。
[0034]實(shí)施例6藥物敏感試驗(yàn)
[0035]細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、配制成濃度為I X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入IOOul細(xì)胞懸液(每孔IX IO4個(gè)細(xì)胞)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μ L相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，(4)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；將96孔板進(jìn)行MTT染色，λ =490nm,測(cè)定OD值；計(jì)數(shù)各組別抑制率及藥物IC50。
[0036]試驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)表1。根據(jù)表1的結(jié)果可以看出，BGC-823/ADR對(duì)阿霉素、氟尿嘧啶、順鉬、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、依托泊苷的耐藥指數(shù)是55.635,5.631,4.323,5.171,2.841、
3.177。
[0037]表1細(xì)胞株對(duì)各種化療藥物的IC50和耐藥指數(shù)
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種人胃癌細(xì)胞阿霉素耐藥 株BGC-823/ADR，保藏號(hào)為CGMCC N0.8454。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK103740646SQ201310627417
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司