專利名稱：纖維化纖維單胞菌、水解酶及其在紫杉烷轉化方面的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物化學技術領域，具體涉及一種水解紫杉烷木糖苷的微生物 并用其制備紫杉醇及其類似物的方法。
背景技術：
紫杉烷是一類二萜化合物，其中紫杉醇(Paclitaxd,式II)和多烯紫杉 醇(Docetaxel)，作為臨床一線用藥而廣泛應用于多種腫瘤的治療。目前，生 產(chǎn)紫杉醇的途徑主要有(l)從紅豆杉植物中直接提取紫杉醇；(2)半合成法 —從紅豆杉屬植物中提取分離到具有紫杉醇母核結構的化合物，再用化 學方法半合成紫杉醇、多烯紫杉醇等。這類具有紫杉醇母核結構的化合物
主要包括巴卡亭m以及io-去乙酰巴卡亭m (簡寫io-DABni)。
其中Ph是苯基，Ac是乙?；?，Bz是苯甲酰基。
除了上面提到的巴卡亭m以及10DAB，在紅豆杉屬植物中，還廣泛存 在另一類具有紫杉醇母核結構的化合物，即C-7木糖基的紫杉垸，如7-木 糖紫杉醇(XT)， 10-去乙酰-7-木糖紫杉醇(IO-DAXT)， 10-去乙酰-7-木糖
三尖杉寧堿(10-DAXC), 10-去乙酰-7-木糖紫杉醇C (IO-DAXTC)，這類化
合物可以通過生物或/和化學手段去除木糖基，產(chǎn)生紫杉醇或C-7羥基的紫 杉烷化合物，而后者可以作為制備具有抗癌活性紫杉垸的重要中間體，從 而達到對紅豆杉資源的有效利用。因此，C-7木糖基的去除已成為有效利用 這類化合物的關鍵因素。
目前針對C-7紫杉烷木糖苷糖基的去除方法主要有化學法和生物法?；?學法是首先利用高碘酸鹽將木糖氧化為半縮醛，然后在酸性條件下將其水 解獲得C-7羥基的紫杉垸(US5412116, US6028206, US5856532 ， US6437154)。該方法需要兩步反應才能去除C-7位木糖基，導致收率普遍 很低(〈50%)。此外，由于化學法用到水合肼等劇毒物質，如產(chǎn)業(yè)化，會 對環(huán)境造成嚴重污染。
而生物法因其對環(huán)境友好，越來越引起人們的廣泛關注。歐洲專利 95300135.1公開了使用Moraxellasp.(莫氏桿菌)、Bacillus macerans (浸麻 芽孢桿菌)、Bacillus circulans (環(huán)狀芽孢桿菌)和Micrococcus sp.(微球菌)水 解紫杉烷木糖苷糖基的方法。其中莫氏桿菌的轉化能力較強，62.5mg莫氏 桿菌(來自于20ml發(fā)酵液)可在7小時內將0.5mg 7-木糖-10-去乙酰紫杉 醇完全轉化為10-去乙酰紫杉醇(Biotechnol Appl Biochem 1997,26, 153-158)。除此之外，未見其它相關報道
現(xiàn)存技術中的微生物的產(chǎn)酶量普遍偏低，且均為胞內酶，導致水解效 率降低，同時菌體容易對底物和產(chǎn)物產(chǎn)生吸附，因此不適合工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供了能有效轉化紫杉烷木糖苷為紫杉醇或其類似物的
纖維化纖維單胞菌及其水解酶，并提供了一種新的通過生物轉化反應制備 紫杉醇及其類似物的有效方法。
本發(fā)明提供了一種水解酶，系由纖維化纖維單胞菌(CW/"/a >m'croW"/ 代謝產(chǎn)生的。
本發(fā)明提供的水解酶用于轉化C-7紫杉烷木糖苷為紫杉醇或其類似物。 本發(fā)明還提供了一種紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法以C-7 位紫杉烷木糖苷為原料，用纖維化纖維單胞菌(Ce//M/os/m/cro6/"w ^//"/cww)釋放產(chǎn)生的水解酶，進行水解，去除C-7位木糖基，得到紫杉醇 或其類似物。
本發(fā)明提供的上述紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法中，水解的 反應條件為將原料按0.1-2g/L加入所述的水解酶中，溫度為20-40度， pH 6.0-8.0，反應時間3-48h。
本發(fā)明提供了原料C-7紫杉烷木糖苷類化合物具有式I所示結構通式
其中I^為H或乙?；?；R2和R3相同或者不同，為^T或"OT;其中T 為H，芳基，芳烷基，C1至C20的直鏈、支鏈或環(huán)型烴基，及上述三種烴 基的取代物，取代基包括羥基、Cl至C8的垸氧基、縮醛、縮酮、鹵素、 硝基或氨基。
本發(fā)明提供了紫杉垸木糖苷類化合物的原料，是天然產(chǎn)物來源的在C-7
位含有木糖基的紫杉烷類化合物的單體或其混合物，或者經(jīng)由生物合成， 化學半合成或全合成手段獲得的在上述位置含有木糖基的紫杉烷。
本發(fā)明提供的紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法中，所述的水解 酶在游離狀態(tài)下使用，或者將其用物理吸附或誘捕方法固定在支持物上使 用。
本發(fā)明提供了一種纖維化纖維單胞菌(Ce//"/ow'mfcra6/"w XZ-5 CCTCC No. M 207130新菌種。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人對多個地區(qū)的土壤微生物轉化活性進 行了篩選，發(fā)現(xiàn)纖維化纖維單胞菌都能產(chǎn)生分泌型木糖苷酶，水解紫杉烷 木糖苷，得到紫杉醇及其類似物。但是從浙江義烏地區(qū)紅豆杉根部土壤中 獲得的纖維化纖維單胞菌(CW/M/ow>m'croWwwce//i//ara) XZ-5 CCTCC No. M 207130新菌株的生物轉化活性最強，它能夠高水平產(chǎn)生分泌型木糖苷 酶，對紫杉烷木糖苷進行水解，得到紫杉醇及其類似物。
本發(fā)明所涉及的纖維化纖維單胞菌，如CCTCC M207130, AS1.2019, AS1.1938, AS1.1920, ACCCOIOI，其特征在于:生長周期的初期產(chǎn)生菌 絲體，后期破碎；培養(yǎng)基耗盡后，棒狀菌體轉化成短桿甚至球形細胞；在 蛋白胨酵母提取物-葡萄糖瓊脂平板上，菌落為圓形，直徑0.9 5.0mm，黃 白色突起，反光，邊緣整齊。下列物質均可以作為唯一碳源葡萄糖、甘 露糖、麥芽糖、蔗糖、D-木糖、甘油、纖維二糖、乳糖、L-乳酸鹽、醋酸 鹽、丙酮酸鹽、丙酸鹽、戊酸鹽、脯氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、組氨酸。 而蜜三糖、DL-蘋果酸和D-乳酸鹽不能作為唯一碳源；觸酶陽性；肽聚糖 中含L-賴氨酸，內肽橋由D-Ser—D-Asp， typeA4a組成；細胞壁的主要糖
組分為鼠李糖，而巖藻糖和半乳糖是次要成分；主要甲基萘醌為MK-9(H4)， 而MK-9(H2)、 MK-8(H4)和MK-7(H4)是次要組分；基因組DNA的G-C含 量為74mol%。
本發(fā)明所涉及的纖維化纖維單胞菌(Ce//w/ow>w'cTO&MW ce//M/ara) XZ-5,此菌株已于2007年8月保藏在武漢中國微生物典藏中心，保藏編號 為CCTCC No. M 207130。
生物學純的微生物纖維化纖維單胞菌，是新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)卩-木糖苷酶的微 生物。這種微生物的突變體，例如經(jīng)化學的、物理的(如紫外輻射)或生 物學方法(如分子生物學技術)改造以用于水解反應的突變菌株，也在本 發(fā)明的考慮范圍內。
本發(fā)明應用的酶是水解酶，尤其是木糖苷酶。本發(fā)明提供的微生物產(chǎn) 生上述酶，可用提取和純化的方法分離它們。本發(fā)明提供的微生物經(jīng)遺傳 工程改良后的形式也在本發(fā)明考慮范圍內。宿主細胞可以是任何細胞，如 大腸桿菌，將本發(fā)明提供的微生物的一個基因或一組基因轉入宿主，使其 表達催化水解反應所需的一個酶或多個酶。
本發(fā)明所涉及到的原料為具有式I所示結構通式的紫杉烷木糖苷類化
合物
其中R,為H或乙?；籖2和R3相同或者不同，為^T或"OT;其中
T為H，芳基，芳烷基，C1至C20的直鏈、支鏈或環(huán)型烴基，及上述三種 烴基的取代物，取代基包括羥基、C1至C8的烷氧基、縮醛、縮酮、鹵素、 硝基或氨基。
特別之處在于，紫杉烷木糖苷類化合物既可以是天然產(chǎn)物，也可以經(jīng)由 生物合成，或者化學半合成或全合成手段獲得的在C-7位含有木糖基的紫 杉烷，如7-木糖紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖巴卡亭m， 7-木 糖-10-去乙酰巴卡亭m， 7-木糖三尖杉寧堿，7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿， 7-木糖紫杉醇C或7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C以及7-木糖-10-去乙酰巴卡亭 III等等。
本發(fā)明提供的水解方法已考慮到具有分子結構I的化合物的手性中心 的所有立體構型，這些立體異構體或者單獨被水解，或者與其它立體異構 體混合在一起被水解。
本發(fā)明提供的方法使得被水解紫杉烷的C-7基團的立體構型優(yōu)先保留 于產(chǎn)品中。C-7取代基的絕對立體構型與紫杉醇C-7羥基的絕對立體構型相 同。
本發(fā)明提供的水解方法可以在微生物發(fā)酵后進行(兩階段發(fā)酵和水 解)，也可以與發(fā)酵同時進行(單階段原位發(fā)酵和水解)，或將酶固定到固 體支持物上(如陰離子交換劑)，再進行水解反應。
用本發(fā)明提供的方法產(chǎn)率超過90%,可特異性選擇C-7位進行水解。 根據(jù)水解產(chǎn)物的特征，可以通過單獨使用或適宜地聯(lián)合使用以下方法 進行純化如有機溶劑萃取法、吸附一解吸法、沉淀法、重結晶法等。例
如，使用乙酸乙酯將水解產(chǎn)物從反應液中萃取出來，在減壓條件下濃縮所 得的有機層，將所得的濃縮物吸附在硅膠柱上，然后使用氯仿-甲醇、己烷 -乙酸乙酯或己烷-丙酮的混合溶劑體系進行色譜層析。此外，如有需要，還 可以將含有水解產(chǎn)物的部分從諸如乙酸乙酯或甲醇的有機溶劑中結晶出 來。
本發(fā)明所述的方法，可以高效、廉價、環(huán)保的制備紫杉醇及其類似物， 為充分利用紫杉烷資源提供了 一條適應工業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。
具體實施例方式
下列實施例是為了進一步說明本發(fā)明，而不是要限制其范圍。
實施例1:纖維化纖維單胞菌CCTCC No. M 207130水解7-木糖紫杉醇
使用含1%甘油，0.2%蛋白胨，0.2%酵母提取物，0.2%磷酸氫二鉀的 培養(yǎng)基(滅菌前pH7.0)作為種子培養(yǎng)基。
將上述種子培養(yǎng)基20ml分配到100ml錐形瓶中，在120度下滅菌 15min，將1接種環(huán)的纖維化纖維單胞菌XZ-5菌株的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種 到其中，并在30度下振蕩培養(yǎng)2天作為種子液。
500ml Erienmeyer培養(yǎng)瓶中放入100ml含1%淀粉,0.2%酵母浸膏，0.2% 氯化銨，0.1% NaH2PO4和0.1。/。 Na2HP04的培養(yǎng)基，pH 7，高壓滅菌121 度30min。將lml種子液接種于此培養(yǎng)基，150rpm， 3(TC搖瓶培養(yǎng)5天。 離心收集上清液，即為粗酶液。
在0.9ml粗酶液中加入lml 50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7)，再加入O.lml 7-木糖-紫杉醇的甲醇溶液(濃度為5mg/ml)。 100rpm， 3(TC混勻5小時。加 入2ml甲醇終止反應，15000轉/分離心2分鐘取上清液進行HPLC分析。
反應液中無7-木糖-紫杉醇殘留，并產(chǎn)生0.42mg紫杉醇(產(chǎn)率94%)。 HPLC 方法
色譜柱KromasilODS (4.6x200mm， 5,) 流動相甲醇:水(60: 40) 流速lml/min
柱溫室溫
檢測波長227 nm 實施例2:纖維化纖維單胞菌CCTCC No. M 207130水解7-木糖-10-去 乙酰紫杉醇及產(chǎn)物的純化
將10ml 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液(濃度為5mg/ml)加入到 90ml實施例1所述的粗酶液中，50rpm， 3(TC下反應20小時后，加入20ml 乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并上層有機相，減壓蒸干，獲得固體物質 105mg,上硅膠柱(20g)并用氯仿:甲醇(98:2)進行洗脫，得到40mg 10-去乙酰紫杉醇(產(chǎn)率91%)。
實施例3:纖維化纖維單胞菌CCTCC No. M 207130水解混合紫杉烷木 糖苷及產(chǎn)物的提純
2000ml Erle證eyer培養(yǎng)瓶中放入500ml含1%樺木木聚糖，0.5%尿素， 0.2WKH2PO4和0.1。/。K2HPO4的培養(yǎng)基，pH 7,高壓滅菌30min。將10ml 實施例1所述的種子液接種于此培養(yǎng)基，200rpm, 3(TC搖瓶培養(yǎng)2天。離 心收集上清液，-20度冷凍保存待用。將200ml含有7-木糖-10-去乙酰紫杉 醇，7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C的混合物(從 天然紅豆杉提取物中分離，含量分別為65%, 9.9%, 3.3%)的甲醇溶液
(5mg/ml)加入到2000ml如前所述的粗酶液中，50rpm， 35'C下反應8小 時。反應液用乙酸乙酯萃取三次,每次200ml，合并有機相蒸干溶解于100ml 甲醇中，用上述HPLC方法進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)其中無三種帶木糖基的底 物殘留，得到的產(chǎn)物中10-去乙酰紫杉醇，10-去乙酰三尖杉寧堿，10-去乙 酰紫杉醇C的含量分別503mg， 77mg， 26mg，回收率達到卯％。
實施例4:纖維化纖維單胞菌CCTCC No. M 207130固定化酶水解混合 紫杉垸木糖苷
將1L如實施例1所述的粗酶液加入到100ml經(jīng)預先處理過的DE52 陰離子交換填料中，充分混合后，離心棄上清液，再用50mM磷酸鉀緩沖 液(pH 7)洗滌填料，再次離心，將沉淀重新懸浮在200ml上述磷酸緩沖 液中，即為固定化酶。向其中加入20ml如實施例3所述的紫杉烷木糖苷 的混合物，12rpm， 28"C反應2小時。5000轉/分離心5分鐘取上清液，用 乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并有機相蒸干溶解于10ml甲醇中，用 上述HPLC方法進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)其中無三種帶木糖基的底物殘留，產(chǎn) 物中10-去乙酰紫杉醇，10-去乙酰三尖杉寧堿，IO-去乙酰紫杉醇C的含量 分別51.5mg， 7.9mg， 2.6mg，回收率達到92%。
實施例5:纖維化纖維單胞菌AS1.1920水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 將1接種環(huán)的纖維化纖維單胞菌AS1.1920的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種到 20ml實施例1所述的種子培養(yǎng)基中，并在30度下振蕩培養(yǎng)2天作為種子 液。
500mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中放入100ml含l。/。麩皮，0.5%硝酸鉀，0.1% NaH2PO4和0.1WNa2HPO4的培養(yǎng)基，pH7，高壓滅菌121度30min。將lml
種子液接種于此培養(yǎng)基，150rpm， 30'C搖瓶培養(yǎng)5天。離心收集上清液， 即為粗酶液。
在9ml上清液中加入10ml50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)，再加入lml 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的甲醇溶液(濃度為5mg/ml)。 100rpm， 3(TC混勻8 小時。加入20ml甲醇終止反應，15000轉/分離心2分鐘取上清液進行HPLC 分析。反應液中無7-木糖-10-去乙酰紫杉醇殘留，并產(chǎn)生4,2mg 10-去乙酰 紫杉醇(產(chǎn)率98%)。
實施例6:纖維化纖維單胞菌AS1.1938水解混合紫杉垸木糖苷 將1接種環(huán)的纖維化纖維單胞菌AS1.1938的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種到 20ml實施例1所述的種子培養(yǎng)基中，并在30度下振蕩培養(yǎng)2天作為種子 液。
500ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中放入100ml含1%樺木木聚糖，0.2%酵母浸 膏，0.2%氯化銨，0.ln/。NaH2PO4和0.in/。Na2HPO4的培養(yǎng)基，pH6，高壓滅 菌121度30min。將lml種子液接種于此培養(yǎng)基，150rpm， 3(TC搖瓶培養(yǎng)5 天。離心收集上清液，即為粗酶液。
將10ml含有7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿， 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C的混合物的甲醇溶液(5mg/ml)加入到100ml 如前所述的粗酶液中，50 rpm， 35"C下反應8小時。反應液中加入100ml 甲醇溶液，進行HPLC檢測，發(fā)現(xiàn)其中無三種帶木糖基的底物殘留，分別 產(chǎn)生25mg 10-去乙酰紫杉醇，38mg 10-去乙酰三尖杉寧堿，13mg 10-去乙 酰紫杉醇C，回收率達到90%。
實施例7:纖維化纖維單胞菌AS1.2019水解7-木糖-10-去乙酰巴卡亭
III
將1接種環(huán)的纖維化纖維單胞菌AS1.2019的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種到 20ml實施例1所述的種子培養(yǎng)基中，并在30度下振蕩培養(yǎng)2天作為種子 液。
500ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中放入100ml含1%麩皮，0.4%酵母浸膏， 0.ly。NaH2PO4和0.in/。Na2HPO4的培養(yǎng)基，pH8，高壓滅菌121度30min。 將lml種子液接種于此培養(yǎng)基，150rpm， 30'C搖瓶培養(yǎng)5天。離心收集上 清液，即為粗酶液。
0.05ml含0.5mg 7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III的溶液加入0.9ml粗酶液 和lml 50 mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中，80rpm， 30'C下反應10小時。加 入2ml甲醇終止反應，離心后取上清液進行HPLC分析。檢測到10-去乙酰 巴卡亭III0.39mg (產(chǎn)率98%)。
實施例8:纖維化纖維單胞菌ACCC01019水解7-木糖紫杉醇
將1接種環(huán)的纖維化纖維單胞菌ACCC01019的瓊脂斜面培養(yǎng)物接種到 20ml實施例1所述的種子培養(yǎng)基中，并在30度下振蕩培養(yǎng)2天作為種子 液。
500ml Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中放入100ml含1%樺木木聚糖，0.2%酵母浸 膏，0.2%氯化銨，0.1。/。NaH2PO4和0.P/。Na2HPO4的培養(yǎng)基，pH 7,高壓 滅菌121度30min。將lml種子液接種于此培養(yǎng)基，150rpm， 30'C搖瓶培 養(yǎng)5天。離心收集上清液，即為粗酶液。
在0.9ml上清液中加入lml 50 mM磷酸鉀緩沖液(pH 7),再加入O.lml 7-木糖-紫杉醇的甲醇溶液(濃度為5mg/ml)。 100rpm, 3(TC混勻7小時。加入2ml甲醇終止反應，15000轉/分離心2分鐘取上清液進行HPLC分析。 反應液中無7-木糖-紫杉醇殘留，并產(chǎn)生0.42mg紫杉醇(產(chǎn)率94%)。
權利要求
1、一種水解酶，系由纖維化纖維單胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)代謝產(chǎn)生的。
2、 權利要求1所述水解酶用于轉化C-7紫杉烷木糖苷為紫杉醇或其類 似物。
3、 一種紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法，其特征在于以C-7 位紫杉烷木糖苷為原料，用纖維化纖維單胞菌(Ce/Mow'wZcro^wm ^//"/a附)釋放產(chǎn)生的水解酶，進行水解，去除C-7位木糖基，得到紫杉醇 或其類似物。
4、 按照權利要求3紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法，其特征在 于水解的反應條件為將原料按0.1-2g/L加入所述的水解酶中，溫度為2040 度，pH6.0-8.0,反應時間3-48h。
5、 按照權利要求3所述紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法，其特 征在于所述C-7紫杉垸木糖苷類化合物具有式I所示結構通式其中Ri為H或乙酰基；R2和R3相同或者不同，為一T或^OT;其中T 為H，芳基，芳垸基，C1至C20的直鏈、支鏈或環(huán)型烴基，及上述三種烴 基的取代物，取代基包括羥基、Cl至C8的烷氧基、縮醛、縮酮、鹵素、 硝基或氨基。
6、 按照權利要求3紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法，其特征在 于所述紫杉烷木糖苷類化合物原料，是天然產(chǎn)物來源的在C-7位含有木 糖基的紫杉垸類化合物的單體或其混合物，或者經(jīng)由生物合成，化學半合 成或全合成手段獲得的在上述位置含有木糖基的紫杉垸。
7、 按照權利要求3紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法，其特征在 于所述的水解酶在游離狀態(tài)下使用，或者將其用物理吸附或誘捕方法固 定在支持物上使用。
8、 一種纖維化纖維單胞菌(Ce//w/ow>m'cToZ^/w ce//i//^w) XZ-5 CCTCC No. M 207130。
全文摘要
本發(fā)明提供了有效轉化紫杉烷木糖苷為紫杉醇或其類似物的纖維化纖維單胞菌及其水解酶，并提供了一種新的通過生物轉化反應制備紫杉醇及其類似物的有效方法。此方法可以高效、廉價、環(huán)保的制備紫杉醇及其類似物，為充分利用紫杉烷資源提供了一條適應工業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。
文檔編號C12N9/14GK101381708SQ200710012698
公開日2009年3月11日 申請日期2007年9月4日 優(yōu)先權日2007年9月4日
發(fā)明者劉興寶, 凌 楊, 欒宏偉 申請人:中國科學院大連化學物理研究所