基于綿羊毛囊特異表達基因的啟動子分離及鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到綿羊毛囊特異表達基因的啟動子的分離及鑒定。從綿羊基因組中分離并鑒定出一段具有毛囊組織表達特異性基因的上游調(diào)控序列，即啟動子區(qū)片段，該啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：9所示。利用克隆得到的啟動子片段構(gòu)建了sKAP13.1p-GFP真核表達載體，在啟動子后插入了ZsGreen1綠熒光報告基因，并將構(gòu)建好的載體利用原核顯微注射的方法整合到轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。在分子水平和個體水平上對該啟動子在毛囊表達的特異性進行了鑒定，為驗證啟動子的特異性提供了可靠的方法，也為應用基因工程技術(shù)改良羊毛品質(zhì)提供了重要的功能元件。
【專利說明】基于綿羊毛囊特異表達基因的啟動子分離及鑒定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物基因工程和分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種綿羊毛囊特異表達基因的啟動子分離及鑒定。該啟動子屬于綿羊毛囊特異表達基因上游調(diào)控序列，本發(fā)明通過分離、鑒定出該啟動子的特異性，獲得了一個調(diào)控基因在毛囊組織中表達的啟動子資源。
【背景技術(shù)】
[0002]上游調(diào)控序列是一段位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游控制基因表達的DNA片段，而啟動子是其中的重要組成部分。啟動子是位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游，與RNA聚合酶特異性結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的一段DNA序列，它通過與反式作用因子共同協(xié)調(diào)作用完成對基因的表達調(diào)控。真核生物的轉(zhuǎn)錄，根據(jù)結(jié)合RNA聚合酶的種類不同分為三種類型:1型，II型，III型。I型和II型啟動子通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，而III型啟動子有部分可能位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游。而啟動子根據(jù)其驅(qū)動基因表達的方式不同，可以分為組成型啟動子，誘導型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動誘導的基因在各個組織中的表達水平一致，不具有時間和空間特異性，也不受外界影響，具有穩(wěn)定性，因而也被稱為非特異性表達啟動子。誘導型啟動子在一般情況下誘導基因表達量較低或不能啟動基因表達，只在特定的外界刺激之下，比如物理或者化學信號的刺激，使得目的基因的表達量提高，因而它們通常也具有與特定物理或者化學信號相結(jié)合的元件。組織特異型啟動子也稱為器官特異型啟動子，在它的誘導下，外源基因只在特定的組織或者器官中表達，通常也表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。因而，組織特異型啟動子具有使引入的外源基因僅在需要的器官和組織中特異表達的優(yōu)點，克服了非特異性啟動子造成的浪費，對于基因工程有著重要的作用。
[0003]早期已經(jīng)有利用組成型啟動子研究外源基因表達的例子，例如啟動子CMV和SV40，但是組成型啟動子會驅(qū)動外源基因在動物各個組織中廣泛表達，產(chǎn)生的大量異源蛋白可能會影響生物體其他組織的生長的發(fā)育，并且，重復使用同一種啟動子啟動兩個以上的外源基因時，可能引起基因沉默的現(xiàn)象。而組織特異型啟動子就可以很好的解決這一問題，能控制外源基因在特定的組織或者器官中表達，而不影響其他組織。因此，組織特異性啟動子元件的克隆與鑒定對有效地利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)有重要意義。
[0004]本發(fā)明以藏綿羊(Ovis aries)為研究材料，綿羊是具有多種用途的家畜，主要有毛用和肉用兩個方面的經(jīng)濟價值，而羊毛作為毛紡織工業(yè)的基礎(chǔ)，畜牧業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)之一，具有重要的經(jīng)濟價值?；蚬こ毯头肿由飳W技術(shù)是進行羊毛的品質(zhì)改良，提高羊的經(jīng)濟價值的重要手段。 [0005]本發(fā)明針對目前綿羊毛囊組織特性型啟動子數(shù)量少，特異性不高的問題，分離克隆了綿羊毛囊特異表達基因上游調(diào)控序列，對其啟動子的活性和特異性進行檢測，為利用基因工程手段定向改良羊毛品質(zhì)提供了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于分離和克隆綿羊毛囊特異表達基因的上游調(diào)控序列，并對獲得的啟動子進行活性驗證，同時，通過構(gòu)建綠熒光表達載體及制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方式對啟動子的特性進行鑒定，為定向改良綿羊羊毛的品質(zhì)提供高特異性的啟動子資源。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008] 申請人:通過克隆技術(shù)從藏綿羊毛囊特異表達基因KRTAP13.1中得到綿羊毛囊特異性表達啟動子sKAP13.lp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示。
[0009]本發(fā)明的具體步驟是:
[0010]1.毛囊特異表達基因的鑒定:采集藏綿羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、小腸、大腸、瘤胃、皺胃、脂肪、淋巴(腸系膜)、毛囊、皮膚、睪丸、卵巢共16種組織樣，并提取這些組織的總RNA。然后用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)的方法驗證候選基因KRTAP13.1在各個組織中的表達情況。結(jié)果顯示KRTAP13.1只在毛囊和皮膚中有表達，而通過原位雜交和熒光定量PCR (q-PCR)的方法做進一步驗證發(fā)現(xiàn)，KRTAP13.1基因只在毛干中表達，是一種毛囊特異表達基因。
[0011]2.毛囊特異表達基因上游調(diào)控序列克隆及表達載體構(gòu)建:通過設(shè)計特異性引物，從藏綿羊基因組上擴增得到6938bp大小的上游調(diào)控序列區(qū)域片段，命名為SKAP13.lp。并將克隆的該區(qū)域片段連接入無啟動子的pZsGreenl-Ι綠熒光蛋白報告載體的啟動子區(qū)域中，將構(gòu)建好的載體命名為sKAP13.lp-GFP。
[0012]3.啟動子表達模式的驗證:利用原核顯微注射的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，將線性化的SKAP13.1p-GFP載體序列整合到轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中。待陽性小鼠4周齡時，采集小鼠的心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腸、胃、腦、皮膚、舌、毛發(fā)、睪丸共13個組織，提取其總RNA。經(jīng)表型觀察及RT-PCR驗證綠熒光蛋白基因只在小鼠的毛發(fā)中表達，證明上游調(diào)控序列sKAP13.1p在哺乳動物體內(nèi)具有啟動子活性，且為毛囊組織特異性表達啟動子。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0014](I)本發(fā)明分離克隆了藏綿羊毛囊特異表達基因KRTAP13.1上游調(diào)控序列片段sKAP13.1p,分別在分子水平和個體水平上對其活性和特異性進行了鑒定，為驗證啟動子的活性和特異性提供了可靠的方法。
[0015](2)本發(fā)明所構(gòu)建的藏綿羊毛囊特異表達啟動子sKAP13.1p-GFP載體,可進一步用于啟動其他外源基因在毛囊中表達的功能研究，為應用基因工程技術(shù)改良羊毛品質(zhì)提供了重要的功能元件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]序列表SEQ ID NO:1和2是應用實施例中用于擴增藏綿羊KRTAP13.1基因部分核苷酸序列的引物。
[0017]序列表SEQ ID NO:3是應用實施例中擴增的藏綿羊KRTAP13.1基因的部分核苷酸序列。序列長度為133bp，該序列為鑒定KRTAP13.1組織表達譜的序列。
[0018]序列表SEQ ID NO:4和5是應用實施例中用于擴增本發(fā)明命名的藏綿羊sKAP13.1p上游調(diào)控序列的引物序列。
[0019]序列表SEQ ID NO:6和7是應用實施例中用于擴增本發(fā)明命名的藏綿羊sKAP 13.1p啟 動子的部分核苷酸序列的引物序列。[0020]序列表SEQ ID NO:8是應用實施例中擴增的本發(fā)明命名的藏綿羊sKAPll.1p啟動子的部分核苷酸序列。序列長度為800bp，該序列為檢測KRTAP13.1-ZsGreenl-1陽性質(zhì)粒的序列。
[0021]序列表SEQ ID NO:9是應用實施例中擴增的本發(fā)明命名的藏綿羊sKAP13.1p啟動子的核苷酸序列。序列長度為6956bp。
[0022]圖1:藏綿羊KRTAP13.1基因在藏綿羊各組織中的表達情況。圖中:泳道1_16依次為組織毛囊、皮膚(含毛囊)、心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、皺胃、小腸、大腸、淋巴(腸系膜)、脂肪、肌肉、睪丸、卵巢；泳道17為無模板陰性對照。第I行為KRTAP13.1擴增結(jié)果，第2行為內(nèi)參基因18S擴增結(jié)果。如圖所示，KRTAP13.1只在毛囊及皮膚(含毛囊)樣品中具有擴增條帶，說明KRTAP13.1在所檢測的組織中，只在毛囊和皮膚(含毛囊)中表達。 [0023]圖2:藏綿羊KRTAP13.1基因在藏綿羊皮膚和毛囊中的q_PCR結(jié)果。如圖所示，該基因在毛囊中的表達量要明顯高于在皮膚(包含毛囊)中的表達量。
[0024]圖3:藏綿羊KRTAP13.1基因在藏綿羊皮膚中的原位雜交結(jié)果。箭頭(黑色)所指的區(qū)域為探針雜交信號。如圖所示，紅色的探針信號存在于藏綿羊毛干之中，說明藏綿羊KRTAP13.1為毛囊特異表達基因。
[0025]圖4:sKAP13.1p擴增片段。圖中:泳道M為DNA分子量標準DL10000 ;泳道I為sKAP13.1p擴增片段。
[0026]圖5:是pZsGreenl-Ι空載體、pZsGreenl-Ι空載體上多克隆位點的序列、sKAP13.1p-GFP啟動子表達載體構(gòu)造示意圖。在圖5中:圖5A為pZsGreenl-Ι空載體；圖5B為pZsGreenl-Ι空載體上多克隆位點的序列；圖5C為sKAP13.1p-GFP啟動子表達載體構(gòu)造示意圖。本發(fā)明構(gòu)建的載體sKAP13.1p-GFP為真核表達載體，由啟動子sKAP13.1p連接綠熒光報告基因ZsGreenl構(gòu)成而成。該載體具有卡那霉素和新霉素抗性。
[0027]圖6:利用熒光顯微鏡SKAP13.1p-GFP轉(zhuǎn)基因陽性小鼠上剪下的毛發(fā)的觀察得到的熒光圖像，可依次觀察到轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的毛發(fā)發(fā)出綠色熒光圖像。
【具體實施方式】
[0028]實施例1:藏綿羊毛囊特異表達基因KRTAP13.1組織表達譜驗證
[0029]本實施例所用試劑及儀器包括:動物組織總RNA提取試劑盒購買于天根生化科技有限公司(貨號:DP431) ；RNase-Free ddH20購買于天根生化科技(北京)有限公司(貨號:RT121);反轉(zhuǎn)錄反應使用寶生物工程大連有限公司的“PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser”試劑盒(貨號:DRR047S)，PCR反應使用寶生物工程大連有限公司的PremixTaq?Hot Start Version (貨號:DR028C) ;DEPC (焦碳酸二乙酯)購買于 Sigma 公司(貨號:D5758);q-PCR反應使用 ToYoBo 公司的 I ! H !Nl)l:kHIRl) S V IiR n qPCR Mix(貨號:QPS-201)；原位雜交使用Affymetrix公司的的QuantiGene ViewRNA ISH Tissue Assay原位雜交試劑盒(貨號:QVT0050);本實施例所使用的RNase-free槍頭，EP管等均為KG公司耗材，并于120°C高壓滅菌30min。儀器為Bio-red公司的MyCycler PCR儀。
[0030](I) RT-PCR檢測藏綿羊KRTAP13.1基因在各組織中的表達情況
[0031]采集藏綿羊(來源西藏林芝地區(qū)羊場)的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、小腸、大腸、瘤胃、皺胃、脂肪、淋巴(腸系膜)、毛囊、皮膚(含毛囊)、睪丸、卵巢共16種組織樣。利用動物組織總RNA提取試劑盒提取上述采集的各組織總RNA。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性良好，經(jīng)物性測定儀檢測顯示總RNA的0D260/0D280值在1.8-2.2之間，可用于后續(xù)實驗。取各組織中總RNAl μ g,利用“ PrimeScripti) RT reagent Kit WithgDNAEraser”試劑盒(購自寶生物工程大連有限公司)分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體反應條件及操作參照產(chǎn)品說明書。利用PCR技術(shù)檢測KRTAP13.1基因(NCBI登錄號:ΝΜ_001080350.1)在各組織中的表達情況，引物序列為SEQ ID NO:1和2所示。擴增得到的片段序列為SEQIDNO:3 所示。
[0032]PCR體系(總體積IOul)及反應條件如下:
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種綿羊毛囊特異性表達啟動子SKAP13.lp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示。
2.核苷酸序列如序列表SEQID NO:9所示的啟動子sKAP13.1p在調(diào)控基因在毛囊組織中特異性表達的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103642806SQ201310637747
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】余梅, 陳若男, 柳廣斌, 趙書紅, 李新云, 孟春春, 李小平, 曹建華, 李長春, 朱猛進 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學