一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其中，培養(yǎng)液包括乳酸鈉混合液、青霉素、鏈霉素，以及牛血清白蛋白、犢牛血清和滅活馬血清中的一種、兩種或三種；其配制方法包括：將乳酸鈉混合液置于37℃的恒溫箱中0.5-6小時(shí)后，備用，按照組分含量向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及牛血清白蛋白、犢牛血清和滅活馬血清中的一種或兩種或三種，即得到培養(yǎng)液。適用于馬、牛、驢的非手術(shù)法胚胎移植技術(shù)。本發(fā)明的有益效果是：具有取材方便、價(jià)格低廉、配制簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于馬屬動(dòng)物非手術(shù)法胚胎移植的規(guī)?；a(chǎn)，有利于胚胎移植技術(shù)的推廣應(yīng)用。
【專利說明】—種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物胚胎移植領(lǐng)域，特別是涉及一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]胚胎移植又稱受精卵移植，俗稱人工授胎或借腹懷胎，是指將雌性動(dòng)物的早期胚胎移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動(dòng)物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù)。胚胎移植的基本程序包括供體超排與授精、受體同期發(fā)情處理、采卵、檢卵和移植。
[0003]采卵又稱胚胎回收，是指從供體收集胚胎的方法，分為手術(shù)法和非手術(shù)法兩種。非手術(shù)法比手術(shù)法簡(jiǎn)單易行，而且對(duì)生殖器官的傷害程度較小，因此在生產(chǎn)中多采用此法。培養(yǎng)液是采卵過程中，用于把胚胎從供體生殖道中沖洗出來的液體。培養(yǎng)液多數(shù)為組織培養(yǎng)液，目前國內(nèi)常用的培養(yǎng)液主要有杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)、布林斯特氏液、合成輸卵管液(S0F)、惠屯氏液、Ham’s F-110以及TCM-199`。上述幾種液體均存在藥品來源困難，價(jià)格昂貴，配制步驟繁瑣且需現(xiàn)用現(xiàn)配等問題，為胚胎移植的規(guī)模化生產(chǎn)帶來極大的不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決傳統(tǒng)的培養(yǎng)液藥品來源困難、價(jià)格昂貴、配制步驟繁瑣且需現(xiàn)用現(xiàn)配等問題，本發(fā)明提供了一種適用于規(guī)?；a(chǎn)的馬屬動(dòng)物非手術(shù)法胚胎移植用培養(yǎng)液及其配制方法和應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液包括乳酸鈉混合液、青霉素、鏈霉素，以及牛血清白蛋白或犢牛血清或滅活馬血清中的一種、兩種或三種。
[0006]所述乳酸鈉混合液包括乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂和黃芪多糖中的一種或多種。
[0007]所述培養(yǎng)液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有青霉素30-180萬單位、鏈霉素20-200萬單位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犢牛血清0.5%-15%和/或滅活馬血清0.5%-14%。其中，所述血清白蛋白、所述犢牛血清以及所述滅活馬血清的百分比為體積百分比。
[0008]所述培養(yǎng)液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有青霉素50-150萬單位、鏈霉素50-150萬單位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犢牛血清1%_10%和/或滅活馬血清1%-10%。其中，所述血清白蛋白、所述犢牛血清以及所述滅活馬血清的百分比為體積百分比。
[0009]所述乳酸鈉混合液中各組分的含量為?每1000ml混合液中含有乳酸鈉l_7g、氯化鈉l_5g、氯化鉀2-7g、氯化鈣0.5-2g、氯化鎂0.05-0.5g和黃芪多糖0.01-0.3g。
[0010]所述乳酸鈉混合液中各組分的含量?jī)?yōu)選為?每1000ml混合液中含有乳酸鈉3_7g、氯化鈉2-5g、氯化鉀3-7g、氯化鈣0.5-1.5g、氯化鎂0.1-0.4g和黃芪多糖0.01-0.lg。
[0011]所述乳酸鈉混合液中各組分的含量還可以優(yōu)選為:每1000ml混合液中含有乳酸鈉5.4g、氯化鈉3.2g、氯化鉀4.6g、氯化鈣1.lg、氯化鎂0.32g和黃芪多糖0.08g。
[0012]為了更好的實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液的配制方法，包括:
(1)按照各組分的含量稱取乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂，并加入蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中0.5-6小時(shí)后,備用；
(2)稱取黃芪多糖放入無菌燒杯中，向無菌燒杯中加入步驟(1)中得到的混合液，攪拌使黃芪多糖充分溶解，得到乳酸鈉混合液；
(3)準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及牛血清白蛋白、犢牛血清和滅活馬血清中的一種或兩種或三種，即可得到培養(yǎng)液。
[0013]本發(fā)明的馬屬動(dòng)物培養(yǎng)液適用于馬、牛、驢的非手術(shù)法胚胎移植技術(shù)。
[0014]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明以乳酸鈉混合液作為主液，可提前配制待用，使用前只需向主液中加入適量抗生素及牛血清白蛋白或犢牛血清或滅活馬血清即可。具有取材方便、價(jià)格低廉、配制簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于馬屬動(dòng)物非手術(shù)法胚胎移植的規(guī)?；a(chǎn)，有利于胚胎移植技術(shù)的推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0016]實(shí)施例1
一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體`外培養(yǎng)液，包括5000ml乳酸鈉混合液作為主液，每1000ml乳酸鈉混合液含有50萬單位青霉素、50萬單位鏈霉素和體積百分比為10%的犢牛血清。
[0017]稱取乳酸鈉27g、氯化鈉16g、氯化鉀23g、氯化鈣5.5g和氯化鎂1.6g，加入5000ml蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中6小時(shí)后，備用；稱取黃芪多糖0.4g放入無菌燒杯中，向無菌燒杯中加入到備用的混合液中，攪拌使黃芪多糖充分溶解，得到乳酸鈉混合液；準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量，向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及犢牛血清，即可得到培養(yǎng)液。
[0018]使用本實(shí)施例培養(yǎng)液對(duì)非手術(shù)法牛胚胎移植進(jìn)行沖卵。
[0019]實(shí)施例2
一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，包括5000ml乳酸鈉混合液作為主液，每1000ml乳酸鈉林格注射液含有100萬單位青霉素、120萬單位鏈霉素和體積百分比為3%的滅活馬血清。
[0020]稱取乳酸鈉10.5g、氯化鈉6g、氯化鉀13.5g和氯化鈣9g，加入5000ml蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中3小時(shí)后，備用；稱取黃芪多糖1.4g放入無菌燒杯中，向無菌燒杯中加入到備用的混合液中，攪拌使黃芪多糖充分溶解，得到乳酸鈉混合液；準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量，向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及滅活馬血清，即可得到培養(yǎng)液。
[0021]本實(shí)施例培養(yǎng)液應(yīng)用于非手術(shù)法馬胚胎移植的沖卵。
[0022]實(shí)施例3
一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，包括4 O O O m I乳酸鈉混合液作為主液，其中每1000ml乳酸鈉混合液中含有80萬單位青霉素、80萬單位鏈霉素和體積百分比為5%的滅活馬血清；其中，乳酸鈉混合液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有乳酸鈉26g、氯化鈉10.8g、氯化鉀21g和氯化鈣16.8g。
[0023]稱取乳酸鈉26g、氯化鈉10.8g、氯化鉀21g和氯化鈣16.8g，加入4000ml蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中I小時(shí)后，得到乳酸鈉混合液以待備用；準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量，向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及滅活馬血清，即可得到培養(yǎng)液。
[0024]本實(shí)施例培養(yǎng)液應(yīng)用于非手術(shù)法馬胚胎移植的沖卵。
[0025]實(shí)施例4
一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，包括5 O O O m I乳酸鈉混合液作為主液，其中每1000ml乳酸鈉混合液中含有60萬單位青霉素、90萬單位鏈霉素和體積百分比為8%的滅活馬血清；其中，乳酸鈉混合液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有乳酸鈉25.0g、氯化鈉20.0g、氯化鉀25g、氯化鈣7.5g、氯化鎂2.25g和黃芪多糖0.25g。
[0026]稱取乳酸鈉25.0g、氯化鈉20.0g、氯化鉀25g、氯化鈣7.5g和氯化鎂2.25g，加入5000ml蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中I小時(shí)后，備用；稱取黃芪多糖0.25g放入無菌燒杯中，向無菌燒杯中加入到備用的混合液中，攪拌使黃芪多糖充分溶解，得到乳酸鈉混合液；準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量，向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及滅活馬血清，即可得到培養(yǎng)液。
[0027]本實(shí)施例培養(yǎng)液應(yīng)用于非手術(shù)法馬胚胎移植的沖卵。
[0028]實(shí)施例5
一種馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，包括4 O O O m I乳酸鈉混合液作為主液，其中每1000ml乳酸鈉混合液中含有150萬單位青霉素、60萬單位鏈霉素和體積百分比為0.35%的牛血清白蛋白；其中，乳酸鈉`混合液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有乳酸鈉16.8g、氯化鈉8.0g、氯化鉀Hg、氯化鈣2.8g和氯化鎂1.08g。
[0029]稱取乳酸鈉16.8g、氯化鈉8.0g、氯化鉀Hg、氯化鈣2.8g和氯化鎂1.08g,加入4000ml蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中I小時(shí)后，得到乳酸鈉混合液，以待備用；準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量，向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及牛血清白蛋白，即可得到培養(yǎng)液。
[0030]本實(shí)施例培養(yǎng)液應(yīng)用于非手術(shù)法牛胚胎移植的沖卵。
[0031]對(duì)比實(shí)驗(yàn):
選取9頭正常的供體母牛分成3組，在母牛發(fā)情后第七天，分別使用實(shí)施例1得到的培養(yǎng)液(實(shí)施例組I)、實(shí)施例5得到的培養(yǎng)液(實(shí)施例組5)和傳統(tǒng)培養(yǎng)液(對(duì)照組I)進(jìn)行沖卵，并保存胚胎30min后進(jìn)行檢卵和移植。I周后統(tǒng)計(jì)沖卵及移植數(shù)，并對(duì)受體進(jìn)行觀察，直至生產(chǎn)。供體母牛沖卵及胚胎移植效果如表1所示。
[0032]選取80匹正常的供體母馬分成4組，在母馬發(fā)情后第七天，分別使用實(shí)施例2-4得到的培養(yǎng)液(實(shí)施例組2-4)和傳統(tǒng)培養(yǎng)液(對(duì)照組2)進(jìn)行沖卵，并保存胚胎30min后進(jìn)行檢卵和移植。I周后統(tǒng)計(jì)沖卵及移植數(shù)，并對(duì)受體進(jìn)行觀察，直至生產(chǎn)。供體母馬沖卵及胚胎移植效果如表2所示。
[0033]其中，傳統(tǒng)培養(yǎng)液選取TCM-199培養(yǎng)液，需使用前現(xiàn)場(chǎng)配制。
[0034]表1供體母牛沖卵及胚胎移植效果對(duì)照表
【權(quán)利要求】
1.馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液包括乳酸鈉混合液、青霉素、鏈霉素，以及牛血清白蛋白、犢牛血清和滅活馬血清中的一種、兩種或三種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述乳酸鈉混合液包括乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂和黃芪多糖中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有青霉素30-180萬單位、鏈霉素20-200萬單位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犢牛血清0.5%-15%和/或滅活馬血清0.5%_14%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中各組分的含量為:每1000ml乳酸鈉混合液中含有青霉素50-150萬單位、鏈霉素50-150萬單位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犢牛血清1%-10%和/或滅活馬血清1%_10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述乳酸鈉混合液中各組分的含量為:每1000ml混合液中含有乳酸鈉l_7g、氯化鈉l_5g、氯化鉀2-7g、氯化鈣0.5-2g、氯化鎂0.05-0.5g和黃芪多糖0.01-0.3g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述乳酸鈉混合液中各組分的含量為:每1000ml混合液中含有乳酸鈉3-7g、氯化鈉2_5g、氯化鉀3-7g、氯化鈣0.5-1.5g、氯化鎂0.1-0.4g和黃芪多糖0.01-0.lg。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液，其特征在于，所述乳酸鈉混合液中各組分的含量為:每1000ml混合液中含有乳酸鈉5.4g、氯化鈉3.2g、氯化鉀4.6g、氯化鈣1.lg、氯化鎂0.32g和黃芪多糖0.08g。
8.—種如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液的配制方法,其特征在于，所述配制方法包括: (1)按照各組分的含量稱取乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂，并加入蒸餾水混合，置于37°C的恒溫箱中0.5-6小時(shí)后,備用； (2)稱取黃芪多糖放入無菌燒杯中，向無菌燒杯中加入步驟(1)中得到的混合液，攪拌使黃芪多糖充分溶解，得到乳酸鈉混合液； (3)準(zhǔn)備沖卵前，按照組分含量向乳酸鈉混合液中加入青霉素、鏈霉素以及牛血清白蛋白、犢牛血清和滅活馬血清中的一種或兩種或三種，即可得到培養(yǎng)液。
9.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的馬屬動(dòng)物卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)液適用于馬、牛、驢的非手術(shù)法胚胎移植技術(shù)。
【文檔編號(hào)】C12N5/075GK103805558SQ201310645076
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】張建軍, 董斌, 劉海兵 申請(qǐng)人:青島德瑞駿發(fā)生物科技有限公司, 伊犁德瑞駿發(fā)生物科技有限公司, 青島德瑞鰲藍(lán)馬術(shù)有限公司