重組蛋白igf1-24及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組蛋白IGF1-24，氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，是將IGF-1序列的C端與MGF-24序列的N端通過3個(gè)GLY連接子連接而得；研究結(jié)果顯示，該重組蛋白能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖、分化、粘附和遷移，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和遷移，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)，還能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，且作用明顯強(qiáng)于IGF-1和MGF-24，可制成藥物，用于治療肌肉、骨、神經(jīng)、心肌損傷等相關(guān)疾病，為改善患者生存質(zhì)量發(fā)揮積極、重要的推動(dòng)作用。
【專利說明】重組蛋白IGF1-24及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種重組蛋白及其制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)是胰島素家族的一種單鏈多肽類生長(zhǎng)因子，其結(jié)構(gòu)與胰島素有高度同源性，具有細(xì)胞分化、增殖功能和胰島素樣代謝作用。對(duì)IGF-I的研究發(fā)現(xiàn)其在生長(zhǎng)障礙、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、腎臟疾病、心血管疾病、腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面都起到重要作用。
[0003]力生長(zhǎng)因子（mechano growth factor, MGF)是IGF-1的一種剪接異構(gòu)體。肌肉在受到機(jī)械刺激后，IGF-I基因會(huì)選擇性剪接產(chǎn)生MGF，通過激活肌肉衛(wèi)星細(xì)胞和合成代謝途徑來修復(fù)局部肌肉損傷。MGF之所以具有不同于IGF-I其他異構(gòu)體的功能，部分是由于MGFC末端的24個(gè)氨基酸（MGF-24)，又稱為MGF E肽，其被證明具有激活人類肌肉衛(wèi)星細(xì)胞、促進(jìn)肌元細(xì)胞增殖等功能，但確切的分子作用機(jī)制目前尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于對(duì)IGF-I和MGF-24進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以期獲得一種具有更強(qiáng)活性的重組蛋白；目的之二在于提供該重組蛋白在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0005]為達(dá)到上述目的，經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
`[0006]I.重組蛋白IGF1-24，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007]2.編碼所述重組蛋白IGF1-24的基因。
[0008]優(yōu)選的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
[0009]3.含有重組蛋白IGF1-24編碼基因的重組表達(dá)載體。
[0010]4.含有IGF1-24基因重組表達(dá)載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
[0011]5.重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
[0012]6.重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)骨生長(zhǎng)和損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
[0013]7.重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
[0014]8.重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)心肌修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將IGF-I序列的C端與MGF-24序列的N端通過3個(gè)GLY連接子連接，構(gòu)建了重組蛋白IGF1-24。研究結(jié)果顯示，該重組蛋白能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖、分化、粘附和遷移，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和遷移，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)，還能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，且作用明顯強(qiáng)于IGF-I和MGF-24，可制成藥物，用于治療肌肉、骨、神經(jīng)、心肌損傷等相關(guān)疾病，為改善患者生存質(zhì)量發(fā)揮積極、重要的推動(dòng)作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：[0017]圖I為重組蛋白IGF1-24誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果，其中I為轉(zhuǎn)染pGEX-4T-l/IGFl-24大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，2為純化蛋白。
[0018]圖2為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12增殖。
[0019]圖3為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12分化標(biāo)記蛋白Myogenin的表達(dá)。
[0020]圖4為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12融合。
[0021]圖5為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12粘附。
[0022]圖6為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成肌細(xì)胞C2C12遷移。
[0023]圖7為重組蛋白IGF1-24對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響依賴于IGF-1受體。
[0024]圖8為重組蛋白IGF1-24對(duì)C2C12細(xì)胞粘附的影響不依賴于IGF-1受體。
[0025]圖9為重組蛋白IGF1-24對(duì)C2C12細(xì)胞遷移的影響不依賴于IGF-1受體。
[0026]圖10為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖。
[0027]圖11為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞遷移。
[0028]圖12為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的損傷修復(fù)。
[0029]圖13為重組蛋白IGF1-24促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞H9C2增殖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說明。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0031]實(shí)施例I、重組蛋白IGF1-24的獲得
[0032]采用overlap PCR方法擴(kuò)增IGF1-24基因。PCR引物序列如下：
[0033]IGFl-24a F:5’CGCGGATCCGGACCGGAGACGCTCTGC3’ (SEQ ID No. 3)；
[0034]IGFl-24b R:5’CTGATAACCGCCACCAGCTGACTTGGCAGGCT3’ (SEQ ID No. 4)；
[0035]IGFl-24c F:5’GGTGGCGGTTATCAGTATCAGCCCCCATCTA3’ (SEQ ID No. 5)；
[0036]IGFl-24d R:5’CCGCTCGAGCTACTTGTGTTCTTCAAATGT3’ (SEQ ID No. 6)。
[0037]以來自于人IGF-IEc 的 cDNA (GenBank Axl47742)為模板，用引物 IGFl_24a F 和IGFl-24bR擴(kuò)增IGFl基因，用引物IGFl_24c F和IGFl_24d R擴(kuò)增MGF-24基因；再以所得IGFl基因和MGF-24基因?yàn)楣餐０?，用引物IGFl-24a F和IGFl_24d R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得兩端帶有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的IGF1-24基因。將該DNA片段用BamHI和XhoI雙酶切后，與同樣經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒pGEX_4T_l連接，獲得重組質(zhì)粒pGEX_4T_l/IGF1-24。
[0038]將空質(zhì)粒pGEX-4T-l及重組質(zhì)粒pGEX-4T-l/IGFl_24分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用O. 2mMIPTG于20°C誘導(dǎo)表達(dá)3-5小時(shí)，離心收集菌體，超聲波破碎，離心收集沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，再用glutathione-Sepharose4B柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化情況。結(jié)果見圖1，轉(zhuǎn)染PGEX-4T-1/IGF1-24大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物在37Kd處顯示明顯的蛋白條帶，與重組蛋白IGF1-24的分子量一致，說明成功誘導(dǎo)表達(dá)了重組蛋白IGF1-24;純化蛋白除了 37Kd處的主帶以外，幾乎不存在其它雜帶，表明重組蛋白IGF1-24純化成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0039]實(shí)施例2、 重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖、分化、粘附和遷移
[0040]將小鼠成肌細(xì)胞C2C12用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在溫度37°C、飽和濕度、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為0.05的條件下孵育。
[0041]將C2C12細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)過夜，再用含有2%胎牛血清與50ng/mL IGF1-24的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天換液，48小時(shí)后CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，同時(shí)分別設(shè)置空白對(duì)照、IGF-I對(duì)照和MGF-24對(duì)照。結(jié)果如圖2所示，重組蛋白IGF1-24能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖，作用與IGF-I相當(dāng)，而MGF-24幾乎不促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖。
[0042]將C2C12細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)過夜，再用含有2%胎牛血清與50ng/mL IGF1-24的DMEM高糖分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天換液，5天后收集細(xì)胞，裂解，離心收集蛋白，western blot檢測(cè)肌分化標(biāo)記蛋白Myogenin的表達(dá)，同時(shí)分別設(shè)置空白對(duì)照、IGF-1對(duì)照和MGF-24對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，經(jīng)IGF1-24處理后，肌分化標(biāo)記蛋白Myogenin的表達(dá)上調(diào)，且上調(diào)量明顯高于IGF-I對(duì)照組和MGF-24對(duì)照組。
[0043]將C2C12細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)過夜，再用含有2%胎牛血清與50ng/mL IGF1-24的DMEM高糖分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天換液，5天后固定細(xì)胞，與熒光標(biāo)記的肌球蛋白重鏈（MyHC)抗體共孵育，熒光下觀察MyHC的表達(dá)及細(xì)胞的融合狀態(tài)，計(jì)算細(xì)胞融合率，同時(shí)分別設(shè)置空白對(duì)照、IGF-I對(duì)照和MGF-24對(duì)照。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)IGF1-24處理后，肌細(xì)胞特異標(biāo)志物MyHC的表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞融合率約為空白對(duì)照組的4倍，且高于IGF-I對(duì)照組和MGF-24對(duì)照組。
[0044]將96孔板用10 μ g/mL Fn于4°C包被過夜，再用1%BSA室溫封閉I小時(shí)；將密度為5X 104/mL的C2C12細(xì)胞懸浮液添加50ng/mL的IGF1-24預(yù)處理30分鐘，再接種至封閉處理后的96孔板，37°C孵育10分鐘，PBS洗去未粘附的細(xì)胞，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞粘附能力，同時(shí)分別設(shè)置空白對(duì)照、IGF-I對(duì)照和MGF-24對(duì)照。結(jié)果如圖5所示，重組蛋白IGF1-24能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞的粘附，且作用明顯強(qiáng)于IGF-I和MGF-24。
[0045]取24-well Transwell (8. Omm pore size)板,在含 100 μ L 無血清培養(yǎng)基的上室中接種5Χ104個(gè)C2C12細(xì)胞，在含500 μ L2%血清培養(yǎng)基的下室中添加50ng/mL IGF1-24，進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，6小時(shí)后用棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞，遷移的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并照相計(jì)數(shù)，同時(shí)分別設(shè)置空白對(duì)照、IGF-I對(duì)照和MGF-24對(duì)照。結(jié)果如圖6所示，重組蛋白IGF1-24能促進(jìn)C2C12細(xì)胞的遷移，其作用與MGF-24相當(dāng)，而強(qiáng)于IGF-I。
[0046]用5 μ g/mL IGF-I受體抑制劑PQ401 (Sigma)預(yù)處理C2C12細(xì)胞，再按照前述方法檢測(cè)重組蛋白IGF1-24對(duì)細(xì)胞增殖、粘附和遷移的影響。結(jié)果如圖7-9所示，抑制IGF-I受體后，IGF1-24對(duì)細(xì)胞的增殖作用消失，表明IGF1-24對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響依賴于IGF-I受體；而抑制IGF-I受體后，IGF1-24仍然能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞的粘附和遷移，表明IGF1-24對(duì)C2C12細(xì)胞粘附和遷移的影響不依賴于IGF-I受體。
[0047]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白IGF1-24能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖、分化、粘附和遷移，可作為一種損傷修復(fù)因子，用于肌肉萎縮、肌營(yíng)養(yǎng)不良和杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病的治療。
[0048]實(shí)施例3、重組蛋白IGF1-24促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和遷移
[0049]通過組織塊法從新生大鼠顱骨中獲得成骨細(xì)胞，用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在溫度37°C、飽和濕度、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為0. 05的條件下孵育。
[0050]將成骨細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)過夜，再用含50ng/mL IGF1-24的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天換液，48小時(shí)后CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。結(jié)果如圖10所示，重組蛋白IGF1-24能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。
[0051]取24-well Transwell (8. Omm pore size)板,在含 100 μ L 無血清培養(yǎng)基的上室中接種5 X IO4個(gè)成骨細(xì)胞，在含500 μ L2%血清培養(yǎng)基的下室中添加50ng/mL IGF1-24，進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，6小時(shí)后用棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞，遷移的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并照相計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖11所示，重組蛋白IGF1-24能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移。
[0052]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白IGF1-24能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和遷移，從而可用于骨損傷以及骨相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松等的治療。
[0053]實(shí)施例4、重組蛋白IGF1-24促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)
[0054]將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在溫度37°C、飽和濕度、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為0.05的條件下孵育。
[0055]將SH-SY5Y細(xì)胞接種96孔板,培養(yǎng)過夜，用神經(jīng)毒素6_hydroxydopamine (6-0HDA)和IGF1-24共處理24小時(shí)，檢查細(xì)胞存活情況，同時(shí)設(shè)置6-0HDA單獨(dú)處理對(duì)照。結(jié)果如圖12所示，6-0HDA單獨(dú)處理可造成約55%的細(xì)胞損傷，而共孵育IGF1-24后，細(xì)胞損傷減少，存活率達(dá)到90%左右。
[0056]將神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y 接種 96 孔板,培養(yǎng)過夜,用 l-methyl_4-phenylpyridinium(MPP+)和IGF1-24共處理48小時(shí)，檢查細(xì)胞存活情況，同時(shí)設(shè)置MPP+單獨(dú)處理對(duì)照。結(jié)果如圖12所示，MPP+單獨(dú)處理可造成約60%的細(xì)胞損傷，而共孵育IGF1-24后，細(xì)胞損傷減少，存活率達(dá)到95%左右。
[0057]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白IGF1-24可作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，參與缺血、缺氧后神經(jīng)損傷的修復(fù)過程，對(duì)受累神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，可用于神經(jīng)損傷相關(guān)疾病如腦梗死、帕金森病等的治療。
[0058]實(shí)施例5、重組蛋白IGF1-24促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖
[0059]將大鼠心肌細(xì)胞H9C2用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μ g/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在溫度37°C、飽和濕度、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為0. 05的條件下孵育。
[0060]將心肌細(xì)胞H9C2接種96孔板，培養(yǎng)過夜，用含50ng/mL IGF1-24的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天換液，48小時(shí)后CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。結(jié)果如圖13所示，重組蛋白IGF1-24能夠顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，從而可用于心臟保護(hù)和心肌損傷相關(guān)疾病如心肌梗死等的治療。
[0061]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.重組蛋白IGF1-24，其特征在于，氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述重組蛋白IGF1-24的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. I所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
6.權(quán)利要求1所述重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)骨生長(zhǎng)和損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述重組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述重 組蛋白IGF1-24在制備促進(jìn)心肌修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103694340SQ201310660921
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】唐麗靈, 易茜, 馮建國(guó), 萬(wàn)榮雪, 曾慧, 歐夢(mèng)婷 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)