甲魚膠原蛋白基因功能片段及其重組蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甲魚膠原蛋白基因功能片段及其重組蛋 白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白是一種細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)蛋白，主要存在于人和動(dòng)物的肌腱、韌帶、軟骨、皮 膚及結(jié)締組織中。膠原蛋白富含人體需要的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸，其水解得 到的多肽產(chǎn)物不僅有許多重要的生理活性功能而且具有良好的消化吸收特性。這使得膠原 蛋白在近年來成為研宄熱點(diǎn)，同時(shí)也在醫(yī)藥、食品、美容以及生物材料等方面得到了廣泛的 應(yīng)用。
[0003] 傳統(tǒng)的制備膠原蛋白的主要方法為從牛、豬等動(dòng)物的皮膚、胎盤等組織提取，具有 諸多不利因素。例如：利用酸堿水解法從動(dòng)物結(jié)締組織中提取的膠原蛋白摻雜了較多的雜 質(zhì)，在提取過程中部分蛋白較易喪失活性；異體來源的膠原蛋白存在著傳染病危險(xiǎn)（瘋牛 病等）、異種或異體的排斥反應(yīng)、剛性很強(qiáng)易引發(fā)分子鏈斷裂、提取物不溶于水導(dǎo)致細(xì)胞毒 性等問題。利用基因工程法生產(chǎn)膠原蛋白不僅可以克服傳統(tǒng)方法中存在的病毒隱患等問 題，同時(shí)也使膠原蛋白的免疫排異性和親水性等性能得到極大的改善。大腸桿菌（E. coli) 是最常用的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一，因生長周期短、培養(yǎng)成本低廉、代謝調(diào)控較為成熟，在 重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中占主導(dǎo)地位。利用大腸桿菌合成的膠原分子具有顯著的柔韌性，可 以更廣泛的將稀有氨基酸殘基合成到重組蛋白中。
[0004] 甲魚（Trionyx sinensis Wiegmann)是重要的淡水爬行動(dòng)物，在亞洲的很多國家 和地區(qū)都有養(yǎng)殖，如中國、日本、韓國、越南和臺(tái)灣。自古以來，甲魚就以其美味和營養(yǎng)而深 受中國人民的喜愛。鱉甲周圍的結(jié)締軟組織通常被稱為"裙邊"，裙邊膠原蛋白含量相當(dāng)豐 富，可作為高品質(zhì)、優(yōu)良膠原蛋白的來源。迄今為止，尚無甲魚膠原蛋白基因及其重組蛋白 的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種甲魚膠原蛋白基因功能片段，該甲 魚膠原蛋白基因功能片段編碼的重組蛋白具有強(qiáng)抗氧化性；
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種甲魚膠原蛋白基因功能片段編 碼的強(qiáng)抗氧化性的重組蛋白，該重組蛋白即為重組甲魚膠原蛋白功能肽段；
[0007] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種上述重組甲魚膠原蛋白功能肽 段的制備方法；
[0008] 本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問題在于為上述重組甲魚膠原蛋白功能肽段提 供一種應(yīng)用。
[0009] 解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種甲魚膠原蛋白基因功能片段，該甲魚膠原蛋白基因功能片段的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 甲魚膠原蛋白基因功能片段編碼的重組甲魚膠原蛋白功能肽段，該重組甲魚膠原 蛋白功能肽段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，其含有252個(gè)氨基酸，含有27個(gè) 膠原蛋白特有的Gly-X-Y重復(fù)域。
[0012] 重組甲魚膠原蛋白功能肽段的制備方法，步驟如下：
[0013] 1、甲魚膠原蛋白基因功能片段的克隆
[0014] 用Trizol LS (購自于Invitrogen公司）從新鮮的甲魚組織中提取總RNA，提取步 驟根據(jù)Invitrogen公司提供的說明書進(jìn)行；以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得甲魚cDNA ;設(shè)計(jì)甲 魚膠原蛋白基因功能片段引物，甲魚膠原蛋白基因功能片段引物序列為：
[0015] F 5' -CATATGATCAACGCAGAGTGGCCATTATG-3' (劃線處為 NdeI 酶切位點(diǎn)）
[0016] R 5' -CTCGAGAGCATACTTGTGTTGCACGCGA-3' (劃線處為 XhoI 酶切位點(diǎn)）
[0017] 以上述甲魚cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收特異性DNA擴(kuò)增條帶，將 回收產(chǎn)物連接載體PMD19-T(購自于大連寶生物工程有限公司），轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受 態(tài)細(xì)胞（購自于大連寶生物工程有限公司），涂布平板，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆接種 于5mL LB液體培養(yǎng)基（1升培養(yǎng)基含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，pH7. 5) 中，37°C，200rpm振蕩過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得甲魚膠原蛋白基 因功能片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 2、大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0019] 將上述重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I (購自于大連寶生生物工程有限 公司）雙酶切后，回收甲魚膠原蛋白功能片段連接表達(dá)載體pET-28a，連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基（1升培養(yǎng)基含有胰化蛋 白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，pH7. 5)，挑選陽性克隆接種于5mLLB培養(yǎng)基 中37°C，200rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒備用。
[0020] 3、基因重組甲魚膠原蛋白功能肽段大腸桿菌Rosetta基因工程菌的構(gòu)建
[0021] 將上述提取得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有34 μ g/mL氯 霉素和50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，待其長出陽性克隆即為基因重組甲魚膠原蛋 白功能片段大腸桿菌Rosetta基因工程菌。
[0022] 4、制備基因重組甲魚膠原蛋白功能肽段
[0023] 挑取上述陽性克隆接種于5mL LB培養(yǎng)基中37°C，200rpm培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng) 的菌液按菌液：LB培養(yǎng)基為1 : 100的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng) 至OD6c?的值為0. 6-0. 8,加入終濃度為lmmol/L的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)誘 導(dǎo)表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，4°C，5000rpm離心10min收集菌體，菌體用與原始菌液體積相同 的 PBS(1L 溶液中含有 NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KH2PO4O. 2g，ρΗ7· 4)重懸 后4°C，5000rpm離心10min收集沉淀以洗絳菌體，重復(fù)上述洗絳步驟一次。將最后得到的 菌體按每克濕菌體加入5mL PBS重懸，超聲波破碎細(xì)胞，破碎條件為：300W，破2s，停8s，120 個(gè)循環(huán)。
[0024] 將上述破碎后的菌液4°C，12, OOOg離心20min收集包涵體，包涵體用40mL PBS重 懸后4°C，12, OOOg離心20min以洗絳沉淀，重復(fù)上述洗絳步驟兩次，最后得到的包涵體用 5-1〇!1^的尿素緩沖液（該緩沖液含有2〇11111^8-!1(：1、81尿素、50〇1111恥(：1，51111咪唑，？!1調(diào) 至8. O再加入ImM β -疏基乙醇）溶解，溶解后的包涵體蛋白用His GraviTrap螯合柱（購 自于GE公司）層析純化、洗脫，得到重組蛋白，即本發(fā)明的重組甲魚膠原蛋白功能肽段。將 純化得到的重組甲魚膠原蛋白功能肽段透析復(fù)性，冷凍干燥至粉末狀即得重組甲魚膠原蛋 白功能肽段。該重組甲魚膠原蛋白功能肽段的分子量為38kDa，含有27個(gè)膠原蛋白特有的 Gly-X-Y重復(fù)域，與GenBank中的蛋白序列比對(duì)顯示本發(fā)明的重組甲魚膠原蛋白功能肽段 與細(xì)粒棘球絳蟲XI型膠原蛋白α 2鏈具有最高的同源性（47% )。
[0025] 重組甲魚膠原蛋白功能肽段抗氧化活性的檢測(cè)。其檢測(cè)方法如下：
[0026] 采用芬頓反應(yīng)體系。具體操作為：取一空白組試管依次加入0. 025mol/L的 磷酸緩沖液（IOOmL 溶液中含有 Na2HPO4 · 12Η200· 716g、KH2PO40.0 68g，pH7. 4) lmL， 40 μ g/mL的番紅花紅lmL，蒸餾水0· 5mL，3wt %過氧化氫ImL (新鮮配制），0· 945mmol/ LEDTA-Fe2+Iml (I. 89mmol/L 的 EDTA 與 I. 89mmol/L 的 FeSO4等體積混合，新鮮配制）；另取 一對(duì)照組試管依次加入0. 〇25mol/L的磷酸緩沖液lmL，40 μ g/mL的番紅花紅lmL，蒸餾水 I. 5mL，3wt%過氧化氫lmL。試驗(yàn)組按順序依次加入0· 025mol/L的磷酸緩沖液lmL，40 μ g/ mL的番紅花紅lmL，重組甲魚膠原蛋白功能肽段0. 5mL，3wt%過氧化氫lmL，0. 945mmol/ LEDTA-Fe2+lml。將上述試管混合均勻后置于37°C水浴中反應(yīng)30min，測(cè)A52tlmi值，按下式計(jì) 算重組甲魚膠原蛋白功能肽段的羥自由基清除率：
[0027] 清除率％ = (A樣品-A空白）/ (A對(duì)照-A空白）X 100%
[0028] 式中，A樣品、A空白、A5iffi分別為重組甲魚膠原蛋白功能肽段、空白組和對(duì)照組的吸光 值。
[0029] 取羥自由基特異性清除劑D-甘露醇代替重組甲魚膠原蛋白功能肽段做相同試 驗(yàn)。
[0030] 經(jīng)檢測(cè)，重組甲魚膠原蛋白功能肽段具有優(yōu)異的抗氧化活性。當(dāng)濃度為lmg/mL、 I. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/mL和3mg/mL時(shí)，重組甲魚膠原蛋白功能肽段的輕自由基清除率 分別為27. 4%、43. 2%、63. 2%、83. 2%和98. 9%，高于同等測(cè)定條件下的D-甘露醇的羥自 由基清除率，高于刺參體壁膠原蛋白[畢琳·刺參（Stichopus japonicus)體壁膠原蛋白 的理化性質(zhì)和生物活性研宄[D].青島：中國海洋大學(xué)，2006.]、尼羅羅非魚魚皮膠原蛋白 [Zeng MY，Guo Y，Liu ZY，Dong SY，Zhao YH，Cui