一種溶藻弧菌檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種溶藻弧菌的檢測(cè)試劑盒，具體包括引物及LAMP實(shí)際反應(yīng)液，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低，操作簡(jiǎn)便。
【專利說(shuō)明】一種溶藻弧菌檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病原菌診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)溶藻弧菌的快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]溶藻弧菌是一種革蘭氏陰性條件致病菌，通常人類感染是因?yàn)樯澈ｕr或者傷口接觸了帶菌的海水或海產(chǎn)品。臨床癥狀主要表現(xiàn)為傷口感染、胃腸炎、中耳炎、眼內(nèi)炎、食物中毒和敗血癥等疾病。目前海洋病原菌檢測(cè)的傳統(tǒng)方法主要包括前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)鑒定，需5~6天出報(bào)告，方法繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而PCR方法，雖然快速、敏感、特異，但對(duì)操作人員要求較高、且需特殊儀器，同樣不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplif1-cation, LAMP)技術(shù)是Notomi等2000年發(fā)明的一種新穎的擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)在具有置換活性的DNA聚合酶(BstDNA polymerase)作用下，利用特別設(shè)計(jì)的四段引物識(shí)別靶基因的六個(gè)區(qū)域，恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，以達(dá)到對(duì)目的基因的高效、特異復(fù)制的目的。另外通過(guò)環(huán)引物的添加，大大加快了反應(yīng)的速度，整個(gè)過(guò)程只需要I~2 h。其結(jié)果可以根據(jù)反應(yīng)的副產(chǎn)物白色沉淀焦磷酸鎂來(lái)判斷是否發(fā)生擴(kuò)增，也可以在反應(yīng)管中加入熒光染料，反應(yīng)后觀察是否變色來(lái)進(jìn)行鑒別。該檢測(cè)技術(shù)較常規(guī)PCR和real-time PCR來(lái)說(shuō)不需要昂貴的設(shè)備、特殊的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和專業(yè)技術(shù)人員。其突出優(yōu)點(diǎn)有:操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)少，且特異性好、靈敏度高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用LAMP技術(shù)對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)的試劑盒。`
[0005]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述試劑盒的檢測(cè)方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
溶藻弧菌快速檢測(cè)試劑盒(LAMP法)，它包括:
(I)6條引物:
表1溶藻弧菌引物
【權(quán)利要求】
1.一種溶藻弧菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括: 引物； 2*反應(yīng)緩沖液； Chelex-1OO 試劑； Bst DNA聚合酶； 鈣黃綠素； 陽(yáng)性對(duì)照DNA ； 陰性對(duì)照DNA ； 所述的引物為6條，分別為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的外側(cè)引物F3和如SEQID N0.2所示的核苷酸序列的外側(cè)引物B3^BSEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的內(nèi)側(cè)引物FIP和如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的內(nèi)側(cè)引物BIP^BSEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的環(huán)引物L(fēng)F和如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列環(huán)引物L(fēng)B ； 所述的2*反應(yīng)的組成及含量為: pH8.8 Tris-HCl 40 mM KCl20 mM MgSO416 mM (NH4)2SO420 mM Tween200.2 % Betaine1.6 M dNTPs1.4 mM MnCl2I mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶藻弧菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下檢測(cè)步驟: 1)取各引物干粉，加去離子水配置成IOOuM保存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)將引物保存液稀釋十倍使用，向Chelex-1OO中加入20ml去離子水，配成5% ChelexlOO溶液； 2)細(xì)菌基因組DNA的提取:取Iml樣品菌液離心棄上清，取沉淀，細(xì)菌沉淀中加入Iml5% ChelexlOO溶液，震蕩混勻后置100°C水浴lOmin，然后立即冰浴lmin，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清即為樣本DNA ； 3)在冰盒上配置25μ I反應(yīng)體系如下: 2*反應(yīng)緩沖液IOuM12.5μ I F3 溶液 IOuM1.Ομ I Β3 溶液 IOuM1.Ομ I FIP 溶液 IOuM1.Ομ I BIP 溶液 IOuM1.0μ I LF 溶液 IOuM1.0μ I LB 溶液 IOuM1.0μ I Bst DNA 聚合酶 8u/ul1.0μ I 鈣黃綠素50uM1.0μ I 樣本 DNA2.0μ I 去尚子水2.5 μ I4)擴(kuò)增:將配置好的反應(yīng)溶液置于恒溫金屬加熱儀中，在63°C的條件下反應(yīng)40分鐘，在80°C條件下恒溫 5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；若反應(yīng)管變?yōu)椴菥G色即可判定含有溶藻弧菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103614486SQ201310673719
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】胡成進(jìn), 劉曉斐, 湯潛 申請(qǐng)人:胡成進(jìn)