鏈球菌auh-jld109及其在柚皮素生物合成中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鏈球菌AUH-JLD109及其在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，屬于微生物及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。鏈球菌AUH-JLD109，保藏號(hào)為CGMCCNo.8033。其應(yīng)用包括下述步驟：（1）混菌種子液的培養(yǎng)；（2）底物柚皮苷與混菌種子液共培養(yǎng)；（3）代謝產(chǎn)物的分離純化。本發(fā)明采用鏈球菌AUH-JLD109使柚皮苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化性能穩(wěn)定，大大提高了柚皮素的轉(zhuǎn)化率，且方法簡(jiǎn)單，原料易得，成本低。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鏈球菌AUH-JLD109及其在柚皮素生物合成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]柚皮素(Naringenin)是二氫黃酮類(lèi)化合物，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗高血糖、抗氧化、解痙孿和利膽等多種生理或藥理功能。早在上世紀(jì)90年代人們就曾認(rèn)識(shí)到柚皮素具有抗癌功效，如Guengerich等于1990年報(bào)道柚皮素而非柚皮苷能抑制黃曲霉毒素BI誘導(dǎo)的致癌作用{Carcinogenesis, 1990，，11:2275-2279) ；Chen 等于 2003 年發(fā)現(xiàn)，較低濃度的柚皮素(40微摩爾/升)即可引起白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴(lài)性；與葡萄糖和鼠李糖結(jié)合的柚皮素(即柚皮苷)在相同濃度下甚至更高濃度(80微摩爾/升)下仍不表現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡作用，而用柚苷酶處理柚皮苷后又產(chǎn)生明顯細(xì)胞凋亡作用，這一研究結(jié)果再次證明柚皮素而非柚皮苷的抗癌活性
2003,66:1139-1150)。此外，RAZA等用柚皮素預(yù)處理雄性小鼠21天后發(fā)現(xiàn)，柚皮素可顯著減弱局部性腦損傷小鼠模型中的氧化應(yīng)激以及受NF-KB調(diào)節(jié)的炎癥進(jìn)程(.Neuroscience, 2013, 230:157-171 )。Ortiz-Andrade等發(fā)現(xiàn)柚皮素具有體內(nèi)外抗高血糖活UDiabetes，Obesity and Metabolism, 2008,10:1097-1104)。我國(guó)學(xué)者廖霞等曾報(bào)道柚皮素對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯抑制作用，且該抑制作用隨濃度的增加而增大m珍國(guó)醫(yī)藥，2Q\Q，2\ (11):2909-2910)。
[0003]柚皮素為天然產(chǎn)物，但因在天然植物中含量較低，直接從植物中提取分離柚皮素的收率也較低。如陳雪峰等采用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法從桃葉中提取柚皮素，通過(guò)試驗(yàn)確定柚皮素最佳提取條件為:乙醇和甲醇混合溶劑(濃度比為甲醇:乙醇=7:3)，溫度為50°C，時(shí)間為5小時(shí),料液比為1:45(克/毫升)，然而在該最佳提取條件下柚皮素的收率僅為5.25%(#^#^,2009,34(5):209-212)。與柚皮素相比，柚皮苷(即與葡萄糖和鼠李糖結(jié)合的柚皮素)則在柑橘屬植物中分布廣泛且含量較高。目前柚皮素的工業(yè)生產(chǎn)多以柚皮苷為底物，采用酸水解或柚苷酶水解這兩種生產(chǎn)方式。劉亞萍(光?變實(shí).驗(yàn)室.，2008，25 (6):1292-1294)提供了酸水解柚皮苷來(lái)制備柚皮素的方法，然而，這種方法需多次結(jié)晶才能獲得純度較高的柚皮素。專(zhuān)利CN 102453011 A通過(guò)酸水解的方法雖獲得的柚皮素的純度較高，但是涉及到的有機(jī)溶劑種類(lèi)多且步驟繁瑣，不適合現(xiàn)代化生產(chǎn)綠色環(huán)保的要求。2003年Hwang等通過(guò)基因工程手段首次以酪氨酸為底物生物合成柚皮素，所設(shè)計(jì)的3套質(zhì)粒系統(tǒng)中以第3套的得率最高，所制得的柚皮素約為400微克/ T^iApplied Microbiology Biotechnology,2003，69 (5): 2699-2706)。此后，Leonard于2008年利用重組大腸桿菌以苯丙氨酸為底物，添加外源丙二酸鹽誘導(dǎo)，并通過(guò)脂肪酸抑制宿主本身丙二酰輔酶A的旁路流失得到186毫克/升的柚皮素{Molecular Pharmaceutics，2.，5 (2): 257-265)。利用基因工程菌生物合成柚皮素的方法雖簡(jiǎn)便，但產(chǎn)量低，不適宜規(guī)?；a(chǎn)。此外，酶水解柚皮苷獲得柚皮素是目前柚皮素制備的另一主要途徑。鄭美瑜等i中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010，10 (4): 141-146)研究證實(shí)成品柚苷酶對(duì)柚皮苷單體的酶解條件為:酶解液中底物質(zhì)量濃度為25克/毫升，酶含量為I酶單位/毫升，酶解時(shí)間為1.0-1.5小時(shí)，此條件下柚皮苷單體可被完全降解。酶法制備柚皮素具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)，但成品柚皮苷酶價(jià)格昂貴，也同樣不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此目前急需找到一種廉價(jià)高效的生物酶源來(lái)代替成品柚皮苷酶制備柚皮素。
[0004]柚苷酶廣泛存在于植物、酵母、真菌及細(xì)菌中，近年來(lái)雖然國(guó)內(nèi)外也從曲霉屬、青霉屬中篩選到高產(chǎn)柚苷酶真菌菌株，但是由于真菌發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶存在一些問(wèn)題如(I)發(fā)酵周期長(zhǎng)、需氧量大、發(fā)酵液粘稠，后期處理困難；(2)幾乎所有菌株都受到葡萄糖的調(diào)節(jié)作用；(3)多數(shù)產(chǎn)柚苷酶真菌為多核細(xì)胞且易形成菌絲體，給菌種的選育造成困難，發(fā)酵過(guò)程中難以建立穩(wěn)定的發(fā)酵系統(tǒng)。這一系列問(wèn)題致使目前柚苷酶的價(jià)格較高。細(xì)菌生長(zhǎng)迅速且遺傳性能穩(wěn)定，利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)柚皮素因操作容易越來(lái)越受到人們關(guān)注。然而，目前國(guó)內(nèi)外僅分離報(bào)道兩株能產(chǎn)柚苷酶(能同時(shí)將結(jié)構(gòu)中的鼠李糖和葡萄糖水解掉的酶)活性的細(xì)菌菌株，且兩株菌產(chǎn)柚苷酶活性均較低。其中一株為Puri等2010年從土壤中分離到的葡萄球菌屬菌株成r/ococci/s xylosus MAK2 (酶活性為8.45酶單位/毫升;Biochemistry2010,162:181-191),另一株為 Pavithra Mukund 等從土壤中分離到的芽孢桿菌屬菌株AaciVJrW1S methy1trophicus (酶活性為12.05酶單位/毫升；Preparative Biochemistry and Biotechnology, do1: 10.1080/10826068.2013.797910)。相比之下，已報(bào)道的多為產(chǎn)a-L-鼠李糖苷酶(即只能將鼠李糖水解掉的酶)的細(xì)菌菌株，如擬桿菌屬(ifecieroiofessp.)、梭桿菌屬(/7W1SoAacieria?sp.)、芽抱桿菌屬(Bacillus sp.)和梭菌屬{Clostridium sp.)等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種鏈球菌{Streptococcussp.) AUH-JLD109,保藏號(hào)為 CGMCCN0.8033。
[0006]本發(fā)明還提供在鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，采用鏈球菌AUH-幾D109使柚皮苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化性能穩(wěn)定，大大提高了柚皮素的轉(zhuǎn)化率，且方法簡(jiǎn)單，原料易得，成本低。
[0007]本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
一種鏈球菌(泣sp.) AUH-JLD109，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8033。
[0008]鏈球菌(StrepiococciAs sp.) AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用。
[0009]其應(yīng)用包括下述步驟:
(1)混菌種子液的培養(yǎng)
將鏈球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的種子液與大腸埃希氏菌{Escherichiacoli) AUH-D2-1的種子液接種于LB液體培養(yǎng)基或混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到混菌種子液；所述大腸埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8031 ；
(2)底物柚皮苷與混菌種子液共培養(yǎng)
將步驟(1)得到的混菌種子液轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基或混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入柚皮苷粗品母液進(jìn)行共培養(yǎng)；所述混菌發(fā)酵培養(yǎng)基的重量組成為:1.0-1.5%可溶性淀粉，1.0-2.0%蛋白胨，磷酸鹽0.3-0.7%和0.002%-0.008%的硫酸鐵，余量為水；磷酸鹽為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的混合物，磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀的質(zhì)量比為2:1 ；(3)代謝產(chǎn)物的分離純化。
[0010]優(yōu)選的，步驟(1)中鏈球菌AUH-JLD109的種子液通過(guò)下述方法培養(yǎng):將低溫冷凍保存的鏈球菌AUH-JLD109融化并按15-20%接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養(yǎng)基的試管中，37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)；再以10%接種量將試管中的菌株AUH-JLD109重新轉(zhuǎn)接到新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時(shí)作為種子液。
[0011]優(yōu)選的，步驟(1)中大腸埃希氏菌AUH-D2-1的種子液通過(guò)下述方法培養(yǎng):將低溫冷凍保存的大腸埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10-15%接種量接種到盛有新鮮LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)下培養(yǎng)24小時(shí),再以10%接種量將試管中菌株AUH-D2-1重新轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)18-24小時(shí)作為種子液。
[0012]優(yōu)選的,步驟(1)中將鏈球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的種子液與大腸埃希氏菌{Escherichia coli) AUH_D2_1的種子液各以10%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)。
`[0013]優(yōu)選的，步驟(2)混菌種子液按10-15%接種，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的終濃度為5.5-6.5毫摩爾/升，37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天。
[0014]優(yōu)選的，步驟(2)中柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷濃度為110-160毫摩爾/升。
[0015]優(yōu)選的，步驟(2)中采用混菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0016]進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟(3)中分離純化為:等體積的乙酸乙酯將培養(yǎng)物萃取2次，萃取液過(guò)濾后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制備柱在HPLC上進(jìn)行分離，得到代謝產(chǎn)物柚皮素。
[0017]鏈球菌(StrepiococciAs sp.) AUH-JLD109是從健康人糞便中分離得到的一株革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧細(xì)菌菌株，該菌株能將中藥化橘紅乙醇水溶液提取物的柚皮苷粗品高效轉(zhuǎn)化為柚皮素。推測(cè)是柚皮苷粗品在鏈球菌(Sire/?iococcM sp.) AUH-JLD109 (為方便書(shū)寫(xiě)，在這里將鏈球菌StrepiococciAs sp.AUH-JLD109簡(jiǎn)稱(chēng)菌株AUH-JLD109,以下均使用該轉(zhuǎn)化菌株的簡(jiǎn)稱(chēng)形式)產(chǎn)生的柚苷酶作用下首先被水解掉一個(gè)鼠李糖生成普魯寧，然后再
水解掉一個(gè)葡萄糖生成柚皮素，有關(guān)柚皮素微生物生物合成途徑如下所示:
【權(quán)利要求】
1.一種鏈球菌(泣sp.) AUH-JLD109，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8033。
2.如權(quán)利要求1所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟: (1)混菌種子液的培養(yǎng) 將鏈球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的種子液與大腸埃希氏菌{Escherichiacoli) AUH-D2-1的種子液接種于LB液體培養(yǎng)基或混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到混菌種子液；所述大腸埃希氏菌(Escherichia coli) AUH-D2-1，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8031 ； (2)底物柚皮苷與混菌種子液共培養(yǎng) 將步驟(1)得到的混菌種子液轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基或混菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入柚皮苷粗品母液進(jìn)行共培養(yǎng)； (3)代謝產(chǎn)物的分離純化； 所述混菌發(fā)酵培養(yǎng)基的重量組成為:1.0-1.5%可溶性淀粉，1.0-2.0%蛋白胨，磷酸鹽0.3-0.7%和0.002%-0.008%的硫酸鐵，余量為水；磷酸鹽為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的混合物，磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀的質(zhì)量比為2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟 (1)中鏈球菌AUH-JLD109的種子液通過(guò)下述方法培養(yǎng):將低溫冷凍保存的鏈球菌AUH-JLD109融化并按15-20%接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養(yǎng)基的試管中，37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)；再以10%接種量將試管中的菌株AUH-JLD109重新轉(zhuǎn)接到新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)18-24小時(shí)作為種子液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(1)中大腸埃希氏菌AUH-D2-1的種子液通過(guò)下述方法培養(yǎng):將低溫冷凍保存的大腸埃希氏菌AUH-D2-1融化并按10-15%接種量接種到盛有新鮮LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)下培養(yǎng)24小時(shí)，再以10%接種量將試管中菌株AUH-D2-1重新轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)18-24小時(shí)作為種子液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(1)中將鏈球菌(SirepiococciAs sp.) AUH-JLD109的種子液與大腸埃希氏菌Escherichia coli) AUH_D2_1的種子液各以10%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)混菌種子液按10-15%接種，加入柚皮苷粗品母液使柚皮苷的終濃度為5.5-6.5毫摩爾/升，37 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中柚皮苷粗品母液中底物柚皮苷濃度為110-160毫摩爾/升。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中采用混菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈球菌AUH-JLD109在柚皮素生物合成中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(3)中分離純化為:等體積的乙酸乙酯將培養(yǎng)物萃取2次，萃取液過(guò)濾后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制備柱在HPLC上進(jìn)行分離，得到代謝產(chǎn)物柚皮素。
【文檔編號(hào)】C12P17/06GK103740610SQ201310689588
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】王秀伶, 陳靜, 邵子強(qiáng), 李佳宜 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)