專利名稱：一種檢測豬鏈球菌的試紙及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬鏈球菌的試紙，具體涉及一種檢測豬鏈球菌2型的免疫層 析試紙，還涉及該試紙的制備方法及用途。
背景技術：
人豬鏈球菌病屬國家規(guī)定的二類動物疫病，是一種人畜共患傳染病。人感染豬鏈 球菌病是人類感染豬鏈球菌2型(Str印tococcus suis serotype 2，SS2)等所致的一種 人畜共患疾病。豬鏈球菌屬于蘭氏分類法的R群，有35個血清型，以豬鏈球菌2型流行最 廣，致病性最強。豬鏈球菌不僅可以引發(fā)豬腦膜炎、心內膜炎、敗血癥、關節(jié)炎、多漿膜炎、肺 炎甚至突然死亡，還可以經破損皮膚或黏膜侵入人體，導致人感染發(fā)病，對農場和屠宰場工 人的構成了威脅。人感染豬鏈球菌臨床表現為敗血癥、中毒性休克綜合征(TSS)和腦膜炎。 人感染豬鏈球菌病的主要傳染源是病死豬，主要傳播途徑為宰殺病死豬，切割、清洗病死豬 肉等，手部皮膚有損傷的人員尤易感染。進食未煮熟、煮透的病死豬肉也可引起感染。近年 來我國面臨著豬鏈球菌感染暴發(fā)流行加重的威脅，1998年與2005年豬鏈球菌在我國兩次 爆發(fā)流行，共造成229人感染，其中死亡53例。在我國豬鏈球菌引起人、豬共感染發(fā)病，不 但給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失，也給公共衛(wèi)生和食品安全帶來了威脅。該病引起了世界范 圍的公共衛(wèi)生領域的高度重視，越來越多的研究者開始對豬鏈球菌進行更深入的研究。傳統(tǒng)的對豬鏈球菌病原的分離鑒定主要依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定，然后用 豬鏈球菌高免血清進行凝集試驗分型。生化鑒定雖然能較可靠的檢測鑒定出豬鏈球菌2 型，但其必需以分離出的純菌為基礎，但是這兩種方法操作繁瑣，不利于進行現場的快速診 斷。為提高我國對突發(fā)公共事件相關的安全監(jiān)控能力，迫切需要建立我國具有高效、敏感、 快速、高特異性的檢測技術。膠體金免疫快速診斷技術(快速診斷試紙條)是20世紀90年代以來在單克隆抗 體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術。該 技術主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維素膜(NC)上，膠體金標記試 劑吸附在結合墊上，當待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作用向前移動，溶 解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待測物 和金標試劑的復合物又與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，通過可目測的膠 體金標記物得到直觀的顯色結果。而流離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分 離的目的。膠體金免疫層析快速診斷技術可以在短時間內提供結果，該檢測法快捷、方便、 精確、可靠、廉價而且操作簡易的。到目前為止，尚未見到采用膠體金免疫層析技術檢測豬鏈球菌2型的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了一種檢測豬鏈球菌2型的免疫層析試紙，還公開了該試紙的制備方 法及該試紙的用途。
本發(fā)明的免疫層析試紙為膠體金免疫層析試紙，包括樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收 墊四部分。在膠金墊上有膠體金探針，NC膜上有檢測帶和指控帶，檢測帶和指控帶分別包被 有豬鏈球菌2型抗體及抗豬鏈球菌2型抗抗體。上述豬鏈球菌2型抗體為豬鏈球菌2型。 豬鏈球菌2型抗體可以為豬鏈球菌2型免疫不同動物獲得的抗體，優(yōu)選兔抗豬鏈球菌2型 抗體；制備豬鏈球菌2型抗體，可以選擇醛化的豬鏈球菌2型抗原免疫而成，如甲醛和戊二 醛，優(yōu)選甲醛于37°C滅活7d即可作為免疫原，可保證抗體良好的特異性?？关i鏈球菌2 型抗抗體可以通過免疫不同動物獲得，優(yōu)選羊抗兔免疫血清，可以購買商業(yè)化抗體。上述兩 種在檢測帶和指控帶上包被的抗體可以采用不同濃度，優(yōu)選濃度分別為兔抗豬鏈球菌2型 抗體濃度為2. Omg/ml，羊抗兔免疫血清濃度為0. 5mg/ml。本發(fā)明的檢測豬鏈球菌2型的免疫層析試紙的制備方法包括制備豬鏈球菌2型抗 體；膠體金的制備；膠體金探針的制備；將豬鏈球菌2型抗體和抗豬鏈球菌2型抗抗體在NC 膜上進行包被；將吸收墊、樣品墊及處理后的膠金墊和NC膜疊加粘到PVC板上，組裝成完整 的試紙等步驟。制備豬鏈球菌2型抗體采用直接用豬鏈球菌2型免疫動物的方法進行，獲得的抗 體為多克隆抗體。首先需要制備豬鏈球菌2型抗原，先將豬鏈球菌2型培養(yǎng)，收集菌液后甲 醛滅活即可作為抗原。然后用抗原免疫動物，免疫按常規(guī)方法進行，免疫前和每次免疫后采 血通過ELISA方法測定動物抗體滴度。經過6次免疫后抗體滴度達到一般免疫反應水平， 為107，所獲得的抗體可用于膠體金免疫層析試紙條的制備。獲得的豬鏈球菌2型先要經過 純化，可以采用蛋白A-瓊脂糖親和層析法進行。純化好的抗體透析后-70°C保存?zhèn)溆?。膠體金的制備采用檸檬酸鈉還原法進行制備，獲得直徑約25nm的膠體金。膠體金探針的制備將制備的豬鏈球菌2型抗體用純水透析，而且在使用抗體前 一般要先離心去除易形成的二聚體。用碳酸鉀溶液調節(jié)膠體金溶液的PH值，與制備的豬鏈 球菌2型抗體混合，離心去上清后用含1 % BSA的PBS溶解沉淀，離心后再次重懸沉淀，離心 取上清即為標記好的膠體金探針。其中膠體金溶液的PH值為>8.5，優(yōu)選8.5。豬鏈球菌 2型抗體的最適抗體保護量為22 μ g/mL。接著是將豬鏈球菌2型抗體和抗豬鏈球菌2型多抗抗體在NC膜上進行包被。首先 將豬鏈球菌2型抗體用PBS工作液透析，然后將稀釋好的豬鏈球菌2型抗體和羊抗兔抗體， 分別在NC膜上劃線進行包被，成為T帶和C帶，見圖1。包被的抗體濃度為彡2. Omg/ml,以 2. Omg/ml為最佳，用BSA溶液進行封閉，1. 5%為最佳濃度。本發(fā)明還公開了檢測豬鏈球菌的免疫層析試紙的用途。該用途是通過下列試驗進 行驗證的。首先驗證本發(fā)明試紙的敏感性，將培養(yǎng)的豬鏈球菌稀釋成不同濃度的菌液，加樣 品稀釋液進行檢測，以不含豬鏈球菌2型的樣品液為空白對照。本發(fā)明的膠體金免疫層析 試紙檢測豬鏈球菌的靈敏度為1. OX 106CFU/ml。然后驗證本發(fā)明試紙的特異性。將培養(yǎng)的豬鏈球菌、其它鏈球菌屬以及金色葡萄 球菌、單增李斯特菌、甲型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、產氣莢膜梭菌分別培養(yǎng)，稀釋成濃 度> 108CFU/ml的菌懸液，用本發(fā)明檢測豬鏈球菌的免疫層析試紙進行檢測。用該試紙條檢 測豬鏈球菌2型國內及國外的流行株與非流行株以及致病株與非致病株，結果均為陽性； 尤其令人驚奇的是，盡管該抗體采用醛化的豬鏈球菌粗抗原制備，但具有良好的血清特異
4性，除豬鏈球菌1/2型外，該試紙條與其它血清型的豬鏈球菌無交叉反應。說明該試紙條檢 測范圍廣，特異性好。該免疫試紙與常見的致病菌和鏈球菌屬的15個群也均無交叉反應。 依據以上的結果顯示，該試紙條具有良好的特異性。接著是驗證本發(fā)明試紙的穩(wěn)定性。分別在4°C和室溫保存3個月，在37°C存放15 天后，檢測結果均未發(fā)生變化，說明試紙穩(wěn)定性好。本發(fā)明的試紙還經過了模擬標本的檢測。通過檢測，本發(fā)明試紙的靈敏度結果可 達到106CFU/ml，空白樣本的檢測結果為陰性。本發(fā)明的檢測豬鏈球菌的免疫層析試紙是應用豬鏈球菌2型的多克隆抗體，根據 雙抗體夾心法的原理研制而成?？朔藗鹘y(tǒng)細菌免疫學診斷試劑的采用全菌抗原制備抗 體、特異性較差、常與近緣細菌存在交叉反應、實用性較差等缺陷。利用本發(fā)明試紙檢測豬 鏈球菌2型，標本處理簡單，10分鐘即可觀察結果，最低可檢出106CFU/ml。通過對模擬樣 品的檢測，其靈敏度高、特異性好。尤其令人驚奇的是，盡管該抗體采用醛化的豬鏈球菌粗 抗原制備，但具有良好的血清特異性，除豬鏈球菌1/2型外，該試紙條與其它血清型的豬鏈 球菌無交叉反應。也就是說，本發(fā)明使用的抗體雖然是多抗，但制備的膠體金免疫層析試紙 具有較高的特異性，這是本領域技術人員所不能想到的，具有意想不到的效果。本發(fā)明的試 紙具有敏感性、特異性、簡便性和快速性等特點，適于在臨床和現場使用，可以作為一種人 豬鏈球菌初篩的診斷方法，該試紙的應用有利于我們對豬鏈球菌疫情的了解和控制。


圖1為檢測結果判讀示意2為豬鏈球菌2型血清效價測定結果圖3為試紙條的敏感性檢測。其中1為空白對照2，3，4，5，6為豬鏈球菌2型，其 中 2 為 1. OX 108CFU/ml，3 為 1. OX 107CFU/ml，4 為 1. OX 106CFU/ml，5 為 1. OX 105CFU/ml，6 為 1. 0X104CFU/ml。圖4為試紙條的穩(wěn)定性檢測。其中1為金色葡萄球菌108CFU/ml，2為豬鏈球菌2 型 108CFU/ml，3 為 S. suis 149 IO6 CFU/ml，4 為空白對照
具體實施例方式實施例一豬鏈球菌2型抗體制備一、材料菌株豬鏈球菌2型(豬鏈球菌S. suis 149或98012，也可采用相同血清型豬鏈 球菌2型菌株)，金色葡萄球菌，甲型副傷寒沙門氏菌，大腸埃希菌，豬鏈球菌2型，產氣莢膜 梭菌由軍事醫(yī)學科學院微生物所提供，15種血清型的豬鏈球菌由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供， 其余菌株購于中國藥品生物制品檢定所。實驗動物2kg左右新西蘭大耳白兔2只，雌性。由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心 提供。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，THB培養(yǎng)基，血平板均按常規(guī)方法制備主要設備與儀器生物安全柜(美國NUAIR公司)，Spectra Max Plus全自動蛋 白核酸酶聯檢測儀(美國Molecular Devices公司)，ST-I微型半干轉移電泳儀(大連競邁生物科技公司生產)，AKTA FPLC蛋白純化分析儀(瑞典AmershamPharmacia Biotech 公司)，隔流噴金劃線機(美國IMAGEN ARISTA公司)，ND-1000超微量蛋白定量儀(美國 NanoDrop公司)，酶聯免疫吸附儀，868型pH計(美國Thermo公司)。二、方法結果1.豬鏈球菌2型抗原的制備病原菌為完全抗原，可以直接免疫動物獲得抗體，所以記數并滅活的S. suis 149 即為制備豬鏈球菌2型多克隆抗體的抗原。將保存的豬鏈球菌S. suisl49接種至THB液體 培養(yǎng)基中，于37°C靜置培養(yǎng)7h，無菌水收集菌液，血平板計數。1 %甲醛于37°C滅活7d即可 作為免疫原。2.豬鏈球菌2型多克隆抗體的制備和鑒定2. 1豬鏈球菌2型多克隆抗體的制備豬鏈球菌2型多克隆抗體通過免疫2kg左右的新西蘭大白兔獲得。在第一次免疫 前耳靜脈取血ELISA測定免疫動物是否具有天然抗體，若有則棄用。若無則從第二次免疫 開始每次免疫后1周耳靜脈取血，進行間接ELISA測抗體效價。免疫方案見表1。表1豬鏈球菌2型免疫方案 2. 2豬鏈球菌2型抗體效價測定免疫后耳靜脈取血500μ L，37°C放置lh，然后3000rpm離心lOmin，再IOOOOrpm離 心3min，上清即為免疫血清。以間接ELISA測定血清中抗體的效價。方法如下1)用包被緩沖液稀釋的菌為109CFU/mL，100 μ L/孔，4°C包被過夜或37°C 1 2小 時，2)用 PBST 洗孔，100 μ L/ 孔，洗 3 遍，每次 3min，3)用含3% BSA的PB封閉，200 μ L/孔，置于37°C孵箱內進行封閉2小時，4) PBST 洗 3 遍，100 μ L/ 孔，每次 3min，5)用含3% BSA的PBST梯度系列稀釋一抗，每孔加100μ L，37°C作用Ih6) PBST 洗 3 遍，100 μ L/ 孔，每次 3min7)用含 3% BSA 的 PBST 稀釋酶標抗體(1 2000)，每孔 100 μ L，37°C，30 45min8) PBST 洗 4 遍，100 μ L/ 孔，3min/ 次9)加A、B顯色液，每孔各1滴，避光顯色，當陰性對照出現藍色時加終止液 (2NH2S04)終止，450nm測得0D，以空白孔調零，若待測孔0D450值大于或等于陰性對照孔 2. 1倍，即判定為陽性，從而得出血清效價。經過7周6次免疫后，抗體滴度可達107，已達到一般免疫反應的程度，因此，本試
6驗獲得的豬鏈球菌2型抗體可用于膠體金免疫層析試紙條的制備。具體結果見圖2。2. 3多克隆抗體的純化采用蛋白A-瓊脂糖親和層析法純化抗體，用MabTrapTMG親和層析柱純化抗 體，樣品經平衡緩沖液(PB，5mmol/L，pH7. 0)適當稀釋后，上樣于用平衡緩沖液平衡好的 MabTrapTMG親和柱，用A液徹底洗去雜蛋白后，換洗脫液B液將抗體洗下，收集洗下的抗體， 收集試管事先已加10%的lmol/L，pH 9. 0的Tris-HCI，使pH恢復至7. 0左右，以免失去活 性。純化好的抗體用PBS工作液透析4°C兩天，再lOOOOr/min離心30min，收集上清，_70°C 保存?zhèn)溆?。實施例二豬鏈球菌2型膠體金測試紙的制備一、材料采用市購化學試劑，同實施例一。二、方法結果1.膠體金的制備采用檸檬酸鈉還原法制備直徑約25nm的膠體金。將HAuC14先配成1 %的水溶液， 取99ml純水加熱至沸騰.攪動下加入ImLl %的HAuC14，再同時加1. 5mL檸檬酸三鈉水溶 液。繼續(xù)加熱煮沸15min左右，觀察到加入液體后顏色先變成黑，隨后慢慢變成酒紅色，看 到酒紅色后繼續(xù)加熱3 5min后停止加熱，去離子水補至體積lOOmL。得到的即為直徑為 25nm的膠體金，冷卻后4°C避光保存。2.豬鏈球菌2型膠體金測試條的制備2. 1豬鏈球菌2型抗體標金前的處理由于豬鏈球菌2型抗體既要用于標金，也要用于噴膜，所以抗體在使用前的處理 也是有所不同。把豬鏈球菌2型抗體分別用PBS工作液和純水透析，以此來確定適于標金 和噴膜的最佳抗體處理方法。結果根據發(fā)明人實際試驗摸索的條件顯示，不同的使用目的有不同的要求用 于噴膜的豬鏈球菌2型抗體要用PBS工作液透析，使其有一定的離子強度，而利于包被。 用于標金的豬鏈球菌2型抗體要求不含有鹽離子，必須用純水透析；抗體在使用前一般置 于-20°C保存，很容易形成二聚體而影響標金，特別是抗體濃度較高時，所以在使用抗體前 一般要先 4°C IOOOOrpm 離心 30min。2. 2膠體金標記豬鏈球菌2型抗體的最佳pH值的測定試驗用0. lmol/L的碳酸鉀溶液將膠體金溶液的pH值分別調節(jié)到6. 0,6. 5,7. 0,7. 5、 8. 0,8. 5,9. 0，各取ImL加入用0. 01mol/L的PBS (pH7. 2)稀釋為0. 2mg/ml的兔抗豬鏈球 菌2型抗體100 μ L，混合均勻，室溫反應10分鐘，靜置2小時，觀察溶液顏色變化。然后 12000rpm離心10分鐘，去掉上清，加入含1 % BSA的PBS溶解沉淀，以沉淀完全溶解呈均勻 的透明紫紅色溶液管的PH值為最佳。試驗結果如表2-4所示，pH ( 7. 5各管中溶液顏色呈不同程度的藍色，pH彡7. 5， 各管中溶液顏色無變化，離心后pH彡8. 0的標記管中沉淀不能完全溶解，pH ^ 8. 5的標記 管中沉淀完全溶解，溶液呈透明酒紅色，如表2. 4所示。因此，膠體金標記的最佳pH值為 8. 5。表2. 4豬鏈球菌2型抗體膠體金最佳pH值的測定 2. 3豬鏈球菌2型抗體最佳標金量的測定試驗(試管觀察法)膠體金是一種很不穩(wěn)定的膠體，特別是調節(jié)好pH值后，但是加入適當的蛋白后能 使膠體金穩(wěn)定。所以必須確定膠體金標記豬鏈球菌2型抗體的最佳標記量。測量其最佳 標記量必須在最佳PH值和離子濃度情況下進行。將膠體金調至最佳pH。用O.Olmol/L的 PBS (pH7. 2)稀釋兔抗豬鏈球菌2型抗體至0. 2mg/mL。按表2操作。表2試管觀察法測定穩(wěn)定膠體金最小標記量 靜置后觀察，含抗體量少的管呈現出由紅變藍的聚沉現象，而加入抗體達到或超 過最低穩(wěn)定量的試管中的溶液則保持紅色不變。使紅色保持不變的抗體含量最低的試管的 抗體量就是抗體的最適保護量，在此基礎上增加20%為穩(wěn)定膠體金的抗體的最佳標記量。將膠體金調至pH8. 5，用0. 01mol/L的PBS (pH7. 2)稀釋兔抗豬鏈球菌抗體0. 2mg/ mL。按表2加入各種試劑后，觀察溶液凝聚狀況，如表3結果顯示，含抗體量少的管呈現出由 紅變藍的聚沉現象，而加入抗體達到或超過最低穩(wěn)定量的試管中的溶液則保持紅色不變。 因此，豬鏈球菌2型膠體金探針的最適抗體保護量為22 μ g/mL。表3豬鏈球菌2型抗體膠體金最佳標記量的測定 2. 4膠體金探針的制備用0. lmol/L的K2CO3調整膠體金pH至8. 5，取Iml置于1. 5mlEP管中，加0. 2mg/ ml的豬鏈球菌2型抗體110 μ 1，混勻30min后，加10% BSA 100 μ 1，混勻30min后(或4°C 過夜)在 4°C下，12000r/min 離心 30min 后，用 Iml 重懸液(0. 01mol/L Tris_HCl，pH 8.2，
BSA，5%蔗糖)重懸沉淀；再于4°C下12000r/min離心30min后，用500 μ 1重懸液重懸 沉淀4°C下lOOOr/min離心4min，上清即為膠體金探針，4°C保存。
2. 5最佳噴膜濃度和最佳封閉濃度的確定試驗用O.Olmol/L的PB(pH7.2)把豬鏈球菌2型抗體和羊抗兔抗體分別(稀釋為 3. 5,2. 5,2. 0,1. 5,1. 0,0. 5mg/mL濃度，而且每個濃度的抗體均含有2. 0 % U. 5 % U. 0 %, 0.75%、0.5%BSA的各一管，用于封閉。取稀釋好的豬鏈球菌2型抗體(T帶)和羊抗兔抗 體(C帶)，見圖1，用隔流噴金劃線機在NC膜上劃線，把劃完線的NC膜置于37°C干燥2h。 用豬鏈球菌2型的菌懸液和不含豬鏈球菌2型的空白對照同時檢測以確定最佳的抗體包被 濃度和封閉濃度。試驗結果顯示，隨著抗體包被濃度的增加，指示線的色澤也逐漸加深，在到達 2. Omg/ml以上后色澤不再加深，因此確定2. Omg/ml為最佳兔抗豬鏈球菌2型IgG抗體包被 點樣濃度。以空白對照不出現假陽性時的BSA濃度為最佳封閉濃度，因此確定1. 5%為最佳 封閉濃度。2. 6試紙條的組裝膠體金測試條由樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊四部分組成。樣品墊和膠金墊采用 玻璃纖維，吸收墊采用吸水濾紙。膠金墊上加膠體金探針，37°C干燥2h。NC膜上檢測帶和指 控帶分別包被兔抗豬鏈球菌2型抗體2. Omg/ml (溶解于lOmmol/L PB, pH 7. 2,1.5% BSA) 及羊抗兔免疫血清0. 5mg/ml (溶解于lOmmol/L PBS, pH 7. 2)。噴好膜后37°C干燥1. 5h。 將吸收墊、樣品墊及處理后的膠金墊、NC膜疊加粘到PVC板上，組裝成完整的試紙條，然后 切割成4mm/條，干燥避光保存。2. 7檢測結果判讀取50 μ 1 的待測樣品和 50 μ 1 樣品處理液(1% Tween-20，IOmmol PBS，pH8. 5)加 到制備好的試紙條樣品墊上，15min后觀察檢測結果。對結果的判定陽性(+):檢測帶(T) 和質控帶(C)均出現紅色條帶；陰性結果(_)僅質控帶(C)出現一條紅色條帶，在檢測帶 ⑴無紅色條帶出現；無效質控帶(C)未出現紅色條帶。如圖1所示實施例三豬鏈球菌2型膠體金測試紙的評價一、材料同實施例一二、方法結果1.豬鏈球菌2型試紙條的敏感性試驗將菌株S. suis 149劃線接種于含5%羊血的哥倫比亞瓊脂血平皿上，37°C，5% C02培養(yǎng)24h，挑取菌落，轉接THB液體培養(yǎng)基中，37°C,5% C02培養(yǎng)6h，4°C 8000r/min離心 lOmin，再以PBS稀釋成不同數量級的菌懸液，涂布血平板進行菌落記數。取100 μ 1不同稀 釋度的菌液加等體積樣品稀釋液(1% Tween 20, IOmmol/L PBS, ρΗ8. 0)用于檢測。從1. OX 108CFU/ml豬鏈球菌2型樣本10倍系列稀釋，不含豬鏈球菌2型的樣品 液為空白對照，檢測結果見圖3，免疫層析條檢測靈敏度為1.0X106CFU/ml。2.豬鏈球菌2型試紙條的特異性試驗取甘油凍存的豬鏈球菌2型菌種按常規(guī)方法復蘇，接種于含5%羊血的哥倫比亞 瓊脂血平皿上，培養(yǎng)時挑取單個菌落轉接Todd-Hewitt broth (THB)培養(yǎng)基，37°C，5 % C02 培養(yǎng)；金色葡萄球菌、單增李斯特菌、甲型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、產氣莢膜梭菌，用 比濁法制備108CFU/ml菌液，取100 μ 1菌液加等體積樣品稀釋液用于檢測。取不同菌株的新鮮菌懸液(濃度> 108CFU/ml)，用免疫試紙進行檢測。應用該法
9檢測豬鏈球菌15個血清型，僅與SS1/2有交叉反應。SS1/2同時含有1型和2型抗原菌株， 因此試紙條不能區(qū)分SS2與SS1/2。用該試紙條檢測豬鏈球菌2型國內及國外的流行株與 非流行株以及致病株與非致病株，結果均為陽性，說明該試紙條檢測范圍廣，特異性好。該 免疫試紙與常見的致病菌和鏈球菌屬的15個群均無交叉反應。依據以上的結果顯示，該試 紙條具有良好的特異性。3.豬鏈球菌2型試紙條的穩(wěn)定性試驗將膠體金免疫層析試紙條分別于4°C和室溫保存3個月，37°C存放15d后取豬鏈 球菌2型菌懸液(濃度為108CFU/ml和106CFU/ml)和金黃色葡萄球菌(濃度為109CFU/ml) 進行檢測，并與同樣的PBS溶液做為樣品空白對照。試驗結果顯示將膠體金免疫層析試紙條分別于4°C和室溫保存3個月，37°C存放 15d后取出檢測，結果見圖4，檢測結果未見改變。4.模擬標本檢測絞碎的瘦肉50mg和血清100 μ 1，分別加入到Iml含不同濃度豬鏈球菌2型的樣品 稀釋液中，混勻，靜置IOmin或短暫離心(SOOOrpm離心15s)，取樣品進行檢測。檢測結果表明，對瘦肉和血清模擬標本檢測靈敏度結果仍可達到106CFU/ml?？瞻?樣本的檢測結果為陰性。血清由于其組分和粘稠度等的原因，在NC膜上的層析速率慢，但 檢測檢測靈敏度也能達到106CFU/ml。
權利要求
一種檢測豬鏈球菌2型的免疫層析試紙，包括樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊，其特征在于膠金墊上有膠體金探針，該探針標記有豬鏈球菌2型抗體，NC膜上有檢測帶和質控帶，檢測帶包被有豬鏈球菌2型抗體，其中豬鏈球菌2型抗體為針對豬鏈球菌2型抗原的多克隆抗體。
2.根據權利要求1所述檢測豬鏈球菌2型的免疫層析試紙，其中豬鏈球菌2型抗體為 采用醛化滅活的豬鏈球菌2型抗原免疫制備的兔抗豬鏈球菌2型抗體。
3.根據權利要求2所述檢測豬鏈球菌2型的免疫層析試紙，其中兔抗豬鏈球菌2型抗 體濃度為2. Omg/ml。
4.權利要求1或2所述檢測豬鏈球菌2型的免疫層析試紙的制備方法，包括如下步驟(1)制備豬鏈球菌2型抗體；(2)膠體金及標記有豬鏈球菌2型抗體的膠體金探針的制備；(3)將豬鏈球菌2型抗體和抗豬鏈球菌2型多抗抗體噴于NC膜上進行包被；(4)將吸收墊、樣品墊及處理后的膠金墊和NC膜疊加粘到PVC板上，組裝成完整的試紙。
5.根據權利要求4所述方法，其中制備豬鏈球菌2型抗體采用直接用醛化滅活的豬鏈 球菌2型抗原免疫動物進行，獲得的抗體為多克隆抗體。
6.根據權利要求4或5所述方法，其中制備豬鏈球菌2型抗原采用甲醛滅活，豬鏈球 菌2型抗體及抗豬鏈球菌2型抗抗體分別為兔抗豬鏈球菌2型抗體和羊抗兔免疫血清，二 者濃度分別為2. Omg/ml和0. 5mg/ml。
7.根據權利要求4或5所述方法，其中樣品墊和膠金墊采用玻璃纖維，吸收墊采用吸水 濾紙ο
8.權利要求1或2所述免疫層析試紙在檢測豬鏈球菌2型中的用途。
9.根據權利要求7所述用途，檢測豬鏈球菌2型靈敏度達到106CFU/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測豬鏈球菌2型的試紙，還公開了該試紙的制備方法和用途。本發(fā)明的檢測試紙包括樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊四部分，采用膠體金免疫層析技術制備。本發(fā)明的檢測試紙的制備包括制備豬鏈球菌2型多克隆抗體、制備膠體金、制備膠體金探針、噴膜和試紙條組裝等步驟。采用本發(fā)明的檢測豬鏈球菌2型的試紙進行檢測，10分鐘即可觀察結果，最低可檢出106CFU/ml豬鏈球菌2型菌。該膠體金試紙具有很強的特異性，僅與2型和1/2型豬鏈球菌反應，而與其它血清型豬鏈球菌和其它族的鏈球菌無交叉反應。該試紙具簡便和快速等特點，可以作為一種人豬鏈球菌2型初篩的診斷方法，適于在臨床和現場使用。
文檔編號G01N33/532GK101900729SQ20091013349
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月29日 優(yōu)先權日2009年5月29日
發(fā)明者楊圣佐 申請人:楊圣佐