一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將葡萄糖氧化酶524位點(diǎn)的甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并轉(zhuǎn)化入畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115中，經(jīng)篩選鑒定得到一株較原有菌株催化效率提高的菌株。該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶在50mL搖瓶上酶活64.6U/mL，比野生型提高了近10%。催化效率Kcat/Km為76.98mM-1·s-1，比野生型（16.73mM-1·s-1）提高了近4.5倍。
【專利說(shuō)明】一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬于酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面將其應(yīng)用于血糖測(cè)定以來(lái)，GOD被廣泛應(yīng)用于食品飼料醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。
[0003]在食品工業(yè)中，由于氧的存在引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。目前許多國(guó)家已將GOD作為公認(rèn)的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于將葡萄糖氧化形成過(guò)氧化氫和葡萄糖酸。利用其專一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析儀能快速準(zhǔn)確簡(jiǎn)易地測(cè)定各種食品中的葡萄糖含量指導(dǎo)生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中GOD作為試劑盒酶電極等用于血清(漿)尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑牙垢和齲齒的形成，防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外由于可以催化生成H2O2，還可用于對(duì)H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境調(diào)節(jié)飼料消化促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。含葡萄糖氧化酶乳酸過(guò)氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染腹瀉并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。
[0004]從動(dòng)植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國(guó)及美國(guó)均采用點(diǎn)青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D,日本常用尼奇青霉,俄羅斯用生機(jī)青霉。近年報(bào)道膠霉屬(Clioctadium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產(chǎn) G0D。
[0005]產(chǎn)量低、酶活低、檢測(cè)方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素，國(guó)內(nèi)外為此做了大量工作并取得了明顯進(jìn)展。目前國(guó)外生產(chǎn)的GOD廠家主要是德國(guó)的Boehringer和日本的TOYOBO0規(guī)?；a(chǎn)高活性的GOD還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)GOD的同時(shí)產(chǎn)生大量雜蛋白分離提取復(fù)雜成本高。同時(shí)，葡萄糖氧化酶在生物傳感器方面一直有著很廣泛和重要的應(yīng)用前景。繼人們采用葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧電極而檢測(cè)血糖水平之后，第二代傳感器采用人工電子受體(又被稱為電子介質(zhì)或氧化還原染料)以代替氧作為電子受體。然而這一應(yīng)用仍存在一些問(wèn)題，譬如:采用氧化酶(GOD)的電子介質(zhì)型生物傳感器很容易受到樣品中的溶解氧影響，因此采用對(duì)氧低敏感度的氧化酶相對(duì)來(lái)說(shuō)具有很大的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明旨在提供一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，將第524位的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟 ;所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L。
[0007]編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0008]所述突變體M524L的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本發(fā)明還提供了一株產(chǎn)所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達(dá)編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
[0010]所述基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟:PCR或化學(xué)合成得到編碼突變體M524L的基因，連接表達(dá)載體pPIC9K，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115，獲得基因工程菌。
[0011]利用所述基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟:(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化后，在30°C、200rpm下培養(yǎng)至OD6tltl=L 6-1.7，作為種子液；(2)將種子液以2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)；(3)當(dāng)在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl=L 2-1.5時(shí)，收集菌體，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。
[0012]所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油IOmL, YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。
[0013]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。
[0014]本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶突變體M524L在搖瓶中的酶活比對(duì)照菌株的酶活提高了近10%，催化效率Kcat/Km為76.98^ ? s'比野生型(16.73mM_1 ? s’提高了近4.5倍。降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)上具有重大應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1:各株突變菌株`的葡萄糖氧化酶的酶活比較。
[0016]圖2:各株突變菌株的葡萄糖氧化酶的比酶活比較。
[0017]圖3:催化效率提高型葡萄糖氧化酶蛋白電泳(SDS-PAGE) ；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:突變株M524L純化后；3:突變株M524L純化前。
[0018]圖4:各株突變葡萄糖氧化酶的pH穩(wěn)定性比較。
[0019]圖5:各株突變葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0020]葡萄糖氧化酶酶活測(cè)定方法:G0D活性測(cè)定采用鄰-聯(lián)(二)茴香胺分光光度法。在有氧的條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過(guò)氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(lián)(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。測(cè)540nm處吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。I個(gè)葡萄糖氧化酶活力(IU)定義為:在30°C、pH6.0的條件下，Imin將I mo I的P -D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為一個(gè)葡萄糖氧化酶酶活力單位。
[0021]實(shí)施例1重組菌的構(gòu)建及鑒定
[0022]以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，分別將第524位的甲硫氨酸M、第305位的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟。所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L、M305L。
[0023]以 Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D (CCTCC NO:M2012266)中的重組質(zhì)粒PPIC9K-G0D為模板，定點(diǎn)突變獲得含有不同突變GOD基因的載體pPIC9K_G0D，或分別化學(xué)合成突變后的基因、連接表達(dá)載體PPIC9K。
[0024]所用定點(diǎn)突變引物為:
[0025]M305L-F:5’GAATATTCCGGTATCGGACTGAAGTCCATCCTGGAG3’ ；
[0026]M305L-R:5’CTCCAGGATGGACTTCAGTCCGATACCGGAATATTC3’ ；
[0027]M524L-F:5’GTACTTGCTCCATGCTGCCGAAGGAGATG3’ ；
[0028]M524L-R:5’ATCTCCTTCGGCAGCATGGAGCAAGTAC3’ ； [0029]PCR反應(yīng)體系:0.2mL PCR管中按順序加入以下試劑:5XFD PCR buffer5 u I;DNTPMixture2 u I;模板DNAl u I ;上游引物各Iu I ；phusion酶0.5 y I ;加雙蒸水至終體積為 25iil。5XFD PCR buf f er5 u I; DNTP Mixture2 y I;模板 DNAl y I ;下游引物各 I y I ;phusion酶0.5 ill ； DMSO 1.5 u I加雙蒸水至終體積為25 yl。反應(yīng)5個(gè)循環(huán)后，將對(duì)應(yīng)PCR反應(yīng)液混合，繼續(xù)反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增條件:98°C預(yù)變性3min ;98°C變性15s ;53°C退火30s ;72°C延伸llmin (5個(gè)循環(huán))；72°C延伸IOmin0混合后擴(kuò)增條件:98°C變預(yù)變性3min ；98°C變性 15s ;53°C退火 30s ;72°C延伸 llmin (25 個(gè)循環(huán))；72°C延伸 IOmin0
[0030]限制性內(nèi)切酶DpnI消化后，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，轉(zhuǎn)化菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。最終獲得分別含有突變氨基酸GOD基因的載體PPIC9K-G0D。GOD突變體M524L的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，GOD突變體M305L的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。將測(cè)序正確的pPIC9K-G0D分別電擊轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，得到基因工程菌。
[0031]畢赤酵母的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)法:GS115于50mL YPD中培養(yǎng)至OD6tltl=L 2-1.5離心收集細(xì)胞；依次用400mL冰冷的無(wú)菌水洗兩次細(xì)胞，再用40mL冰冷的lmol/L的山梨醇洗一次細(xì)胞，重懸細(xì)胞于lmLlmol/L的山梨醇中。100 u L原生質(zhì)體與5-10 u g線性化質(zhì)粒DNA(MSSI切)混合轉(zhuǎn)入冰冷的lmol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養(yǎng)基。30°C培養(yǎng)4_6天后挑取單克隆。
[0032]實(shí)施例2高表達(dá)菌株的篩選。
[0033]分別制備含lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL遺傳霉素的YPD平板,將MD培養(yǎng)基上的單克隆依次點(diǎn)板到不同濃度的YPD平板上培養(yǎng)48小時(shí)后，挑取形態(tài)較大的菌落進(jìn)行下一步的發(fā)酵培養(yǎng)。
[0034]實(shí)施例3重組菌的酶活測(cè)定和蛋白電泳
[0035]采用實(shí)施例2中獲得的分別表達(dá)突變體M524L、M305L的酵母工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后將在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)到OD6tltl=L 6-1.7的種子以2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量為50mL/500mL)，于30°C、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_=1.2-1.5時(shí)，離心收集全部菌體，生理鹽水洗滌2次，重懸后菌體全部轉(zhuǎn)入50mL(500mL三角瓶)液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于30°C、200r/min搖床培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加l%(v/v)的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。以表達(dá)野生型(即，未經(jīng)突變的出發(fā)G0D)葡萄糖氧化酶的P.pastorisGSl 15為對(duì)照菌株。
[0036]培養(yǎng)基:種子和斜面培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g。
[0037]基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。[0038]誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩沖液。
[0039]發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵上清，對(duì)酶進(jìn)行純化，純化方法是陰離子層析，采用梯度洗脫的方法，最終獲得較純的葡萄糖氧化酶。
[0040]如附圖所示，通過(guò)蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為68kDa的蛋白條帶。同時(shí)在搖瓶過(guò)程中，M524L在發(fā)酵第6天達(dá)到最高酶活64.6U/mL,比對(duì)照菌株的酶活(58.7U/ml)提高了近10%。同時(shí)，相比野生型，突變株M524L的pH穩(wěn)定性有所提高，在pH4-7內(nèi)基本保持50%以上的活力，溫度穩(wěn)定性基本不變。
[0041]純化后的葡萄糖氧化酶M524L經(jīng)計(jì)算Km值為10mM，Kcat為767.98s—1。催化效率Kcat/Km為76.98mM_1.s'比野生型(16.73mM_1 *8^)提高了近4.5倍。對(duì)過(guò)氧化氫的耐受能力也有所提聞。
[0042]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定 的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，將催化活性中心的甲硫氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體，其特征在于，是將第524位的甲硫氨酸M突變?yōu)榱涟彼酟，突變后的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.編碼權(quán)利要求2所述葡萄糖氧化酶突變體的核苷酸。
4.攜帶權(quán)利要求3所述核苷酸的載體、基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，是以畢赤酵母(Pichiapastoris)GSl 15為宿主，以pPIC9K為載體，表達(dá)編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
6.構(gòu)建權(quán)利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，是通過(guò)PCR或化學(xué)合成得到編碼突變體的核苷酸序列，連接表達(dá)載體pPIC9K獲得重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115，獲得基因工程菌。
7.應(yīng)用權(quán)利要求5所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化后，在30°C、200rpm下培養(yǎng)至OD600=L 6-1.7，作為種子液；(2)將種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)；(3)當(dāng)在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl=L 2-1.5時(shí)，收集菌體，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為:胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，甘油10mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0的磷酸緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物 10g/L，甲醇 8mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0 的磷酸緩沖液。
10.權(quán)利要求1所述葡萄糖氧化酶突變體的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103614350SQ201310699636
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 聞一凡, 張娟, 堵國(guó)成, 顧磊, 劉曉筱 申請(qǐng)人:江南大學(xué)