一種綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種麥芽糖α-淀粉酶突變體及其應(yīng)用，所述麥芽糖α-淀粉酶突變體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO:2所示。該突變體是通過對來自綠色糖單孢菌(Saccharomonospora?viridis)的麥芽糖α-淀粉酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程的改造和篩選得到，這種突變體酶在水解淀粉中的應(yīng)用，使其在水解淀粉產(chǎn)物中的麥芽糖含量得到提高，更有利于生產(chǎn)麥芽糖漿。它單獨(dú)水解淀粉得到麥芽糖含量在72％以上的糖漿，并具有很好降低生產(chǎn)成本的潛力。
【專利說明】一種綠色糖單孢菌麥芽糖Cl -淀粉酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶工程和基因工程領(lǐng)域，具體是一種綠色糖單孢菌麥芽糖α -淀粉酶的突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]麥芽糖漿是利用精制淀粉為原料，用酶制劑液化、糖化后，經(jīng)精制、濃縮而成的一
種淀粉糖漿，其成分主要為麥芽二糖(> 50%)、葡萄糖、麥芽三糖、麥芽四糖及四糖以上等。麥芽糖漿中麥芽糖含量的界限規(guī)定并不嚴(yán)格，通常飴糖中麥芽糖的含量為40~50%，有的還高達(dá)60%，高麥芽糖漿中麥芽糖的含量為50~70%，超高麥芽糖漿中麥芽糖含量大于70%，目前工業(yè)上生產(chǎn)糖漿產(chǎn)量較大，且比較普遍的是高麥芽糖漿。
[0003]在麥芽糖生產(chǎn)發(fā)展歷史過程中主要經(jīng)歷的產(chǎn)品有三種:一是普通麥芽糖漿，麥芽糖含量在40~50%之間；二是高麥芽糖漿，麥芽糖含量在50~70%之間；三是超高麥芽糖漿，麥芽糖含量在70%以上。麥芽糖漿中葡萄糖很容易炭化變色影響到麥芽糖漿的品質(zhì)和外觀質(zhì)量，隨著人們對麥芽糖的質(zhì)量，特別是麥芽糖的含量的要求越來越高，以及現(xiàn)代酶工業(yè)的發(fā)展和應(yīng)用更使得超高麥芽糖漿成為目前主要的麥芽糖產(chǎn)品。國際上高質(zhì)量的超高麥芽糖槳的要求是麥芽糖含量高，葡萄含量要低，特別是用于特殊行業(yè)的麥芽糖漿，如用于醫(yī)藥產(chǎn)品和麥芽糖醇的深加工對麥芽糖的含量和葡萄糖的含量的要求更高。
[0004]目前超高麥芽糖漿的生產(chǎn)工藝一般是先利用普通的α-淀粉酶將淀粉控制性不完全水解生成一定DE值的糊精，再利用一種或兩種脫支酶與α -淀粉酶共同作用減少寡糖的含量來獲得超高麥芽糖漿，其實(shí)質(zhì)上就是利用多酶進(jìn)一步水解來最大限度減少葡萄糖和和寡糖的生成以最大限度提高麥芽糖的含量，但是在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)對設(shè)備的要求高，對生產(chǎn)工藝需要進(jìn)行精確的控制。在實(shí)際生產(chǎn)中需要對生產(chǎn)的反應(yīng)條件進(jìn)行緊密的控制，既要保證淀粉充分水解成極限糊精又要避免過度水解生成過多的葡萄糖才能獲得較高的麥芽糖產(chǎn)量，這種緊密的生產(chǎn)工藝要求是制約麥芽糖生產(chǎn)質(zhì)量和成本的關(guān)鍵技術(shù)，也是國內(nèi)很多一般企業(yè)很難達(dá)到的。超純高麥芽糖生產(chǎn)的關(guān)鍵有幾點(diǎn):①控制液化液的DE值；②多種酶協(xié)同作用；③糖化后迅速滅酶，目的是使得一次糖化麥芽糖含量達(dá)到80%，為后續(xù)生產(chǎn)結(jié)晶或注射麥芽糖奠定良好基礎(chǔ)。由于使用α-淀粉酶在產(chǎn)生麥芽糖的同時(shí)也會伴隨較多的葡萄糖，影響到后續(xù)的工藝。目前最常用的真菌α-淀粉酶使用單獨(dú)使用只能生產(chǎn)40~50%的麥芽糖漿，而要生產(chǎn)80%以上超純麥芽糖漿以及生產(chǎn)結(jié)晶麥芽糖用糖漿，需要使用β -淀粉酶，并且以普魯蘭酶為輔助脫支以增加β -淀粉酶的效率才能獲得80%以上的麥芽糖。目前工業(yè)用β_淀粉酶主要從大麥中提取，成本高、價(jià)格昂貴且活力較低，制約了麥芽糖行業(yè)的快速發(fā)展。因此目前麥芽糖生產(chǎn)中尋找更簡單的生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)工藝的可控性，提高麥芽糖的含量，是降低麥芽糖生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。
[0005] 關(guān)于用于生產(chǎn)麥芽糖的α -淀粉酶的相關(guān)專利和研究報(bào)道，美國兩項(xiàng)專利U.SPatent4604355 和 U.S Patent: 6274355 是關(guān)于麥芽糖淀粉 S|(maltogenic amylaseenzyme)的制備方法和使用的專利，這種酶已經(jīng)由諾維信公司商品化，這種酶轉(zhuǎn)化淀粉的直接產(chǎn)物不是麥芽糖而是麥芽三糖以上的高麥芽糖寡糖，比真菌α-淀粉酶容易控制而且生成的葡萄糖少，所以可以進(jìn)一步結(jié)合用其它脫支酶的共同作用就可以將淀粉轉(zhuǎn)化成高麥芽糖糖衆(zhòng)。Petricek M也報(bào)道了從Thermomonospora curvata克隆到的一個新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50%以上的麥芽糖和少量的葡萄糖(PetricekΜ, Tichy P,Kuncova M.Characterization of the alpha-amylase-encoding gene fromThermomonospora curvata.Gene.1992, 112 (I):77_83);Yang CH也報(bào)道了從Thermobifidafusca克隆到一個新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50%以上的麥芽糖和少量的葡萄糖，其同源性和前面Petricek M報(bào)道的有98 %的同源性(Yang CH, LiuWH.Cloning and characterization of a maltotriose-producing alpha-amylase genefrom Thermobifida fusca.J Ind Microbiol Biotechnol.Epub, 2007, 34(4):325-330)；2002年Ammar YB報(bào)道從Streptomyces sp菌屬分離純化到一種新型的麥芽糖α -淀粉酶(Maltose-forming a -Amylase),這種酶在轉(zhuǎn)化淀粉時(shí)在4小時(shí)內(nèi)就可以將淀粉轉(zhuǎn)化成58%的麥芽糖，27.5%的麥芽三糖，14.5%的麥芽四糖和五糖，而且不會產(chǎn)生葡萄糖(Ammar Y B, Matsubara T,Ito K, Iizuka M, Limpaseni T, Pongsawasdi P, Minamiura N.Newaction pattern of a maltose-forming alpha-amylase from Streptomyces sp.and itspossible application in bakery.J Biochem Mol Biol.2002，35 (6): 568-575),它的水解淀粉的特性似乎是一種很有應(yīng)用前景的麥芽糖α -淀粉酶，可惜其沒有相關(guān)基因克隆的報(bào)道。國內(nèi)關(guān)于麥芽糖α-淀粉酶基因的報(bào)道只有訾楠等報(bào)道從地衣芽孢桿菌克隆到生麥芽糖α -淀粉酶的基因，其水解淀粉的產(chǎn)物主要是麥芽糖和葡萄糖(訾楠，沈微，石貴陽，王正祥.地衣芽孢桿菌生麥芽糖α-淀粉酶的基因克隆與鑒定.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào).2009，15 (I): 130~133)。本人也從嗜熱鏈霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)菌屬中克隆到一個麥芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成麥芽糖的含量達(dá)到50%的糖漿(中國專利申請?zhí)?201010045645.9)。
[0006]越來越多的新酶應(yīng)用到生產(chǎn)麥芽糖漿中，但是尋找能單獨(dú)水解淀粉生成麥芽糖含量高的麥芽糖漿的α -淀粉酶，使麥芽糖漿的生產(chǎn)工藝更簡單、提高淀粉的利用率和生產(chǎn)成本更低是本領(lǐng)域目前的研 究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶突變體的基因及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明人在克隆鑒定了綠色糖單孢菌的一個α-淀粉酶的基礎(chǔ)上，利用同源建模推測該淀粉酶的底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基，然后利用定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，再進(jìn)一步篩選獲得一個高產(chǎn)麥芽糖的突變酶。本發(fā)明的綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶突變體，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示?；蛩幋a的α-淀粉酶蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，其中193位組氨酸被替換成谷氨酰胺，273位點(diǎn)的天冬氨酸被替換成谷氨酸。
[0009]基因所編碼的α -淀粉酶蛋白質(zhì)在水解淀粉中的應(yīng)用，單獨(dú)水解淀粉得到的產(chǎn)物為麥芽糖和麥芽三糖以及少量葡萄糖組成的糖漿，其中麥芽糖含量達(dá)到72.1%，比原始酶的59.5%提高了約12%，該突變酶有利于提高麥芽糖漿的麥芽糖含量，在水解淀粉生產(chǎn)麥芽糖中發(fā)揮極大的作用。
[0010]不同來源的α-淀粉酶即使存在一定的同源性，但其分子量大小不同，最適反應(yīng)溫度，最適反應(yīng)PH以及水解淀粉所得到產(chǎn)物組成等酶學(xué)特性上都會有很大差異，因而在用途上也有所不同。本發(fā)明通過基因克隆，外源基因表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)研究等多種復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，證實(shí)這一基因編碼是α -淀粉酶，并通過對該酶的底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行推測，然后進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變、篩選，獲得對淀粉水解產(chǎn)物組成差異等特性的差異的突變子，其最大的特點(diǎn)麥芽糖含量提高了。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的優(yōu)勢:
[0012]1.與目前使用最多的商品化真菌α -淀粉酶相比，真菌α _淀粉水解淀粉的產(chǎn)物主要是麥芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖，真菌α-淀粉酶的最適作用溫度為55°C左右，超過60°C開始失活，最適反應(yīng)pH為4.8~5.4，真菌α -淀粉酶水解淀粉產(chǎn)物只能得到50%左右的麥芽糖，而本發(fā)明的α -淀粉酶具有更高適于反應(yīng)溫度55~65°C，因而更適于工業(yè)化水解淀粉對酶耐較高反應(yīng)溫度的要求，最適反應(yīng)pH在5.5~7.5，更接近中性反應(yīng)條件，在生產(chǎn)中不需要添加酸來調(diào)節(jié)PH值，本發(fā)明的α -淀粉酶水解產(chǎn)物也更簡單，主要產(chǎn)物麥芽糖和麥芽三糖及少量的葡萄糖，沒有低聚糖，水解淀粉產(chǎn)物中麥芽糖能達(dá)到72%左右，在水解淀粉制備麥芽糖漿上具有一定優(yōu)勢，能提高淀粉的利用率。
[0013]2.和原始酶相比，酶學(xué)的熱穩(wěn)定性沒有明顯改變，但其水解淀粉的麥芽糖漿中麥芽糖的含量提高了 12%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是溫度對酶水解淀粉活力的影響的曲線圖。
[0015]圖2是pH對酶水解淀粉活力的影響的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
[0017]實(shí)施例
[0018]1.突變酶的構(gòu)建
[0019]根據(jù)GenBank上綠色糖單孢菌基因組DNA序列中的一個假定為淀粉酶的ORF(G1: 256583961)的氨基酸序列，通過同源建模分析推測V188、K192、H193、12683和D27位點(diǎn)的氨基酸殘基為酶的底物結(jié)合位點(diǎn)，然后根據(jù)G1:256583961的DNA序列設(shè)計(jì)并合成共100個突變酶基因的DNA序列。基因的DNA序列合成采用合成引物后應(yīng)用PCR技術(shù)合成，本實(shí)施方案中未作詳細(xì)說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法均為分子生物學(xué)專業(yè)人員熟悉的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。
[0020]2.突變酶基因的表達(dá)及粗酶制備
[0021]將合成的突變酶的DN序列經(jīng)測序驗(yàn)證后，連接到表達(dá)載體pSEe380上構(gòu)建突變酶基因的表達(dá)質(zhì)粒，然后把表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將導(dǎo)入了表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌在37°C搖床中培養(yǎng)，當(dāng)0D600達(dá)到0.8左右時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)到lmmol/L在37°C繼續(xù)培養(yǎng)20h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進(jìn)行破胞，破胞至菌液澄清，用1200r/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清液即為粗酶液，可用于下一步的水解淀粉產(chǎn)物試驗(yàn)，篩選出麥芽糖含量高的突變子。對水解淀粉產(chǎn)物中麥芽糖含量高的位點(diǎn)再進(jìn)行多位點(diǎn)的組合突變，再進(jìn)一步篩選得到水解淀粉麥芽糖含量為72%的突變酶。突變酶的氨基酸序列中193位組氨酸(H)被替換成谷氨酰胺(Q)，273位點(diǎn)的天冬氨酸(D)被替換成谷氨酸(E)，突變酶的DNA序列為SEQ ID N0.1，氨基酸序列為SEQ IDN0.2，然后再對該突變酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的詳細(xì)分析。
[0022]3.突變酶和原始酶水解淀粉最適的反應(yīng)溫度分析
[0023]取50 μ L的酶液與450 μ L pH為7.0的1%可溶性淀粉溶液混合，分別在30°C、
35V、40°C、45 V、50°C、55 V、60 V、65°C、70 V下反應(yīng)10min后測定淀粉酶活力，結(jié)果表明酶的最適溫度為60°C，在50°C到65°C之間該酶有80%以上的活性，65°C以后酶活性急劇下降，結(jié)果如圖1所示，表明突變酶和原始酶沒有明顯的差異。
[0024]4.突變酶和原始酶水解淀粉最適的反應(yīng)pH分析
[0025]分別用ρΗ4.5、ρΗ5.0、ρΗ5.5、ρΗ6.0、ρΗ6.5、ρΗ7.0、ρΗ7.5、ρΗ8.0、ρΗ8.5、ρΗ9.0 的
緩沖液配制I %的可溶性淀粉溶液，然后分別450 μ L加入50 μ L的酶液，在65°C的條件下反應(yīng)10min后測定淀粉酶活力，結(jié)果表明酶的最適反應(yīng)pH為pH6.5，在pH5.5到pH8.0之間該酶有80%以上的活性，pH8以后酶活性急劇下降，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明表明突變酶和原始酶沒有明顯的差異。
[0026]5.突變酶水解淀粉產(chǎn)物成分的比較分析
[0027]以市場售賣的商品真菌α -淀粉酶和原始酶為對照，比較分析突變酶水解淀粉產(chǎn)物的組成
[0028]在ImL含有2w/v%可溶性淀粉底物的pH7.0磷酸鈉緩沖液中加入相同蛋白含量的酶，50°C水浴反應(yīng)，反應(yīng)不同時(shí)間取樣，把所取的樣在沸水中煮沸10分鐘終止其反應(yīng)，12000rpm/min離心30分鐘，取上清稀釋10倍后用HPLC檢測野生型及突變型淀粉酶反應(yīng)產(chǎn)物，其水解淀粉的產(chǎn)物百分比見表1，結(jié)果表明突變酶水解淀粉得到的麥芽糖糖漿中麥芽糖含量比野生酶提高了 12%，也高于目前常用的商品真菌α-淀粉酶。
[0029]表1.突變酶和原始酶及真菌α-淀粉酶水解淀粉不同時(shí)間的產(chǎn)物組成
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種綠色糖單孢菌麥芽糖α-淀粉酶突變體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因所編碼的α-淀粉酶蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，其中193位組氨酸被替換成谷氨酰胺，273位點(diǎn)的天冬氨酸被替換成谷氨酸。
3.權(quán)利要求2所述的基因所編碼的α-淀粉酶蛋白質(zhì)在水解淀粉中的應(yīng)用，其特征在于，單獨(dú)水 解淀粉得到的產(chǎn)物為麥芽糖和麥芽三糖以及少量葡萄糖組成的糖漿，其中麥芽糖含量達(dá)到75%。
【文檔編號】C12P19/12GK103695387SQ201310703005
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】韋宇拓, 林芳, 汪小波, 杜麗琴, 黃日波 申請人:廣西大學(xué)