里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法及其菌株應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，利用一株保藏編號(hào)為CCTCC?No：M2013540的里氏木霉(Trichoderma?reesei)菌株發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。所述菌株產(chǎn)纖維素酶的最適pH3.0-6.0，最適溫度為23～35℃。所述菌株的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)104小時(shí)，發(fā)酵液纖維素酶的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
【專利說明】里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法及其菌株應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法及其菌株應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中。細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來自于真菌，比較典型的有木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)。纖維素酶在食品行業(yè)和環(huán)境行業(yè)均有廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，并對酒質(zhì)有所提升。
[0003]纖維素酶種類繁多，來源很廣。不同來源的纖維素酶其結(jié)構(gòu)和功能相差很大。由于真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，故在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中應(yīng)用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。
[0004]纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為內(nèi)切葡聚糖酶(1，4-0-D-glucanglucanohydrolase 或 endo-l, 4_0-D-glucanase, EC3.2.1.4),來自真菌的簡稱EG,來自細(xì)菌的簡稱Cen、外切葡聚糖酶(1，4-0-D-glucan cel1biIhydrolase或exo-1, 4_ P-D-glucannase, EC.3.2.1.91),來自真菌的簡稱CBH,來自細(xì)菌的簡稱Cex)和^ -葡聚糖苷酶(P -1, 4-glucosidase, EC.3.2.1.21)簡稱BG。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。3 -葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶產(chǎn)量高、活性大，在畜牧業(yè)和飼料工作中主要應(yīng)用真菌來源的纖維素酶。
[0005]纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES復(fù)合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。
[0006]1950年，Reese等提出了 Cl-Cx假說，該假說認(rèn)為必須以不同的酶協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協(xié)同作用一般認(rèn)為是內(nèi)切葡聚糖酶(Cl酶)首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成Cx所需的新的游離末端，然后由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最后由3 -葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個(gè)葡萄糖。不過，纖維素酶的協(xié)同作用順序不是絕對的，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，Cl-Cx和P -葡聚糖苷酶必須同時(shí)存在才能水解天然纖維素。若先用Cl酶作用結(jié)晶纖維素，然后除掉Cl酶，再加入Cx酶，如此順序作用卻不能將結(jié)晶纖維素水解。
[0007]菌種選育是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，國內(nèi)外許多專家進(jìn)行了大量研究，為了生產(chǎn)高質(zhì)量的纖維素酶產(chǎn)品，王家林等(1996)在吸收國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先后引進(jìn)了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基礎(chǔ)上，采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學(xué)的誘變方法，獲得了高產(chǎn)菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養(yǎng)活力經(jīng)輕工部食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心南京站檢測表明，濾紙活力為3670u/g，Cl-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達(dá)到國際先進(jìn)水平。此菌種在工廠化生產(chǎn)中性能穩(wěn)定。張苓花等(1998)采用康氏木霉W-925，J-931，經(jīng)過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線(15W、30cm、2min)復(fù)合誘變后，得到了產(chǎn)酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達(dá)到2975，濾紙?zhí)敲富钚詾?31，比出發(fā)菌W-925分別提高了 100%和81%?；げ匡暳咸砑觿┘夹g(shù)服務(wù)中心王成書等(1997)采用該中心的里氏木霉A3先進(jìn)行紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，30°C培養(yǎng)5-8天，15°C放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進(jìn)行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到了產(chǎn)纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。
[0008]纖維素酶的生產(chǎn)工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，其工藝如下:
[0009]1、影響產(chǎn)酶量和活力的因素:影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。張中良等(1997)采用均勻設(shè)計(jì)C112 (1210)，以綠色木霉(T.ViriclePers.expr)為菌種，研究了影響產(chǎn)纖維素酶的五大因素對產(chǎn)酶量和活力的作用，認(rèn)為基質(zhì)粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31°C條件下培養(yǎng)45h可獲得最大產(chǎn)酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g *h。王成華等(1997)也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明該菌種以7:3的秸桿粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養(yǎng)基，28-320C為適宜培養(yǎng)溫度，30°C為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達(dá)發(fā)酵高峰。張苓花等(1998)研究了以康氏木霉W-925為出發(fā)菌，經(jīng)誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產(chǎn)菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，以1:2的麥麩和稻草粉為培養(yǎng)基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始PH4-5，溫度在28-35°C，發(fā)酵時(shí)間72h為最佳發(fā)酵條件。
[0010]專利申請?zhí)枮?01010040047， 申請人:浙江大學(xué)，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟:將里氏木霉(TriCh。derma reesei)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后開始流加培養(yǎng)，流加培養(yǎng)過程中，當(dāng)發(fā)酵液1`，H值高于4.8時(shí)，流加培養(yǎng)基，當(dāng)發(fā)酵液pH值低于4.5時(shí)，停止流加培養(yǎng)基，總發(fā)酵時(shí)間達(dá)到192-240小時(shí)，停止發(fā)酵。本發(fā)明方法將不溶性碳源和可溶性碳源有機(jī)結(jié)合，協(xié)同誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)。通過流加培養(yǎng)使菌種的生長與目的代謝產(chǎn)物的形成過程達(dá)到協(xié)調(diào)平衡，解決了單純以纖維素或可溶性糖為誘導(dǎo)物生產(chǎn)纖維素酶的工藝中存在的問題，有效提高了纖維素酶的發(fā)酵水平，而且獲得的纖維素酶對纖維素底物的降解性能較強(qiáng)。
[0011]申請?zhí)?013102687288 —種低溫中性纖維素酶的制備方法，所述低溫中性纖維素酶以里氏木霉為菌株制備，該制備方法包括:活化菌種，紫外誘變，然后在低溫下培養(yǎng)、純化，并將純化菌株于10 — 15°C下發(fā)酵制備種子液,將種子液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，10 —15°C下培養(yǎng)96 — 144小時(shí)，便獲得低溫中性纖維素酶；本發(fā)明還提供了一種所述低溫中性纖維素酶的復(fù)配方法。本發(fā)明的有益效果為:操作簡單，發(fā)酵周期短，可降低酶的應(yīng)用溫度，從而降低工業(yè)應(yīng)用的耗能，使其更環(huán)保，具有廣闊的應(yīng)用前景；此外，本發(fā)明還提供了一種該纖維素酶的復(fù)配方法，其可廣泛用于造紙纖維的改性，降低造紙工業(yè)纖維改性的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種由里氏木霉菌株發(fā)酵生產(chǎn)高活力纖維素酶的方法。
[0013]所述生產(chǎn)菌株為里氏木霉(Trichodema reesei) 601-17，該菌株于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013540，分類命名為里氏木霉601-17Trichodema reesei601_17,保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072。
[0014]本發(fā)明提供的菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)CCTCC NO:M2013540可應(yīng)用于酸性纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0015]里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述里氏木霉為保藏編號(hào)CCTCCNO:M2013540的菌株，具體方法如下:CCTCC NO:M2013540純化菌株按5 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制備種子液，培養(yǎng)時(shí)間為72-96小時(shí)；種子液按發(fā)酵液體積5-10 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20-350C培養(yǎng)96-144小時(shí)，即里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶結(jié)束；將發(fā)酵液在4000-6000rpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進(jìn)行超濃縮過濾，得到濃縮酶液。
[0016]所述菌株產(chǎn)纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0017]所述菌株的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)104小時(shí)，發(fā)酵液纖維素酶的外切P -葡聚糖酶、內(nèi)切P -葡聚糖酶、P -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和 792U/mL。
[0018]所述菌株生理生化特征:
[0019]該菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長，形成的菌落特征為菌落呈棉絮狀，菌落呈淡綠色，菌落扁平，高0.1-0.75mm,菌落邊緣白色，整齊；生長速度快，48h菌落直徑達(dá)
1.0-8.5mm, 72h達(dá)30-50mm ;菌絲白色，有隔膜，菌絲壁光滑，直徑在2_5iim。分生孢子梗從菌絲的短側(cè)枝發(fā)生，側(cè)枝上對生。分生孢子梗呈瓶狀，直立，無色，孢子呈球形，綠色，直徑
20-100伽。
[0020]該菌株可在麥麩上生長，主要代謝產(chǎn)物為纖維素酶(內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶)。根據(jù)((An Introduction industrial mycology)) (George Smithl954)、《真菌鑒定手冊》(魏景超1982)、《常見與常用真菌》(中科院微生物研究所1973)，鑒定該菌株為:里氏木霉。
[0021]利用里氏木霉菌株，通過紫外誘變、培養(yǎng)、發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法如下。
[0022]里氏木霉菌株接種到斜面活化培養(yǎng)基上,活化菌種；培養(yǎng)活化后的菌種,挑取單菌落制備孢子懸浮液，并用紫外線照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；
[0023]誘變選育后的孢子菌落涂布于初篩培養(yǎng)基中，在20_35°C下培養(yǎng)3-5天，挑選初篩菌株并純化該菌株；純化菌株按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制備種子液，培養(yǎng)時(shí)間為72-96小時(shí)；種子液按發(fā)酵液體積5-10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20-35°C培養(yǎng)96-144小時(shí)，即里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶結(jié)束；將發(fā)酵液在4000-6000rpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進(jìn)行超濃縮過濾，得到濃縮酶液。
[0024]本發(fā)明的有益效果為:得到了一株里氏木霉，可應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)高活力酸性纖維素酶，其制備方法簡單，發(fā)酵周期短，可大大降低工業(yè)應(yīng)用的耗能，使其更環(huán)保，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】:[0025]菌種初篩:采自津市市保河堤食用菌培植基地中的土樣篩選分離出里氏木霉菌株HYX01。里氏木霉菌株接種到斜面活化培養(yǎng)基上，活化菌種；培養(yǎng)活化后的菌種，挑取單菌落制備孢子懸浮液，并用紫外照射孢子懸浮液，誘變得到孢子菌落；適當(dāng)稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為103個(gè)/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。
[0026]復(fù)篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，接種量10%( v/v)，30°C、100r/min培養(yǎng)96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復(fù)篩培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。 [0027]復(fù)篩選出菌株為里氏木霉(Trichoderma reesei) 601-17,保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013540。
[0028]培養(yǎng)特征:該菌株產(chǎn)纖維素酶的最適pH3.0-6.0 ;最適溫度為23~35°C。
[0029]遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn):將該菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項(xiàng)性能指標(biāo)都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0030]放大試驗(yàn)
[0031]種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株接入500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100 毫升，300C、150rpm 搖床培養(yǎng) 72_96h。
[0032]種子罐培養(yǎng):將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為5.0±0.2，培養(yǎng)溫度27±0.1°C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(v/v)1:0.8-1.2,培養(yǎng)時(shí)間104h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法為:纖維素粉10%、硫酸銨0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其余為水，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0033]發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測，經(jīng)測定，外切P -葡聚糖酶、內(nèi)切P -葡聚糖酶、^ -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到680U/mL、1389U/mL、486U/mL和792U/mL。
[0034]本發(fā)明中使用的里氏木霉(Trichoderma reesei)是公知的微生物,誘變后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，在10-20%的山梨醇溶液中，于零下80°C下可長期保存。
[0035]斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯20%、葡萄糖1%、瓊脂2%，其余為水，pH自然，溫度28°C。
[0036]例I
[0037]將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為4.0±0.2，培養(yǎng)溫度25±0.1°C，攪拌速度300rpm,通風(fēng)量(v/v)1:1,培養(yǎng)時(shí)間100h，溶解氧26%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法為:纖維素粉10%、硫酸銨0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其余為水，pH值5-6，121°C滅菌20min。
[0038]發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測，經(jīng)測定，外切P -葡聚糖酶、內(nèi)切P -葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到676U/mL、1392U/mL、483U/mL和802U/mL。
【權(quán)利要求】
1.里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述里氏木霉為保藏編號(hào)CCTCCNO:M2013540的菌株，具體方法如下:CCTCC NO:M2013540純化菌株按5 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制備種子液，培養(yǎng)時(shí)間為72-96小時(shí)；種子液按發(fā)酵液體積5-10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20-35°C培養(yǎng)96-144小時(shí)，即里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶結(jié)束；將發(fā)酵液在4000-6000rpm離心，收集所得液體為粗酶液；得到的粗酶液進(jìn)行超濃縮過濾，得到濃縮酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法為:纖維素粉10%、硫酸銨0.5%、硫酸鎂0.025%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、其余為水，pH 值 5-6，121°C 滅菌 20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，所述粗酶液中纖維素酶的外切3-葡聚糖酶、內(nèi)切3 -葡聚糖酶、3 -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到 680U/mL、1389U/mL、486U/mL 和 792U/mL。
4.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的方法，所述菌株產(chǎn)纖維素酶的 pH3.0-6.0 ;溫度為 23 ~35°C。
5.要求1-4所述菌株里氏木霉(Trichodermareesei) CCTCC NO:M2013540在纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK103740680SQ201310716987
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李洪兵, 李貴駿, 胡永明, 易繼云, 劉文明 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司