利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭iii的方法
【專利摘要】一種利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，含以下步驟：（1）取海南粗榧外植體，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，獲得非胚性愈傷組織；（2）將非胚性愈傷組織在愈傷增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得生長迅速疏松的細胞團；（3）將細胞團接種至細胞懸浮啟動培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得液體培養(yǎng)的非胚性懸浮細胞系；（4）將非胚性懸浮細胞系靜置沉淀后，取沉淀接種至液體增殖培養(yǎng)基中，獲得懸浮細胞；（5）將懸浮細胞離心沉淀、棄上清，沉淀經(jīng)后續(xù)處理，用液相色譜法分離提純獲得紫杉醇及其前體物巴卡亭III，該方法具有生產(chǎn)效率高、不占用林地、不破壞自然資源、產(chǎn)量穩(wěn)定、有效成分含量高、提取工藝簡單的特點。
【專利說明】利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭111的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海南粗植(Cephalotaxusmannii Hook.f.)是三尖杉科(Cephalotaxaceae)三尖杉屬(Cephalotaxus)常綠喬木。主產(chǎn)海南島，在廣東西南部、廣西東南部、云南東南部及西部、西藏東南部也有分布。散生于海拔700-1200米山地雨林或季雨林區(qū)溝谷、溪澗或山坡。海南粗榧是三尖杉屬分布最南的種，同時又是慢生樹種，由于生態(tài)分布狹窄加之人為破壞，其分布區(qū)面積在不斷縮小，已于1987年被列入國家二級重點保護瀕危植物。
[0003]海南粗榧次生代謝產(chǎn)物中富含多種生物堿，已經(jīng)確定的有:脫氧三尖杉酯堿、異三尖杉酯喊、二尖杉酯喊、聞二尖杉酯喊、二尖杉喊、橋氧粗植喊、去甲基二尖杉酯喊、羥基二尖杉堿和3-表西哈滅里辛堿。其中，具有抗癌活性的有4種:三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿和異三尖杉酯堿。我們首次發(fā)現(xiàn)在海南粗榧中還具有抗癌物質(zhì)紫杉醇。
[0004]紫杉醇(paclitaxel, taxol),又名泰素、紫素、特素?；瘜W(xué)名稱為5β,20-環(huán)氧-1，2α，4，7 0，10 0，13 0-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯_2_苯甲酸酯-13 [(2，R，3，S)-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯，分子量853.92，分子式C47H51NO1415于1963年在太平洋紅豆杉中發(fā)現(xiàn)。紫杉醇是細胞有絲分裂抑制劑，被廣泛用于癌癥治療。主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤等疾病也有一定的療效。其基本作用原理是特異性的結(jié)合到細胞微管骨架蛋白上，干擾細胞微管骨架的解聚和重組，從而影響微管的基本生理功能，阻斷了細胞分裂，抑制癌細胞生長。
`[0005]紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，一種四環(huán)二萜化合物，有11個立體中心和一個17碳的四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，有眾多的研究機構(gòu)對其進行了人工化學(xué)合成方面的研究。目前已公開的全合成途徑有兩種:一種是由A環(huán)再形成ABC環(huán)或由C環(huán)再形成ABC環(huán)，此種為線形戰(zhàn)略，Holton和Wengder采用此方法完成了全合成。另一種是由A環(huán)和C環(huán)會聚形成ABC環(huán),此種為會聚戰(zhàn)略。Nicolaou、Danishefsky和Kuwajima則采用會聚戰(zhàn)略完成了全合成。而Mukaiyama采用兩種方法相結(jié)合實現(xiàn)了全合成。雖然紫杉醇可以通過人工化學(xué)方法合成，但由于其合成過程復(fù)雜，步驟繁瑣，產(chǎn)品純度低、技術(shù)難度大，目前通過人工化學(xué)合成的紫杉醇或三尖杉生物堿還處于探索階段，還無法真正實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]紫杉醇的生物合成是非依賴甲羥戊酸途徑完成的，其生物合成路徑基本清楚，紫杉醇生物合成包括母核與側(cè)鏈兩部分，其生物合成是由櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPs)催化形成GGPP前體物質(zhì)經(jīng)紫杉二烯合酶(tasy)催化作用下形成紫杉二烯，紫杉二烯在紫杉二烯-5 α -羥化酶(h-5 α )作用下生成紫杉二烯_5 α -醇。它經(jīng)紫杉二烯-5 α -O-乙?；D(zhuǎn)移酶(tat)作用下形成紫杉二烯-5 α -乙酰脂。然后經(jīng)過一系列交替進行的羥基化和?；磻?yīng)生成了 2 α -去苯甲酰紫杉烷，再經(jīng)過紫杉烷-2 α -苯甲酰轉(zhuǎn)移酶(tbt)和10-去乙酰巴卡亭II1-?ο β-2乙酰轉(zhuǎn)移酶(dbat)兩步反應(yīng)作用下生成母核巴卡亭III (baccatin III)。而β -苯丙胺酸連接到巴卡亭III的C13位上，經(jīng)過3_氨基_3_苯基丙酰轉(zhuǎn)移酶(bapt)和3-N-去苯甲酰-2-脫氧紫杉醇苯甲酰轉(zhuǎn)移酶(dbtnbt)催化作用下發(fā)生酯化反應(yīng)生成了紫杉醇(taxol)。該生物合成途徑包含約20步酶促反應(yīng)中，已經(jīng)有一半以上的基因被克隆與表達。由于參與代謝的基因仍有許多不清楚，目前，仍然不能通過基因工程的方法進行生產(chǎn)。
[0007]巴卡亭III (Baccatin III，C31H38O11)是紫杉醇合成過程中的重要前體物，具有紫杉烷二萜的環(huán)骨架和官能團。其在紅豆杉植物中普遍存在，由于枝葉中巴卡亭III含量較高，人們可以通過收獲紅豆杉植物的枝葉提取獲得巴卡亭III，然后通過化學(xué)合成的方法再合成抗癌藥物紫杉醇。此外，巴卡亭III自身也被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答的功能，在器官移植等領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價值。
[0008]根據(jù)細胞的全能性，單個細胞就具備生產(chǎn)所有次生代謝產(chǎn)物的基因，只要培養(yǎng)條件合適，就可以像植株一樣，可誘導(dǎo)生產(chǎn)相關(guān)次生代謝產(chǎn)物。事實上，已有許多報道表明，可利用培養(yǎng)植物細胞的方法生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，如長春花生產(chǎn)吲哚堿、丹參生產(chǎn)丹參酮、青蒿生產(chǎn)青蒿素、紫草生產(chǎn)萘醒、三七生產(chǎn)皂昔等，有些植物細胞懸浮培養(yǎng)已經(jīng)能夠進行小規(guī)模的生產(chǎn)。
[0009]紫杉醇制劑長期居世界抗癌藥物首位。已有的主要生產(chǎn)方式為通過收獲紅豆杉枝葉，提取紫杉醇前體物質(zhì)，然后人工化學(xué)合成紫杉醇。也有報道利用紅豆杉植物細胞培養(yǎng)的方法獲得紫杉醇。此外，在有些真菌中也檢測到了紫杉醇的存在。但目前還未有利用細胞工程的方法從海南粗榧中懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法，該方法具有生產(chǎn)效率高、不占用林地、不破壞自然資源、產(chǎn)量穩(wěn)定、有效成分含量高、提取工藝簡單的特點。
[0011]本發(fā)明上述所要解決的技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法，含以下步驟:
[0012](I)取海南粗榧外植體，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，獲得非胚性愈傷組織；
[0013](2)將步驟(1)中獲得的非胚性愈傷組織在愈傷增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得生長迅速疏松的細胞團；
[0014](3)將步驟(2)獲得的細胞團接種至細胞懸浮啟動培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得液體培養(yǎng)的非胚性懸浮細胞系；
[0015](4)將步驟(3)獲得的非胚性懸浮細胞系靜置沉淀后，取沉淀接種至液體增殖培養(yǎng)基中，獲得生長周期穩(wěn)定、生長迅速的懸浮細胞；
[0016](5)將步驟(4)培養(yǎng)的懸浮細胞離心沉淀、棄上清，沉淀經(jīng)后續(xù)工序，用液相色譜法獲取紫杉醇及其前體物巴卡亭III。
[0017]本發(fā)明步驟(1)中所述的海南粗榧外植體培養(yǎng)前經(jīng)過切段、消毒等工序處理。
[0018]本發(fā)明所述的海南粗榧外植體優(yōu)選為當年生新葉。
[0019]本發(fā)明所述新葉長度優(yōu)選為I~2cm，整葉消毒后，橫切為0.8~1.0cm小段，置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0020]本發(fā)明步驟(1)中所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:(NH4)2S04132~136mg/L+H3B032.8 ~3.2mg/L+CaCl2l 12 ~114mg/L+CoCl2.6Η200.023 ~0.027mg/L+CuS04.5Η200.022 ~0.028mg/L+Na2EDTA.2Η2036.8 ~37.6mg/L+MgS04121.8 ~122.4mg/L+MnS04.Η209 ~I lmg/L+Na2Mo04.2Η200.24 ~0.26 mg/L+KI0.65 ~0.85mg/L+KN032400 ~2600mg/L+NaH2P04140 ~160mg/L+ZnS04.7Η201.8 ~2.2mg/L+ 肌醇 90 ~110mg/L+ 煙酸0.9 ~1.lmg/L+ 鹽酸批P多醇 0.9 ~1.lmg/L+ 鹽酸硫胺 9 ~llmg/L+6-BA0.09 ~0.1lmg/L+NAA0.09 ~0.llmg/L+2, 4-D0.09 ~0.1 lmg/L+ 蔗糖 20_30g/L+l.0% 瓊脂，pH 為 5.6 ~
5.9，培養(yǎng)溫度為25~28°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為21~28天。
[0021]本發(fā)明步驟(1)中采用的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法可保證外植體保持活力并且迅速分化獲得松散的細胞團，該細胞團圍繞切口生長，當該細胞團直徑達到0.5~Icm后，轉(zhuǎn)接至愈傷增殖培養(yǎng)基。
[0022]本發(fā)明步驟(2 )中所述的愈傷增殖培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:NH4N03380~420mg/L+H3BO36.1 ~6.3mg/L+CaCl271 ~74mg/L+Ca (NO3) 2+370 ~390mg/L+CuS04.5H200.23 ~0.27mg/L+Na2EDTA.2H2034 ~40mg/L+FeS04.7H2025 ~30.5mg/L+MgS04170 ~190mg/L+MnS04.Η2020 ~24mg/L+Na2Mo04.2Η200.24 ~0.26mg/L+KH2P04160 ~180mg/L+K2S04980 ~1000mg/L+ZnS04.7Η208.3 ~8.9mg/L+ 甘氨酸 1.8 ~2.2mg/L+ 肌醇 95 ~105mg/L+ 煙酸
0.45 ~0.55mg/L+ 鹽酸批P多醇 0.46 ~0.54mg/L+ 鹽酸硫胺 0.95 ~1.05mg/L+NAAl.8 ~2.2mg/L+6-BA0.09 ~0.llmg/L+5-lOg/L 蔗糖 +5-lOg/L 果糖 +1.0% 瓊脂，pH 為 5.6 ~5.9，培養(yǎng)溫度為25~28°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為25~31天；胚性愈傷組織接種直徑約為0.1~
0.3cm，經(jīng)過一個培養(yǎng)周期，非胚性愈傷組織體積增加5~8倍。
[0023]本發(fā)明愈傷增殖培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法可以滿足海南粗榧愈傷組織快速增殖的需求，細胞呈圓形，細胞分裂迅速、周期一致。
[0024]本發(fā)明步驟(3)中所述的細胞懸浮啟動培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:MS培養(yǎng)基+蔗糖18~22g/L+6-BA0.09 ~0.llmg/L+NAA2_2.2mg/L, pH 為 5.65 ~5.85 ;培養(yǎng)溫度為 24 ~27°C，培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10天，接種量為細胞懸浮啟動培養(yǎng)基總體積的1/10~1/15，120~150rpm回旋式震蕩培養(yǎng)。
[0025]本發(fā)明經(jīng)過細胞懸浮啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞分散充分，在細胞分裂間期，形成了以圓形細胞為主的非胚性細胞懸系。
[0026]本發(fā)明步驟(4)中所述的液體增殖培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:MS培養(yǎng)基+蔗糖25~35g/L+6-BA0.15mg/L+NAA2.0-2.2mg/L, pH 為 5.65 ~5.85 ;培養(yǎng)溫度為 24 ~27°C，培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10天，繼代時接種量為增殖培養(yǎng)基總體積的1/6~1/10 ;繼代周期為7~10天，繼代時接種量為增殖培養(yǎng)基總體積的1/10~1/15。
[0027]本發(fā)明通過液體維持培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，可迅速獲得細胞類型一致、生長迅速、增殖系數(shù)高的細胞，可為紫杉醇的提取提供充足的原料。
[0028]本發(fā)明步驟(5)中離心收集時離心速度為1000~1500rpm,時間為3~5min。
[0029]作為本發(fā)明的一種改進:本發(fā)明通過將步驟(4)培養(yǎng)的懸浮細胞經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)后加入茉莉酸甲酯進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以提高紫杉醇及其前體物巴卡亭III的含量。
[0030]經(jīng)過本發(fā)明 申請人:試驗驗證，在經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)后的懸浮細胞中加入茉莉酸甲酯進行誘導(dǎo)培養(yǎng)對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以提高產(chǎn)物中紫杉醇及其前體物巴卡亭III的含量。
[0031]本發(fā)明步驟(5)中所述的后續(xù)處理包括低溫研磨、超聲粉碎、離心、濃縮和超微過濾。
[0032]其中低溫研磨為:將收集的細胞加液氮研磨，用甲醇溶解，加甲醇的量為樣品體積的4-5倍。
[0033]超聲粉碎為:將溶解液用超聲波處理30_45min，取出后室溫冷卻，再在4°C靜置Ih以上。
[0034]離心為:將樣品取出后混勻，11000~13000r/min離心10~15min。
[0035]超微過濾和濃縮為:取離心后樣品采用微孔過濾器(Φ0.22 μ M)過濾，過濾液用氮吹儀濃縮5倍后用高效液相色譜分離提純。
[0036]紫杉醇和巴卡亭III含量測定色譜條件:紫外檢測波長227nm，柱溫28°C，流速ImL/min，進樣量為20 μ L，運行時間為38min，以峰面積外標法定量，進行梯度洗脫，具體洗脫程序見下表1:
[0037]表1流動相的設(shè)置及洗脫程序
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是含以下步驟: (1)取海南粗榧外植體，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，獲得非胚性愈傷組織； (2)將步驟(1)中獲得的非胚性愈傷組織在愈傷增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，獲得生長迅速疏松的細胞團； (3 )將步驟(2 )獲得的細胞團接種至細胞懸浮啟動培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得液體培養(yǎng)的非胚性懸浮細胞系； (4)將步驟(3)獲得的非胚性懸浮細胞系靜置沉淀后，取沉淀接種至液體增殖培養(yǎng)基中，獲得生長周期穩(wěn)定、生長迅速的懸浮細胞； (5 )將步驟(4 )培養(yǎng)的懸浮細胞離心沉淀、棄上清，沉淀經(jīng)后續(xù)處理，用液相色譜法分離提純獲得紫杉醇及其前體物巴卡亭III。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(1)中所述的海南粗榧外植體培養(yǎng)前經(jīng)切段和消毒工序處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(1)中所述的海南粗榧外植體為當年生新葉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(1)中所述的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:(NH4)2SO4132 ~136mg/L+H3B032.8 ~3.2mg/L+CaCl2112 ~114mg/L+CoCl2.6Η200.023 ~0.027mg/L+CuS04.5Η200.022 ~0.028mg/L+Na2EDTA.2Η2036.8 ~37.6mg/L+MgS04121.8 ~122.4mg/L+MnS04.H209 ~I l`mg/L+Na2Mo04.2H200.24 ~0.26mg/L+K10.65 ~0.85mg/L+KN032400 ~2600mg/L+NaH2P04140 ~160mg/L+ZnS04.7H201.8 ~2.2mg/L+ 肌醇90~110mg/L+煙酸0.9~1.lmg/L+鹽酸批口多酉享0.9~1.lmg/L+鹽酸硫胺9~Ilmg/L+6-BA0.09 ~0.llmg/L+NAA0.09 ~0.llmg/L+2, 4-D0.09 ~0.1lmg/L+ 蔗糖 20_30g/L+1.0%瓊脂，pH為5.6~5.9，培養(yǎng)溫度為25~28°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為21~28天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(2)中所述的愈傷增殖培養(yǎng)基的配方為:NH4N03380 ~420mg/L+H3B036.1 ~6.3mg/L+CaCl271 ~74mg/L+Ca (NO3) 2370 ~390mg/L+CuS04.5Η200.23 ~0.27mg/L+Na2EDTA.2H2034 ~40mg/L+FeS04.7H2025 ~30.5mg/L+MgS04170 ~190mg/L+MnS04.Η2020 ~24mg/L+Na2Mo04.2Η200.24 ~0.26mg/L+KH2P04160 ~180mg/L+K2S04980 ~1000mg/L+ZnS04.7Η208.3 ~8.9mg/L+ 甘氨酸 1.8 ~2.2mg/L+ 肌醇95~105mg/L+煙酸0.45~0.55mg/L+鹽酸吡哆醇0.46~0.54mg/L+鹽酸硫胺0.95~1.05mg/L+NAAl.8 ~2.2mg/L+6_BA0.09 ~0.llmg/L+5-lOg/L 蔗糖 +5-lOg/L 果糖 +1.0% 瓊月旨，pH為5.6~5.9，培養(yǎng)溫度為25~28°C，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為25~31天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(3)中所述的細胞懸浮啟動培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基 + 蔗糖 18 ~22g/L+6-BA0.09 ~0.llmg/L+NAA2_2.2mg/L, pH 為 5.65 ~5.85 ;培養(yǎng)溫度為24~27°C，培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10天，接種量為細胞懸浮啟動培養(yǎng)基總體積的1/10~1/15，120~150rpm回旋式震蕩培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(4)中所述的液體增殖培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+蔗糖 25 ~35g/L+6-BA0.15mg/L+NAA2.0-2.2mg/L, pH 為 5.65 ~5.85 ;培養(yǎng)溫度為 24 ~27°C，培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10天，接種量為增殖培養(yǎng)基總體積的1/6~1/10，繼代周期為7~10天，繼代時接種量為增殖培養(yǎng)基總體積的1/10~1/15。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(5)中所述的后續(xù)處理包括低溫研磨、超聲粉碎、離心、濃縮和超微過濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:步驟(5)中離心沉淀時離心速度為1000~1500rpm，時間為3~5min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的利用海南粗榧非胚性細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法，其特征是:將步驟(4)培養(yǎng)的懸浮細胞經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)后加入茉莉酸甲酯進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以提高紫杉醇及其前體物巴卡亭III的含量。
【文檔編號】C12P17/02GK103725725SQ201310749388
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】喬飛, 江雪飛, 王榮香, 王琴飛, 叢漢卿, 錢丹, 趙小青, 尹俊梅 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所