一種高生產(chǎn)率的乳酸菌菌株的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高生產(chǎn)率的乳酸菌菌株，其特征在于，該菌株在由160-180g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物和15g/L蛋白胨組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。首先培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；然后，培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。本發(fā)明解決了目前工業(yè)乳酸菌株篩選過(guò)程中費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、篩選效率不高的缺點(diǎn)，為乳酸發(fā)酵提供了大量的供選擇的菌種資源，為進(jìn)一步優(yōu)化改良提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率、降低成本奠定了基礎(chǔ)，該菌株具有出色的生產(chǎn)乳酸的能力和高的生長(zhǎng)率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種高生產(chǎn)率的乳酸菌菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及具有出色的生產(chǎn)乳酸的能力和高的生長(zhǎng)率的乳酸菌菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著石油資源的不斷減少以及不可再生資源價(jià)格的節(jié)節(jié)攀升，開(kāi)發(fā)利用環(huán)境友好的生物基產(chǎn)品已成為轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方式、保障生態(tài)鏈良性循環(huán)、實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。乳酸是一種重要的、多用途生物基平臺(tái)化合物，它有兩種旋光異構(gòu)體，其中L一乳酸可用作酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，在食品、制藥、釀造、制革、紡織和農(nóng)業(yè)中具有廣泛用途。乳酸的兩個(gè)功能集團(tuán)可以進(jìn)行多種化學(xué)反應(yīng)，包括聚合、酯化、還原和取代反應(yīng)。利用這些反應(yīng)，乳酸可被用來(lái)生產(chǎn)多種在工業(yè)和消費(fèi)品領(lǐng)域中具有重要用途的產(chǎn)品，包括高聚物(如聚乳酸)、溶劑(如乳酸乙酯、乳酸丙酯、乳酸丁酯等)及含氧化學(xué)品(如丙二醇、環(huán)氧丙烷、丙烯酸等)，其中最重要、最大宗的工業(yè)應(yīng)用，是用于生產(chǎn)可降解聚合物一聚乳酸，聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性及優(yōu)良的機(jī)械性能和物理性能，因而被產(chǎn)業(yè)界認(rèn)為是新世紀(jì)最有發(fā)展前途的新型包裝材料，將有望逐步替代聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等材料。作為一種能夠由可再生碳水化合物轉(zhuǎn)化而來(lái)的重要平臺(tái)化合物，近年來(lái)乳酸受到了全世界研究人員和生產(chǎn)企業(yè)的極大關(guān)注。2005年全球乳酸產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到12萬(wàn)噸，其中20— 30%應(yīng)用在新的工業(yè)領(lǐng)域中。隨著乳酸新的、大宗的應(yīng)用不斷開(kāi)發(fā)，全球乳酸的市場(chǎng)需求將持續(xù)增長(zhǎng)。
[0003]根據(jù)預(yù)測(cè)，如果10-20年后全球范圍內(nèi)生物基塑料能夠替代石油基塑料消費(fèi)量的10-20%，聚乳酸的年需求量將達(dá)到1150-2300萬(wàn)噸。目前全球乳酸產(chǎn)量只有這一預(yù)測(cè)值的1%，其核心問(wèn)題是L一乳酸生產(chǎn)成本和市場(chǎng)價(jià)格仍然偏高。解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵之一是提高菌株的乳酸生產(chǎn)率，目前已知的大多數(shù)菌種的發(fā)酵生產(chǎn)率較低，導(dǎo)致發(fā)酵周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本偏高，從而導(dǎo)致聚乳酸市場(chǎng)開(kāi)拓受阻。在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上對(duì)已有菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單優(yōu)化或改良對(duì)進(jìn)一步提高乳酸生產(chǎn)率，降低·生產(chǎn)成本貢獻(xiàn)甚微，因此需要從天然生境中篩選高乳酸生產(chǎn)率的優(yōu)良菌株，并通過(guò)正向、反向和進(jìn)化代謝工程等技術(shù)手段進(jìn)一步提高并改進(jìn)菌株的乳酸生產(chǎn)效率、對(duì)環(huán)境的脅迫能力，從而使菌株能夠高效、大量生產(chǎn)L一乳酸，突破聚合級(jí)L一乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸，為以可再生生物質(zhì)為原料大規(guī)模、低成本地生產(chǎn)高純度L一乳酸奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
[0004]菌種是乳酸發(fā)酵的主體和基本要素，能夠產(chǎn)生乳酸的微生物有很多，但就工業(yè)意義上來(lái)說(shuō)，乳酸桿菌具有最大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。乳酸桿菌包括兩種發(fā)酵類(lèi)型，同型發(fā)酵和異型發(fā)酵。同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過(guò)程中只產(chǎn)生乳酸作為發(fā)酵產(chǎn)物，因此是理想的工業(yè)乳酸發(fā)酵菌株。目前在工業(yè)上獲得應(yīng)用的同型發(fā)酵菌株主要包括:鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)和德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)等。自然界中蘊(yùn)藏著大量有潛力的乳酸產(chǎn)生菌,從環(huán)境中篩選天然優(yōu)良菌株是提高乳酸發(fā)酵性能、降低乳酸發(fā)酵成本的第一步。美國(guó)阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Tsai等根據(jù)選擇合適碳源、乳酸發(fā)酵類(lèi)型、對(duì)產(chǎn)物耐受能力、產(chǎn)物立體專(zhuān)一性、菌體細(xì)胞分離的難易程度、高溫耐受等篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)2輪8套篩選，最終篩選獲得耐高溫、耐自身發(fā)酵產(chǎn)物的優(yōu)良菌種。CarlSOl]和Peters的專(zhuān)利公開(kāi)了耐乳酸同型發(fā)酵的篩選方案，他們從玉米浸潰漿水中分離了近百株同型乳酸發(fā)酵菌種，得到一株在葡萄糖和不同量玉米漿水的培養(yǎng)基中47°C發(fā)酵6h產(chǎn)乳酸接近100g/L的耐酸菌種。上述方法雖然能有效篩選到目的菌株，但是其不足是不能高通量篩選，存在極大的局限性

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種輔助篩選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。
[0006]1)培養(yǎng)待篩選樣品,挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株,獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；
[0007]2)培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌；
[0008]所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率是按照如下公式計(jì)算的:V=(OD1-ODtl) / At;
[0009]OD0為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)起始時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D_值；
[0010]OD1為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)終止時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D_值；
[0011]At為終止時(shí)間點(diǎn)至起始時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間段，
[0012]V為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率。
[0013]所述挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株的方法包括如下步驟:將所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株接種子裝有培養(yǎng)基的孔板中，再將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)直接讀取培養(yǎng)液的OD6c?值，按照所述公式計(jì)算得到所述菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率，篩選獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株。
[0014]所述培養(yǎng)中所用到的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
[0015]所述乳酸菌為同型發(fā)酵乳酸菌。
[0016]所述方法獲得候選菌后，再對(duì)候選菌的乳酸生產(chǎn)率進(jìn)行鑒定，如果所述候選菌的乳酸生產(chǎn)率大于等于3.9±0.lg/L.h，則所述候選菌為乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌同型發(fā)酵菌株在發(fā)酵過(guò)程中只產(chǎn)生乳酸，而且這一途徑是唯一的產(chǎn)能途徑，因此同型發(fā)酵菌株的產(chǎn)乳酸過(guò)程與菌株的生長(zhǎng)和繁殖是直接相關(guān)的，因此通過(guò)篩選生長(zhǎng)快速的同型發(fā)酵菌株可以獲得高乳酸生產(chǎn)率的菌株。本發(fā)明基于這一原理，建立了通過(guò)酶標(biāo)儀從天然環(huán)境中高通量篩選高生產(chǎn)率乳酸菌的方法。
[0017]本發(fā)明篩選方法將來(lái)自自然環(huán)境中的發(fā)酵樣品用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋后涂布在含溴甲酚綠的MRS平板上培養(yǎng)，獲得產(chǎn)酸圈較大的產(chǎn)酸菌；通過(guò)在96深孔板倒置的杜氏小管中觀察是否產(chǎn)氣，篩選不產(chǎn)氣的細(xì)菌即為同型發(fā)酵菌株；然后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)速率高的菌株即為乳酸生產(chǎn)率高的菌株。在本發(fā)明篩選方法的基礎(chǔ)上，可以通過(guò)生理生化試驗(yàn)鑒定菌株的種類(lèi)，建立高生產(chǎn)率乳酸菌株庫(kù)，為乳酸發(fā)酵的工業(yè)化提供更加充足的菌種資源；可以通過(guò)進(jìn)一步的耐高鹽、耐高糖等發(fā)酵性能的檢測(cè)，篩選出滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的潛在菌株；還可以對(duì)具有乳酸高生產(chǎn)率的菌株做進(jìn)一步的遺傳改造，獲得更優(yōu)良工業(yè)菌株。
[0018]本發(fā)明篩選方法實(shí)現(xiàn)了乳酸生產(chǎn)率高菌株的快速、高通量篩選，解決了目前工業(yè)乳酸菌株篩選過(guò)程中費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、篩選效率不高的缺點(diǎn)，為乳酸發(fā)酵提供了大量的供選擇的菌種資源，為進(jìn)一步優(yōu)化改良提高乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率、降低成本奠定了基礎(chǔ)【具體實(shí)施方式】
[0019]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0020]下述實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基的組成如下篩選培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基，其組成為:20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、2g/K2HP04、2g/L 檸檬酸銨、2g/L 醋酸鈉、0.58g/L MgSO4.7Η20、0.25g/L MnSO MgSO4.4H20、Iml / LTween-80，其余為水，pH 為 6.2。
[0021]發(fā)酵培養(yǎng)基組成:150g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母提取物、3g/L K2HPO4,3g / L KH2PO4,2g / L 醋酸鈉、0.58g / MgSO4.7Η20、0.25g / LMnSOMgSO4.4H20、Iml / L Tween—80。以 6mol / L NaOH 為中和劑，調(diào)節(jié) pH 為 5.5。
[0022]實(shí)施例1、乳酸菌的生長(zhǎng)速率與乳酸生產(chǎn)率的正相關(guān)性驗(yàn)證
[0023]一、對(duì)51株同型發(fā)酵乳酸菌株進(jìn)行檢測(cè)
[0024]1、菌生長(zhǎng)速率與乳酸生產(chǎn)率的測(cè)定:
[0025]將51株保存在一80°C冰箱中的同型發(fā)酵乳酸菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h,得到發(fā)酵培養(yǎng)液；然后將培養(yǎng)液各分成兩份:一份用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到光密度大約為0.05時(shí)，取200uL稀釋液加到經(jīng)75 %酒精浸泡滅菌的96孔板中，放入酶標(biāo)儀中37°C培養(yǎng)6h (所有的菌株都完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，期間每隔0.5h檢測(cè)一次0D_值，計(jì)算對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的生長(zhǎng)速率；另一份培養(yǎng)液用MRS液體培養(yǎng)基稀釋到光密度大約為0.05，然后將稀釋液加入到MRSl培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，檢測(cè)24小時(shí)內(nèi)的平均乳酸生產(chǎn)率。
[0026]MRSl培養(yǎng)基的組成為:以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其中的葡萄糖濃度變?yōu)?0g / L，同時(shí)含有4% CaCO:作為中和劑?！?br> [0027]定量檢測(cè)乳酸含量的方法是高效液相色譜法(HPLC)，所用色譜柱為HPX-87H，柱溫40°C，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.05mm01/LH:S0+,流速為0.5ml/L。在此色
譜條件下，L一乳酸標(biāo)準(zhǔn)晶的色譜圖，L一乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為14.974min。
[0028]其中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌的生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式如下:V=(OD1-ODtl) / At;
[0029]OD0為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)起始時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D_值；
[0030]OD1為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)檢測(cè)終止時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的0D_值；
[0031]At為終止時(shí)間點(diǎn)至起始時(shí)間點(diǎn)之間的時(shí)間段，
[0032]V為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率。
[0033]實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。
[0034]結(jié)果表明，51株同型發(fā)酵乳酸菌菌株的乳酸生產(chǎn)率和生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系(橫坐標(biāo)為各菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的生長(zhǎng)速率，縱坐標(biāo)為各菌株的乳酸生產(chǎn)率)。因此可以通過(guò)檢測(cè)乳酸菌株的生長(zhǎng)速率來(lái)篩選高生產(chǎn)率的乳酸菌。
[0035]二、檢測(cè)植物乳桿菌NCMB5105、鼠李糖乳桿菌CCUG36679和植物乳桿菌NCIMB8826鼠李糖乳桿菌CCUG36679購(gòu)買(mǎi)自瑞典大學(xué)微生物菌種保藏中心，植物乳桿菌NCMB5105購(gòu)自英國(guó)國(guó)家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌菌種保藏中心和植物乳桿菌NCMB8826購(gòu)自英國(guó)國(guó)家工業(yè)、食品和海洋細(xì)菌菌種保藏中心。
[0036]從已知的乳酸菌中選取2株生長(zhǎng)速率高的菌株植物乳桿菌NCIMB5105(Lactobacillus piantarum)> 鼠李糖乳桿菌 CCUG36679(Lactobacillusprhamnosus)，以及I株生長(zhǎng)速率較低的植物乳桿菌NCMB8826，將其分別接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，37°C厭氧培養(yǎng)24h后，得到發(fā)酵培養(yǎng)液，然后按照一中所述方法稀釋發(fā)酵培養(yǎng)液及檢測(cè)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率、24h內(nèi)的乳酸含量及平均乳酸生產(chǎn)率。
[0037]實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。
[0038]對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌株的生長(zhǎng)速率及乳酸的產(chǎn)量和乳酸生產(chǎn)率如表1所示，表明對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)菌株的生長(zhǎng)速率和菌株的24小時(shí)內(nèi)平均乳酸生產(chǎn)率具有直接正相關(guān)性。
[0039]表1、不同生長(zhǎng)速率菌株乳酸發(fā)酵結(jié)果
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種高生產(chǎn)率的乳酸菌菌株，其特征在于，該菌株在由160-180g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物和15g/L蛋白胨組成的的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高生產(chǎn)率的乳酸菌菌株，其特征在于，首先培養(yǎng)待篩選樣品，挑取產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣的菌株，獲得產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株；然后，培養(yǎng)所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株，獲得候選乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種生產(chǎn)率率的乳酸菌菌株，其特征在于:所述挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株的方法包括如下步驟:將所述產(chǎn)酸不產(chǎn)氣菌株接種子裝有培養(yǎng)基的孔板中，再將所述孔板置于酶標(biāo)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期的不同時(shí)間點(diǎn)直接讀取培養(yǎng)液的值，計(jì)算得到所述菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率，篩選獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)生長(zhǎng)速率高于0.2/h的菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)率率的乳酸菌菌株，其特征在于，對(duì)候選菌的乳酸生產(chǎn)率進(jìn)行鑒定，如果所述候選菌的乳酸生產(chǎn)率大于等于3.9±0.lg/L.h，則所述候選菌為乳酸生產(chǎn)率高的乳酸菌。·
【文檔編號(hào)】C12R1/225GK103849582SQ201310750354
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
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