用于制造大珠粒的改進方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于制備瓊脂糖涂覆的、瓊脂糖珠粒的改進方法，所述珠粒含有細胞。優(yōu)選地自動化的方法涉及將制造的珠粒置于溫度梯度的礦物油樣品中，使得所述溫度隨著所述珠粒通過所述油移動而下降。優(yōu)選地，在該方法中使用“喇叭形工具”和“秸稈形工具”。
【專利說明】用于制造大珠粒的改進方法
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2012年I月31日提交的美國臨時申請N0.61/592，949的優(yōu)先權，將其全文并入作為參考。
發(fā)明領域
[0003]本發(fā)明涉及用于制備物質組合物的改進方法，所述物質組合物包含包裹在可滲透的珠?；蚱渌Y構中的細胞(特別是分泌細胞)，然后用瓊脂糖進行涂覆。所述珠?？梢园傊腔蛴森傊墙M成。Litex瓊脂糖對于該珠粒尤為優(yōu)選。
[0004]發(fā)明背景
[0005]含有包裹在可滲透介質中的活細胞的物質組合物的制造已經顯示出在多個領域中是重要的，如糖尿病治療、癌癥治療和干細胞維持。在這點上，參見，例如，Reissue40, 555 ;美國專利 N0.7，838，291 ;6，818，230 ;6，808，705 ;6，303，151 ;6，224，912 ；5，888，497 ;和5，643 ，569，以及公開的專利申請2007/0071732，將其全部并入作為參考。
[0006]用于制備這些物質組合物(下文中稱為“包膠物(encapsulate)”)的方法是基本上相同的，與所用的細胞類型無關。分離或獲得目標細胞后，將這些細胞懸浮于諸如瓊脂糖、膠原蛋白或其組合這樣的試劑的水溶液中，或置于諸如明膠海綿這樣的材料上。當使用水溶液時，通過將所述懸浮液置于礦物油中，形成含有目標細胞的半固體珠粒。如果使用明膠海綿，則將含有該細胞的產品滾成球形，此后將瓊脂糖倒在其上面，以形成珠粒。
[0007]然后使所述珠粒接觸在例如特富龍勺子中的瓊脂糖溶液。將所述珠粒在該混合物中滾動，以形成在上文引用的現(xiàn)有技術中被稱為瓊脂糖涂覆的大珠粒的物質。
[0008]例如，由教導了包裹分泌細胞(如，胰島素生成胰島和癌細胞)的RE40，555和美國專利N0.5，888，497所示的最初教導后面已經有了改進，包括包裹干細胞，如美國專利N0.7，838，291所示的，并且通過所用材料的改進，如例如公開的專利申請2007/0071732中所看到的；然而，對于改進用于制備這些有用材料的方法存在著日益需求。
[0009]這個領域非常需要的一個改進是使人工方法自動化的能力。
[0010]在使制造方法自動化的過程中，本發(fā)明人已經研發(fā)了專用工具，其有助于該制造方法。此外，他們已經發(fā)現(xiàn)了在通過將大珠粒置于溫度梯度下的礦物油容器中來完成該方法中，可以生產具有比認為可能的更均勻的形狀和平滑質地的大珠粒。
[0011]將在以下的公開內容中看到這是怎樣完成的。
[0012]附圖簡述
[0013]圖1顯示了將細胞和瓊脂糖自動分配至含有礦物油的多孔陣列中。
[0014]圖2a_2c呈現(xiàn)了本發(fā)明的“喇叭形工具”的優(yōu)選實施方案的不同視圖。
[0015]圖3顯示了所述喇叭形工具的第二個實施方案。
[0016]圖4a和4b顯示了本發(fā)明的秸桿形工具的不同實施方案。
[0017]圖5描繪了本發(fā)明方法的概述。
[0018]圖6顯示了用于維持本發(fā)明操作中的溫度梯度的裝置。[0019]圖7描繪了來自用不同濃度和類型的瓊脂糖制得的珠粒的胰島素生成水平。
[0020]優(yōu)選實施方案的詳述
[0021]參考上文引用的美國專利，其全部描述了用于制備大珠粒的人工方法，所述大珠粒含有不同類型的細胞，如本文中限定的分泌細胞。如下文中描述的，本文中描述的本發(fā)明通過用含有保持在溫度梯度下的礦物油的容器替代使瓊脂糖涂覆的瓊脂糖珠粒與勺子中或特富龍表面上的礦物油接觸的最后一個步驟改變了那些方法。
[0022]如這些專利中描述的大珠粒也可以通過機器人或經由自動化來制得。本文中描述了一種這樣的方法。
[0023]在一個實施方案中，如圖1中所描繪的，機器人分配器，如移液管陣列，將分泌細胞分配至多孔平板，如標準96孔平板中。然后將熔化的瓊脂糖加入孔中。然后經由例如自動化裝置(如，多移液管陣列)將所述細胞和熔化的瓊脂糖轉移至含有礦物油的裝置(如，單孔或多孔容器，如96孔平板)中，以形成珠粒。
[0024]然后從孔中取出珠粒，優(yōu)選通過使用圖“2a_c和3”中描繪的所謂的“喇叭形工具”。設計了如下文詳細闡述的喇叭形工具，使得不破壞珠粒的表面。
[0025]在進一步的實施方案中，在孔的底部提供了出口裝置，所述珠粒通過其離開孔，并且可以用于隨后的步驟中。在再進一步的實施方案中，從上文討論的方法獲得的珠?？梢越浻勺詣踊b置(如，可移動的平臺)轉移至礦物油的頂部，并且還經由自動化系統(tǒng)從含有礦物油的裝置中取出。
[0026]在通過喇叭形工具撿出或通過出口裝置，并且通過用合適的溶液(如，平衡鹽溶液)沖洗除去任何粘附的礦物油后，將珠粒置于含有新的、溫熱的瓊脂糖的孔中。接著，將珠粒和溫熱瓊脂糖一起取出，優(yōu)選使用如圖4a和4b中所示的所謂的“秸桿形工具”，使用溫和的吸取，并且分配至受控溫度梯度下的含有礦物油的容器中。
[0027]含有礦物油的容器可以是，例如，試管、比色皿、燒杯，或合適的任何其他物體，盡管優(yōu)選各種大小的試管和比色皿。用于制備容器(即，試管、比色皿等)的材料可以不同。玻璃尤為優(yōu)選，盡管可以使用其他材料，如涂覆了提供親水層的物質的那些。
[0028]可以通過本領域已知的任何方法來維持容器中的溫度梯度。關鍵在于容器頂部的礦物油的溫度高于其底部的。梯度的溫度和數(shù)量將根據(jù)例如容器的長度、包裹的細胞的類型、所用的瓊脂糖類型等而改變。對于設定這些值重要的因素包括，例如，所包裹細胞是活的的溫度、所用的瓊脂糖將固化的溫度等等。梯度開始的溫度優(yōu)選為20°C至80°C，更優(yōu)選20°C至50°C，并且甚至更優(yōu)選地，20°C至40°C。理想地，起始溫度為約20°C至約25°C。容器底部的溫度可以改變，例如變化范圍為O °C至-1 (TC，更優(yōu)選O °C至-8 °C，并且最優(yōu)選約O V至約-2°C。最高和最低溫度之間的總差異優(yōu)選為20°C至50°C，更優(yōu)選約20°C至約30°C。
[0029]作為本申請一部分的附圖將詳細論述前面的描述。
[0030]圖1顯示了怎樣將細胞和瓊脂糖兩者分配至平板的孔中。經由例如洗滌或抽吸或經由上文討論的出口裝置除去礦物油后，將上文提及的并且如圖2a_2c和3中所示的“喇叭形工具”插入孔中，以取出具有包裹的細胞的珠粒。這種喇叭形工具在一端具有連接的真空源，其沒有破壞珠粒的表面，使得有助于取出。
[0031]由一層瓊脂糖和細胞組成的珠粒經由所謂的“喇叭形工具”沉積至新的孔中，所述新的孔中充滿加熱過的瓊脂糖，其作為第二層，或涂覆瓊脂糖。將珠粒和溫熱的瓊脂糖一起取出，優(yōu)選地通過使用“秸桿形工具”，如圖4a和4b中所示那些中的一種，優(yōu)選地借助溫和的抽吸來取出，并且將珠粒分配至含有溫度梯度礦物油的容器中?？梢酝ㄟ^例如圖5中所示的裝置來維持溫度梯度，但本領域技術人員將熟知其他選擇。當大珠粒穿過容器并且到達底部時，可以使用延長形式的喇叭形工具，使用抽吸，以取出大珠粒，用于在介質中洗滌，或如上文所述的，可以使用用于取出珠粒的出口裝置。在這一點上，大珠粒準備好待使用，盡管在不同的情況中，可能優(yōu)選允許細胞在珠粒內增殖和/或成熟，直至存在足夠的數(shù)量或直至細胞表達特定的產物。這個時間段可以為例如一周至數(shù)月。
[0032]現(xiàn)在參照所要求的發(fā)明的附圖，圖2a、2b、2c和3顯示了根據(jù)本發(fā)明的所謂的“喇叭形工具”的設備的不同視圖。
[0033]參 照圖2a，顯示了一種喇叭形工具40。將工具描述為“喇叭形工具”源自倒圓錐部分41類似喇叭。在一端，提供了倒圓錐部分41，具有連接圓錐端41的輪緣42。圓錐端41連接中空的、縱向部分43，其適于流體，如空氣穿過其中。
[0034]如圖2a所示，中空的縱向部分43沿著整個設備延伸?？梢钥吹江h(huán)圈裝置44放置在沿著喇叭形工具長度的相對于倒圓錐端的約2/3至3/4處。環(huán)圈裝置44，以及本文中描述的幾個結構元件，是制造方法的人工制品，并且沒有影響裝置的功能。
[0035]然而，環(huán)圈裝置44，標志著縱向裝置增大其圓周的點。45表示的設備的部分對應于聯(lián)接端，其在操作中連接工具和流體源，例如，空氣，如真空。連接孔46具有裝置任何部分最寬的周長，并且用于完成與例如真空裝置的連接。提供了內部結構，如圖2c中呈現(xiàn)的那些，以促進真空裝置的連接。這些結構可以根據(jù)所使用的儀器而變化。
[0036]觀察到設備中的隆起裝置47以及一系列均勻間隔的突出物48a、b和C，與環(huán)圈裝置44 一樣，都是制造的人工制品；然而，這些突出物也用于幫助將相連的工具固定在正確的位置，例如，固定在分配支架中。
[0037]在圖2b和2c中，都可以看到設備的內部，其中可以看到實際上設備沿著其長度是中空的。圖2c中的倒圓錐區(qū)段的視圖更詳細地顯示了怎樣逐漸變細至圓周略小于設計來吸取的物質(例如，珠粒)的點。
[0038]在操作中，設備40經由連接端46連接于例如真空泵裝置，并且將其垂直地置于待取出的物質，如珠粒上。真空泵裝置(未顯示)除去工具內的任何空氣，并且允許吸入珠粒，例如，通過控制由真空形成的抽吸力來吸入，倒圓錐端41的構造允許從一個位置取出珠粒，如半軟的瓊脂糖珠粒，并且移動至另一個位置，如涂覆瓊脂糖的溶液。在該點上，通過例如給縱向裝置45提供空氣來改變真空壓力，其起到將珠粒從錐形端41排入瓊脂糖溶液中的作用，而沒有給珠粒的構造帶來任何變化。
[0039]圖3顯示了圖2a_2c的設備的另一個實施方案。通過不同于圖2a_2c的實施方案的制造方法制備的這個設備呈現(xiàn)出沿著縱向部分43的隆起裝置。此外，將注意到環(huán)圈裝置以及隆起裝置47和48a-c中存在變化。然后，倒錐形端41及其輪緣，以及聯(lián)接端45和連接孔，以圖2a-2c的相當結構的相同方式來起作用。
[0040]圖4a和4b描繪了下文中稱為“秸桿形工具”的設備?，F(xiàn)在參照圖4a，顯示了秸桿形工具50。該工具呈現(xiàn)出沿著中空縱軸51、聯(lián)接端52和接收端53的基本上是圓柱形的幾何結構。
[0041]秸桿形工具包括凹入的空間54，其沿著縱軸51延伸，在接收端53開口。[0042]接收空間54沿著縱軸延伸，并且其連接管道部分55，其可以具有小于接收空間的直徑。該管道部分55連接連接裝置52，并且“52”、“54”和“55”的組合形成工作通道，其接受流體，如空氣或另一種氣體壓力的變化。在操作中，連接裝置52與能夠改變秸桿形工具中的流體壓力的設備，如空氣泵連在一起。然后將秸桿形工具置于目標物，如珠粒上，并且在壓力改變時，通過秸桿形工具取出珠粒。應當注意到接收端53的開口的直徑足夠大，使得能夠撿出目標物，例如，珠粒，并且允許珠粒在工具的縱向空腔中垂直移動。一旦珠粒被移動至所需位置，第二次的壓力變化使珠粒掉下，并且允許重新使用秸桿形工具。
[0043]圖4a和4b在連接裝置52的構造上是不同的；然而，構造的差異是由制造方法形成的，并且沒有影響設備的運行。
[0044]在每個設備中，虛線表示秸桿形工具適用于接收選擇的真空連接裝置。描繪了凹入的通道56，其能夠接納連接裝置，如可擴展的O-環(huán)。此外，該設備的特征是裝置57，用于阻擋移液管的前進。這種“移液管擱架”停止了移液管或其他遞送裝置通過流體，例如，空氣。
[0045]以下實施例應當認為是本文中所述的本發(fā)明的示例，而不是限制。
[0046]實施例1
[0047]將粉末狀瓊脂糖(Litex HSB-LV)溶解于最小必需培養(yǎng)基中，至0.8%或4.5%(界/V)濃度，然后在121 °C下高壓滅菌20分鐘。這產生了粘性的熔化溶液。將瓊脂糖溶液冷卻，并且分別維持在51-53 °C或61-63°C。
[0048]將總共150，000RENCA(腎癌)細胞加入孔中，此后加入0.25ml0.8%瓊脂糖溶液，以形成懸浮液，并且然后將這種細胞/瓊脂糖懸浮液分配至塑料碗中的室溫礦物油中，或分配至之前裝滿了室溫礦物油的深孔96塑料平板中。
[0049]形成了含有RENCA細胞的瓊脂糖大珠粒，作為具有光滑表面并且均勻分布細胞的圓珠。然后從大珠粒吸去礦物油，用RPMI細胞培養(yǎng)基洗滌大珠粒。
[0050]大珠粒的涂層使用了 4.5% w/v溶液。用于涂層的瓊脂糖與用于珠粒的是相同類型；然而，應當注意到它們可以不同。
[0051]為了進行制備珠粒的人工模式，將上文制得的珠粒在含有1.0ml4.5%瓊脂糖的塑料勺子中滾動，所述瓊脂糖維持在61-63°C，此后將其滴入室溫礦物油中。
[0052]在本發(fā)明的方法中，將涂層材料維持于61_63°C，并且轉移至24孔平板。然后使用圖2a中所示的以及在上文討論的“喇叭形工具”，從室溫礦物油中取出珠粒并且在洗滌珠粒除去礦物油后將其置于第二個涂層瓊脂糖溶液中。圖4a中描繪的秸桿形工具與溫和抽吸一起使用，以取出珠粒，并與0.5ml瓊脂糖一起，置于含有維持在溫度梯度下的礦物油的容器中。
[0053]將大珠粒從秸桿形工具中分配至礦物油梯度的頂部，其維持在不同溫度，如下文所討論的。隨著大珠粒下降通過礦物油，涂層在珠粒上固化，形成球形。礦物油的溫度從容器頂部降至底部，底部溫度低，同樣在下文有所討論。然后使用圖2a的喇叭形工具從容器中取出瓊脂糖/瓊脂糖大珠粒，然后在培養(yǎng)基中洗滌。所得到的大珠粒隨后就可用于常規(guī)組織培養(yǎng)。
[0054][0055]使用了一系列不同實驗，所述實驗使用上文所述的溫度梯度。
【權利要求】
1.用于生產物質組合物的方法，所述物質組合物包含在含有瓊脂糖的珠粒中的細胞樣品，其中所述珠粒被瓊脂糖涂覆，所述方法包括: (a)將第一瓊脂糖樣品與所述細胞混合，以形成懸浮液； (b)從所述懸浮液形成珠粒； (C)用第二瓊脂糖溶液涂覆所述珠粒，和 (d)將所述涂覆的珠粒分配至礦物油樣品中，其中將所述礦物油樣品保持在溫度梯度下，使得所述珠粒從較高溫度的礦物油移動至較低溫度的礦物油。
2.權利要求1的方法，其中所述細胞是分泌細胞。
3.權利要求1的方法，其中所述細胞是癌細胞。
4.權利要求1的方法，其中所述細胞是癌干細胞。
5.權利要求1的方法，其中所述細胞是胰島細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述細胞是干細胞。
7.權利要求6的方法，其中所述細胞是胚胎干細胞。
8.權利要求1的方法，其中所述細胞是多能細胞。
9.權利要求1的方法，進一步包括在用第二瓊脂糖溶液涂覆所述珠粒之前，用喇叭形工具從所述懸浮液中取出所述珠粒。
10.權利要求1的方法，進一步包括用喇叭形工具從所述礦物油中取出所述珠粒。
11.權利要求1的方法，其中所述溫度梯度從約20°c至約50°C，較高溫度在所述梯度開始時。
12.權利要求11的方法，其中所述較高溫度變化范圍從約20°C至約35°C。
13.權利要求1的方法，其中所述較高溫度從約20°C至約30°C，并且所述較低溫度從約(TC 至約-8°C。
14.權利要求13的方法，其中所述較高溫度從約20°C至約25°C，并且所述較低溫度從約(TC至約-2°C。
15.可用于將物體從一個點轉移至另一個點的裝置，其包括具有中空縱軸的整體構造，所述中空縱軸在一端具有連接所述中空縱軸的倒圓錐，而在第二端具有適于連接真空裝置的裝置，所述在第二端的裝置具有大于所述縱軸和倒圓錐裝置兩者的直徑。
16.可用于將物體從一個點轉移至另一個點的裝置，該裝置包括具有中空縱軸和兩端的整體構造，其第一端適于連接至真空裝置，而第二端適于接收待轉移的物體，所述轉移裝置進一步包括適于接納用于流體源的連接裝置的內部裝置，和用于阻止遞送設備的裝置，所述遞送設備用于轉移所述流體。
【文檔編號】C12N11/04GK103975059SQ201380003873
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權日:2012年1月31日
【發(fā)明者】L·蓋茲達, M·拉臘莫爾, T·漢密爾頓, B·史密斯 申請人:羅格辛研究所