生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物的喹啉酸生產方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物生產喹啉酸的方法，所述重組微生物表達這樣的融合蛋白，其中L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶由接頭連接。
【專利說明】生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物的喹啉酸生產方 法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生產喹啉酸的重組微生物及利用該微生物生產喹啉酸的方法。

【背景技術】
[0002] 喹啉酸（quinolinic acid)也被稱為2, 3-批陡-二羧酸，在醫(yī)藥、農藥、染料等諸 多領域中被用于化學合成物的前體。
[0003] 上述喹啉酸可以通過化學或生物合成方法制備。化學合成方法將來自石油的不可 再生（non-renewable)材料作為原料使用，因此會受到環(huán)境問題和油價或石油提取單位成 本的影響。
[0004] 作為生物合成方法的代表性的例子，公開了在下述大腸桿菌（E. coli)中生產喹 啉酸的方法：在去除了喹啉酸磷酸核糖基轉移酶活性的大腸桿菌中，通過克隆具有編碼 L-天冬氨酸氧化酶（NadB)和喹啉酸合成酶（NadA)的基因的不同拷貝數(shù)的質粒，使上述兩 種基因的表達得到增強（Eur. J. Biochem. 175, 221-228 (1988)，DE3826041)。此時，產生的 喹啉酸的濃度為500mg/L或以下的非常低的水平。生成如此低濃度的喹啉酸的第一個原因 是NadR的轉錄抑制，其為編碼L-天冬氨酸氧化酶的nadB和編碼喹啉酸合成酶的nadA的 與NAD相關的轉錄抑制子。第二個原因是NAD導致的L-天冬氨酸氧化酶--NadB蛋白質 的反饋抑制。第三個原因是大腸桿菌中由碳源至L-天冬氨酸的生物合成途徑變弱。
[0005] 為了解決第一個原因，在韓國專利公報第10-2012-008267號中，使用了微生物 菌株來將喹啉酸的產量提高到5. 5g/L，其中將在轉錄階段受到抑制的喹啉酸生物合成基 因 L-天冬氨酸氧化酶（NadB)和喹啉酸合成酶（NadA)的啟動子區(qū)域替換為組成型啟動子 (constitutive promoter),并增強了 L-天冬氨酸生物合成路徑。
[0006] 通過生物合成方法由L-天冬氨酸合成喹啉酸的生物合成途徑如以下反應方案所 /_J、1 〇
[0007] 1) L-天冬氨酸氧化酶（NadB)
[0008] L-天冬氨酸+氧〈= > 過氧化氫+ α -亞氨基丁二酸+H+
[0009] 2)喹啉酸合成酶（NadA)
[0010] α -亞氨基丁二酸+磷酸二羥丙酮〈= > 喹啉酸+磷酸+2H20
[0011] 上述喹啉酸生物合成途徑中的中間代謝產物α-亞氨基丁二酸是一種不穩(wěn)定 的物質，具有在細胞內由天然的脫氨基反應，轉化為草酰乙酸酯的特性（THE JOURNAL 0F BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.257，No.2，Issue of January 25. ρρ· 626-632, 1982)。通常， 當不穩(wěn)定的中間代謝產物被用作基質時，如果上述基質與酶之間的碰撞頻率不高，則會生 成大量的副產物。但是，目前為止還沒有為解決與喹啉酸的生產相關的上述問題而進行的 嘗試。
[0012] 另一方面，將異種酶或蛋白質通過氨基酸接頭連接，使它們表達為一個蛋白質的 融合蛋白技術，被用于各種目的，例如將表達量少的蛋白質與表達量多的蛋白質連接，從而 增加上述蛋白質的表達量，或者制備成與標記（Tag)連接的融合蛋白，從而提高蛋白質的 純化率等。
[0013] 已知接頭的設計對于制備融合蛋白是重要的。通常，多使用具有α-螺旋結構 的螺旋形接頭或結構上具有柔性（flexibility)的柔性接頭，并且例如，根據(jù)想要實現(xiàn) 的融合蛋白的特性，可通過組合上述兩種接頭設計和使用各種接頭（Cancer Res 2005; 65: (16). August 15,2005)〇
[0014] 公開
[0015] 技術問題
[0016] 本發(fā)明人嘗試通過表達由不同類型的氨基酸接頭連接而成的NadB和NadA的融合 蛋白，來解決由不穩(wěn)定的代謝產物導致的反應降低，并發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的生物學生產方法相比， 通過表達所述融合蛋白能夠以高收率生產喹啉酸，從而完成本發(fā)明。
[0017] 技術方案
[0018] 本發(fā)明的目的是提供生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接的L-天冬氨 酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是提供生產喹啉酸的方法，包括培養(yǎng)上述重組微生物的步驟 和回收在上述培養(yǎng)過程中產生的喹啉酸的步驟。
[0020] 有益效果
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，通過提供表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的 融合蛋白的微生物，能夠將現(xiàn)有生物學生產工序中的α -亞氨基丁二酸的自然分解反應最 小化，由此能夠以高產率生產喹啉酸。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一具體實施方案的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的 融合蛋白的結構。
[0023] 圖 2 顯示了 pPro-NBA、pNBHLIA、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A、 PNBFL4A質粒的結構。
[0024] 圖3顯示了表達編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸轉氨酶的基因的質 粒pCPA的結構。
[0025] 優(yōu)選實施方案的詳述
[0026] 作為一個實施方案，本發(fā)明提供了生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接 的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。
[0027] 上述L-天冬氨酸氧化酶（以下，稱為"NadB"）作為具有將L-天冬氨酸氧化為亞 氨基丁二酸的活性的酶，可以具有由SEQ ID N0. 42表示的氨基酸序列或與之有高同源性的 氨基酸序列。
[0028] [L-天冬氨酸氧化酶的活性]
[0029] L-天冬氨酸+延胡索酸〈=> α -亞氨基丁二酸+琥珀酸+H+，或者，
[0030] L-天冬氨酸+氧〈= > 過氧化氫+ α -亞氨基丁二酸+Η+
[0031] 編碼上述酶的基因 nadB的序列可以從文獻（Mol Syst Biol. 2006 ; 2:2006. 0007. Epub 2006 Feb 21)中公開的大腸桿菌（Escherichia coli)的基因組序列 (gi:GI:89109380)或者例如美國國家生物技術信息中心（NCBI)及日本DNA數(shù)據(jù)庫（DDBJ) 等數(shù)據(jù)庫中獲取。
[0032] 上述喹啉酸合成酶（以下，稱為"NadA"）作為具有從亞氨基丁二酸合成喹啉酸的 活性的酶，可以具有由SEQ ID N0. 43表示的氨基酸序列或與之有高同源性的氨基酸序列。 [0033][喹啉酸合成酶的活性]
[0034] α -亞氨基丁二酸+磷酸二羥丙酮〈= > 喹啉酸+磷酸+2H20
[0035] 編碼上述酶的基因 nadA的序列可以從文獻（Mol Syst Biol. 2006 ;2:2006. 0007. Epub 2006Feb 21)中公開的大腸桿菌的基因組序列（gi:GI:89109380)或NCBI及DDBJ等 數(shù)據(jù)庫中獲取。
[0036] 如果增強上述NadB和NadA的活性，則在細胞內作為喹啉酸前體的α -亞氨基丁 二酸的蓄積與從α -亞氨基丁二酸至喹啉酸的生物合成增加，從而可以增加喹啉酸的生產 量。但是，由于上述α-亞氨基丁二酸是不穩(wěn)定的代謝物，盡管上述兩種酶（NadB及NadA) 的活性和表達量增加，如果α -亞氨基丁二酸與NadA的接觸頻率不高，則會生成大量的副 產物，由此無法像期待的那樣有效地生產喹啉酸。為了解決這個問題，本發(fā)明使NadB及 NadA以通過接頭相互連接的融合蛋白的形式在菌株中得到表達，從而能夠以高收率生產喹 啉酸。
[0037] 上述NadB及NadA可以具有分別由SEQ ID N0. 42和43表示的氨基酸序列，但根 據(jù)微生物的種類或菌株，顯示上述活性的蛋白質的氨基酸序列可能存在差異，因此不限定 于此。即，只要上述NadB及NadA是以通過接頭相互連接而制備的融合蛋白形式提供，從而 有助于增加喹啉酸的產率，它們可以是在SEQ ID N0. 42和43的氨基酸序列的一個或多個 位置上，具有由一個或多個氨基酸的替換、缺失、插入或添加等而變異的氨基酸序列的突變 體或人工變異體。在本文中，"多個"可根據(jù)蛋白質的三維結構中的氨基酸殘基的種類或位 置而有所不同，具體地可以是2?20個，優(yōu)選2?10個,更優(yōu)選2?5個。此外，氨基酸的 替換、缺失、插入、添加或倒位等可以包括基于表達上述多肽的微生物的個體和/或物種的 差異性等的天然存在的突變或人工變異。
[0038] 只要它們具有上述反應方案所示的NadB及NadA酶促活性，編碼上述NadB及NadA 酶的多核苷酸可以是編碼分別與SEQ ID NO. 42和43的氨基酸序列有80%或更高同源性， 優(yōu)選有90%或更高同源性，更優(yōu)選有95%或更高同源性，更加優(yōu)選有97%或更高同源性的 蛋白質的多核苷酸。最優(yōu)選地，所述多核苷酸可具有分別由SEQ ID N0. 27和28表示的多 核苷酸序列。
[0039] 本發(fā)明中的術語"同源性"表示兩個氨基酸序列之間的一致性，可通過本領 域技術人員公知的方法進行確定，例如計算分數(shù)（score)、一致性（identity)、相似性 (similarity)等參數(shù)的 BLAST 2. 0。
[0040] 編碼上述NadB及NadA酶的多核苷酸序列可以是SEQ ID NO. 27或SEQ ID NO. 28 的多核苷酸序列，或者可以在"嚴格的條件"下與由上述多核苷酸序列制得的探針雜交，還 可以編碼功能正常的蛋白質的變異體。
[0041] 在本發(fā)明中，術語"嚴格的條件"指允許多核苷酸之間的特異性雜交的條 件。 在 Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. , Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 或 Current Protocols in Molecular Biology(F. M.Ausubel et al., Editors,John Wiley&Sons，Inc.，New York)中有具體的記載，例如于65°C下在雜交緩沖液（3.5XSSC、 0.02%的聚蔗糖、0.02%的聚乙烯吡咯烷酮、0.02%的牛血清白蛋白、2.5禮的似4?0 4(?!1 7)、0. 5 %的SDS、2mM的EDTA)中的雜交。SSC是pH7的0. 15M氯化鈉/0. 15M檸檬 酸鈉。雜交后，在室溫下用2XSSC清洗已轉移有DNA的膜，并在68°C的溫度下用 0· 1-0. 5 X SSC/0. 1 X SDS 清洗。
[0042] 本發(fā)明的融合蛋白是將顯示不同活性的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶通過 氨基酸接頭互相連接而成的多肽，具有下述反應方案中所示的由L-天冬氨酸生物合成喹 啉酸的活性。
[0043][融合蛋白的活性]
[0044] L-天冬氨酸+氧+磷酸二羥丙酮〈= > 喹啉酸+磷酸+2H20+過氧化氫
[0045] 如果增強上述融合蛋白的活性，則會提高作為中間代謝產物的α -亞氨基丁二酸 至喹啉酸的轉化率，從而與獨立地增強NadB及NadA活性的情況相比，能夠以更高的產率生 產喹啉酸。
[0046] 上述融合蛋白可以是通過接頭將L-天冬氨酸氧化酶的N端和喹啉酸合成酶的C 端連接而成的多肽，或者是通過接頭將L-天冬氨酸氧化酶的C端和喹啉酸合成酶的N端連 接而成的多肽，優(yōu)選是選自SEQ ID N0.47、48、49、50、51、52及53中的氨基酸序列。
[0047] 上述接頭位于NadB和NadA多肽之間或者編碼這些多肽的基因之間，其可以是螺 旋形接頭或柔性接頭。此外，可以單獨地或組合使用螺旋形接頭或柔性接頭作為上述接頭， 可以使用" EAAAK "或" EAAAR "作為上述螺旋形接頭，可以使用" GGSGGS "、" GGGS "、" GGSG "或 "GS"作為柔性接頭，但其不限于此。
[0048] 上述接頭可由5?30個氨基酸序列組成，并且可以將螺旋形接頭或柔性接頭單獨 地或重復地連接使用。
[0049] 根據(jù)一個具體的實施方案，含有上述螺旋形接頭的接頭可以是LA(EAAAK)nAAA，含 有上述柔性接頭的接頭可以是L(GGGS)nAAA。優(yōu)選地，上述η可以是1?5的整數(shù)。
[0050] 根據(jù)一個具體的實施方案，上述接頭可以具有選自SEQ ID Ν0. 54、55、56、57、58、 59及60中的氨基酸序列，或者與它們有高同源性的氨基酸序列，但不限定于此。
[0051] 本發(fā)明的"生產喹啉酸的重組微生物"是能夠從培養(yǎng)基中的碳源生產并蓄積喹啉 酸，并表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白，從而能夠以高產 率生產喹啉酸的微生物。
[0052] 通過導入編碼上述融合蛋白的多核苷酸，可以制備本發(fā)明的重組微生物以表達融 合蛋白。
[0053] 根據(jù)一個具體的實施方案，本發(fā)明的重組微生物可以通過將含有編碼上述融合蛋 白的多核苷酸的重組載體轉化到該重組微生物中來制備。
[0054] 本發(fā)明中，術語"轉化"是指將基因導入宿主細胞內，使其能在宿主細胞內表達。只 要被轉化的基因能夠在宿主細胞內表達，其可以位于任何位置而不受限制，不論是被插入 染色體內還是位于染色體外。此外，只要上述基因能夠導入宿主細胞內表達，其可以任何形 式導入。例如，上述基因可以以含有上述基因自我表達所需要的所有要素的多核苷酸結構 的表達盒（expression cassette)形式導入宿主細胞內。上述表達盒通常包括與上述基因 可操作地連接的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合位點及翻譯終止信號。上述表達盒可以 是能夠進行自我復制的表達載體形式。此外，上述基因可以以多核苷酸結構或其自身的形 式導入宿主細胞中，且能夠可操作地與宿主細胞中進行表達所需要的序列連接。
[0055] 上述重組載體是一種通過將DNA導入宿主細胞來制備制備表達本發(fā)明的融合蛋 白的微生物，以表達融合蛋白的方式，可以使用質粒載體、粘粒載體、噬菌體載體等公知的 表達載體，并且本領域技術人員可根據(jù)使用DNA重組技術的任意公知方法容易地制備載 體。
[0056] 優(yōu)選地，上述重組載體可以是具有圖2所示的切割圖的pNBHLIA、pNBHL2A、 pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A或pNBFL4A質粒載體，更優(yōu)選地，上述質粒載體可以分 別含有SEQ ID N0. 34、35、36、37、38、39和40的核苷酸序列。
[0057] 根據(jù)一個具體實施方案，生產喹啉酸的微生物可以是屬于腸桿菌（Enterbacter sp.)、埃希氏菌（Escherichia sp.)、歐文氏菌（Erwinia sp.)、沙雷氏菌（Serratia sp·)、普羅威登斯菌（Providencia sp·)、棒狀桿菌（Corynebacterium sp.)或短桿菌 (Brevibacterium sp.)的微生物，優(yōu)選屬于埃希氏菌的微生物，更優(yōu)選為大腸桿菌，但不限 定于此。
[0058] 與內源性活性相比，本發(fā)明的微生物的喹啉酸磷酸核糖基轉移酶（NadC)的活性 會進一步減弱。本文的術語"內源性活性"是指天然微生物所具有的喹啉酸磷酸核糖基轉 移酶的活性。
[0059] 上述NadC具有將喹啉酸轉化為煙酸單核苷酸的活性，且可以具有SEQ ID N0. 44 的氨基酸序列或與之有高同源性的氨基酸序列。編碼上述酶的基因 nadC的序列可以從文 獻（Mol Syst Biol. 2006 ;2:2006· 0007. Epub 2006 Feb 21.)中公開的大腸桿菌的基因組 序列（GI :89106990)或NCBI、DDBJ等數(shù)據(jù)庫中獲取。
[0060] [喹啉酸磷酸核糖基轉移酶的活性]
[0061] 5-磷基-a -D-核糖1-二磷酸+喹啉酸+2H+〈 = >C02+二磷酸+煙酸單核苷酸
[0062] 通過減弱上述NadC的活性，可以增加細胞內喹啉酸的蓄積?？赏ㄟ^選自以下的方 法實現(xiàn)酶活性的減弱：1)編碼上述酶的基因的部分或全部缺失，2)對表達調控序列進行修 飾以減少基因的表達（例如，將上述基因的內源啟動子替換為較弱的啟動子），3)對染色體 上的上述基因序列進行修飾，以減弱上述酶的活性，及4)它們的組合。在本發(fā)明的具體實 施例中，通過同源重組的方式，將nadC從微生物的基因組中去除。
[0063] 此外，可進一步修飾本發(fā)明的微生物，以增強選自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天 冬氨酸轉氨酶及本發(fā)明的融合蛋白中的一種或多種蛋白質的活性，以增強磷酸烯醇式丙酮 酸至L-天冬氨酸的生物合成途徑。
[0064] 上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC)及L-天冬氨酸轉氨酶（AspC)具有從磷酸烯 醇式丙酮酸合成L-天冬氨酸的活性，且可以具有分別由SEQ ID N0. 45和46表示的氨基酸 序列或與之有高同源性的氨基酸序列。編碼上述酶的基因 ppe或aspC的序列可以從文獻 (Mol Syst Biol. 2006 ;2:2006. 0007. Epub 2006Feb 21.)中公開的大腸桿菌的基因組序列 (gi :GI :89110074, GI :89107778)或 NCBI、DDBJ 等數(shù)據(jù)庫中獲取。
[0065][磷酸烯醇丙酮酸羧基酶的活性]
[0066] 磷酸烯醇式丙酮酸+C02 -草酰乙酸+磷酸
[0067] [L-天冬氨酸轉氨酶的活性]
[0068] 草酰乙酸+谷氨酸〈=>L_天冬氨酸+2-酮戊二酸
[0069] 因此，如果增強PPC和AspC的活性，則可以增加細胞內作為喹啉酸前體的L-天冬 氨酸的生產量，從而能夠增加喹啉酸的生產量。
[0070] 上述酶活性的增強可通過選自以下的方法實現(xiàn)：1)增加編碼上述酶的基因的拷 貝數(shù)的方法，2)對表達調控序列進行修飾以增加基因表達的方法，3)對染色體上的上述基 因序列進行修飾，以增強上述酶的活性的方法，及4)它們的組合。在本發(fā)明的具體實施例 中，構建了含有編碼上述酶的基因的質粒，并將其導入生產喹啉酸的微生物中，以增加上述 基因的拷貝數(shù)，從而誘導活性的增強。
[0071] 可以使用將編碼上述融合蛋白的基因的內源性啟動子替換為活性增強的啟動子， 或者誘發(fā)啟動子突變以增強啟動子的活性，或者增加上述基因的拷貝數(shù)等方法，以增強上 述融合蛋白的活性。通常可以使用pTac、pTrc、pPro、pR、pL、pCJl、pCysK等作為上述活性 增強的啟動子。
[0072] 在本發(fā)明的具體實施例中，將nadB和nadA的啟動子取代為組成型啟動子 pPro (SEQ ID N0. 32)，以將組成型表達的nadB和nadA基因制備成質粒形式，所述組成型 表達的nadB和nadA基因在轉錄抑制因子NadR以細胞內NAD濃度來抑制nadB及nadA的 表達時不受抑制，并將質粒導入微生物中以誘導天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的過度表 達。此外，本發(fā)明的具體實施例中，將編碼NadB-L-NadA的基因的啟動子取代為pPro啟動 子，從而誘導NadB-L-NadA的過度表達。在這一點上，pPro啟動子僅作為抵抗細胞內的反 饋抑制并提高蛋白質的表達的一個實例，本發(fā)明中所使用的啟動子不限于此。
[0073] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種生產喹啉酸的方法，包括：(a)在含有碳 源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物，所述重組微生物表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和 喹啉酸合成酶的融合蛋白；及（b)回收在上述培養(yǎng)過程中產生的喹啉酸。
[0074] 上述重組微生物可以在本領域公知的適宜的培養(yǎng)條件下于合適的培養(yǎng)基中進行 培養(yǎng)。本領域技術人員可以使用此類培養(yǎng)方案并可根據(jù)所選擇的微生物容易地進行調 整。培養(yǎng)方法包括分批式、連續(xù)式和流加式培養(yǎng)，但不限定于此。微生物的各種培養(yǎng)方法 公開在例如，"Biochemical Engineering，'，James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176。
[0075] 培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基必須以適當?shù)姆绞綕M足特定微生物的需求。多種微生物的 培養(yǎng)基公開在例如文獻（"Manual of Methods for General Bacteriology"，American Society for Bacteriology (美國細菌學學會），Washington D.C·，USA, 1981)。上述培養(yǎng) 基含有各種碳源、氮源及微量元素。
[0076] 可用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中的碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉 和纖維素等碳水化合物；大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油等油類；棕櫚酸、硬脂酸和亞 油酸等脂肪酸類；甘油和乙醇等醇類；乙酸等有機酸，但不限定于此。碳源可以單獨或組合 使用。
[0077] 可用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中的氮源包括胨類、酵母提取物、肉汁、麥精、玉米浸 漬液（CSL)及大豆粉等有機氮源；尿素；硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨等無機氮 源，但不限定于此。氮源可以單獨或組合使用。
[0078] 可用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的磷源可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀及相應的鈉 鹽。此外，還可以包括硫酸鎂或硫酸鐵等金屬鹽。此外，上述培養(yǎng)基中還可以含有氨基酸、 維生素及適宜的前體等。微生物培養(yǎng)用培養(yǎng)基或個別成分可以分批式或連續(xù)式方式添加。
[0079] 此外，可以將氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸及硫酸等化合物以適宜的方式添加到 微生物培養(yǎng)基中，從而控制發(fā)酵液的pH值。此外，在培養(yǎng)中可以使用脂肪酸聚乙二醇酯等 消泡劑來抑制氣泡生成。為了維持培養(yǎng)液的好氧狀態(tài)，可以向發(fā)酵液中注入氧氣或含氧氣 的氣體（例如，空氣）。發(fā)酵液的溫度通?？梢允?0°C?45°C，優(yōu)選25°C?40°C。培養(yǎng)期 可以持續(xù)到獲得期待量的喹啉酸為止，優(yōu)選10?160小時。
[0080] 本發(fā)明的具體實施例中，將表達質粒轉化到去除了喹啉酸磷酸核糖基轉移酶的活 性的W3110 Λ nadC菌株后，確認從這些菌株由天冬氨酸生產喹啉酸的生物合成能力，所述 表達質粒包含編碼由各種接頭連接而成的NadB-L-NadA融合蛋白的基因。結果發(fā)現(xiàn)，與這 些酶單獨的表達相比，當L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶以融合蛋白表達時，能夠以更 高的收率生產喹啉酸（表2)。
[0081] 此外，以包含編碼上述融合蛋白的基因的表達質粒轉化磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶和L-天冬氨酸轉氨酶的活性得到增強并且喹啉酸磷酸核糖基轉移酶的活性被去除的 大腸桿菌后，確認了這些菌株 CV01-0600、CV01-0601、CV01-0602、CV01-0603、CV01-0604、 CV01-0605、CV01-0606及CV01-0607的喹啉酸產率。結果發(fā)現(xiàn)，通過L-天冬氨酸氧化酶和 喹啉酸合成酶的融合蛋白的表達，能夠以高收率生產喹啉酸，并且在以融合蛋白形式表達 的同時，通過喹啉酸磷酸核糖基轉移酶活性的去除及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨 酸轉氨酶的表達增強的組合，能夠以比現(xiàn)有菌株更高的收率生產喹啉酸（表5)。
[0082] 于2011年12月21日，根據(jù)布達佩斯條約將上述生產喹啉酸的菌株--大腸桿菌 CV01-0604及CV01-0605保存在韓國微生物保存中心（KCCM，位于韓國首爾市西大門區(qū)弘濟 1洞）），登錄號為KCCM11235P及KCCM11236P。即，上述寄存是寄存在布達佩斯條約下的國 際保存單位。 實施例
[0083] 下文將參照實施例和實驗實例對本發(fā)明進行更加詳細地說明。但是，下述實施例 只是舉例說明本發(fā)明，本發(fā)明的內容并不限定于下述實施例。
[0084] 實施例1.生產喹啉酸的菌株的制備
[0085] 〈1_1>表汰L-天冬氨酸氣化酶的質粒的制各
[0086] 通過將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板的PCR，獲得了編碼L-天冬氨酸 氧化酶的基因 nadB?；趶拿绹鴩⑿l(wèi)生研究院的基因庫（NIH GenBank)獲得的SEQ ID NO. 27的nadB基因的核苷酸序列（NCBI登記號"GI:89109380"），可以對nadB基因的含有 ATG至TAA部分的0RF部分進行擴增，并合成了具有限制性內切酶Ndel和BamHI的識別位 點的SEQ ID NO. 1和2的引物。
[0087] 以大腸桿菌W3110的染色體DNA為模板，使用SEQ ID NO. 1和2的寡核苷酸作為 引物，實施PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30次循 環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸2分鐘。由 此，獲得了約1.9kb擴增的基因，所述基因均含有nadB基因和限制性內切酶Ndel和BamHI 的識別位點。
[0088] 對上述通過PCR獲得的nadB基因用限制性內切酶Ndel和BamHI進行處 理，所述nadB基因通過連接（ligation)到用限制性內切酶Ndel和BamHI處理過的 pProLar(CloneTech)載體而被克隆，最終制得克隆有nadB基因的pPro-nadB重組載體，而 nadB基因的表達受到作為組成型啟動子的pPro啟動子的調控。
[0089] 〈1-2>表汰L-天冬氨酸氣化酶及喹啉酸合成酶的質粒的制各
[0090] 通過將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板的PCR，獲得編碼喹啉酸合成酶的 基因 nadA。基于從美國國立衛(wèi)生研究院的基因庫（NIH GenBank)獲得的SEQ ID N0. 28的 nadA基因的堿基序列數(shù)據(jù)（NCBI登記號"GI: 89107601"），可以對nadA基因的含有ATG至 TAA部分的0RF部分進行擴增，并且合成具有限制性內切酶Apal和Notl的識別位點的SEQ ID N0. 3和4的引物。
[0091] 以大腸桿菌W3110的染色體DNA為模板，使用上述SEQ ID N0. 3和4的寡核苷酸 作為引物，實施PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30 次循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸2分鐘。 由此，獲得了約1. 〇kb擴增的基因，所述基因含有nadA基因和限制性內切酶Apal和NotI 的識別位點。
[0092] 此外，通過將pProLar (CloneTech)載體的染色體DNA作為模板的PCR，獲得了 Pro 啟動子?；趶腃loneTech公司獲得的Pro啟動子的堿基序列數(shù)據(jù)（SEQ ID NO. 32)，合成 了具有限制性內切酶BamHI和Apal的識別位點的SEQ ID NO. 5和6的引物，以連接pPro 啟動子和上述擴增的nadA基因。
[0093] 以大腸桿菌W3110的染色體DNA為模板，使用SEQ ID N0. 5和6的寡核苷酸作為引 物，實施PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30次循環(huán) 進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸1分鐘。由此， 獲得了約〇. 135kb擴增的基因，所述基因含有pPro啟動子和限制性內切酶BamHI和Apal 的識別位點。
[0094] 用限制性內切酶Apal和Notl對上述通過PCR獲得的nadA基因進行處理，并且 用Apal和BamHI對擴增的pPro啟動子片段進行處理。用限制性內切酶處理過的nadA及 pPro啟動子片段通過連接到用限制性內切酶Notl和BamHI處理過的上述〈實施例1-1>中 獲得的pPro-nadB而被克隆，最終制得5. 7Kb的pPro-NBA重組載體，所述pPro-NBA重組載 體克隆有表達受到作為組成型啟動子的pPro啟動子的調控的nadB基因和表達受到pPro 啟動子調控的nadA基因。制得的pPro-NBA具有SEQ ID NO. 33的序列。圖2顯示了質粒 pPro-NBA的結構，所述質粒表達編碼L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的基因。
[0095] 〈1_3>表達NadB-L-NadA的質粒的制備
[0096] 為了制備表達含有接頭的NadB-L-NadA的質粒，使用上述〈實施例1_2>中制得 的pPro-NBA (SEQ ID N0. 33)作為模板，使用SEQ ID N0. 7和8的寡核苷酸作為引物，實施 PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30次循環(huán)進行PCR， 每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸2分鐘。由此，獲得了含 有pPro啟動子和限制性內切酶的位點Xhol和位于nadB基因末端的接頭的約1. 8kb擴增 的基因。
[0097] 此外，為了擴增nadA基因片段，將pPro-NBA作為模板，使用SEQ ID NO. 15和16 的寡核苷酸作為引物，實施PCR，所述nadA基因片段與上述的約1. 8kb擴增的基因末端具 有序列同源性，其具有限制性內切酶位點Xhol，含有pPro啟動子及位于nadB基因末端 的接頭，并且在nadA基因末端含有限制性內切酶位點Notl。使用PfuUltra?DNA聚合酶 (Stratagene)作為聚合酶，通過重復30次循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、 50°C下退火30秒及72°C下延伸2分鐘。由此，獲得了約1. lkb擴增的基因，其可通過同源 性連接與接頭相連，并且在nadA基因的末端含有限制性內切酶位點Notl。
[0098] 將上述制得的"含有pPro啟動子、限制性內切酶位點Xhol及位于nadB基因末端 的接頭的約1. 8kb擴增的基因"和"與上述約1. 8kb擴增的基因的末端具有序列同源性，并 且在nadA基因的末端含有限制性內切酶的位點Notl的nadA基因片段"進行混合，并實施 拼接（Sewing)PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復10次 循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性60秒、50°C下退火60秒及72°C下延伸1分鐘。將 SEQ ID N0. 7和16的寡核苷酸添加到PCR反應液中，進一步實施PCR。使用PfuUltra? DNA 聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復20次循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性 30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸3分鐘。由此，獲得了含有"限制性內切酶XhoI_pPro 啟動子_nadB_接頭_nadA_限制性內切酶Notl"的約2. 9kb擴增的融合蛋白基因。
[0099] 用限制性內切酶Xhol和Notl對通過上述PCR獲得的"限制性內切酶XhoI_pPro 啟動子_nadB_接頭_nadA_限制性內切酶NotI "基因片段進行處理。用限制性內切酶處理 過的"pPro啟動子_nadB_接頭_nadA基因片段"通過連接到用限制性內切酶Xhol和Notl 處理過的pProLar(CloneTech)載體上而被克隆，最終制得表達受到作為組成型啟動子的 pPro啟動子的調控、nadB基因和nadA基因由接頭克隆成單一融合蛋白的pNBHLIA重組載 體。本實施例中使用的接頭由5?30個氨基酸組成，并具有分別由SEQ ID N0. 54、55、56、 57、58、59和60表不的氨基酸序列。
[0100] 通過將含有接頭的SEQ ID N0. 8的寡核苷酸替換為SEQ ID N0. 9、10、11、12、13或 14的寡核苷酸來擴增nadB基因片段的方法，擴增含有各種接頭的基因，其每個含有pPro 啟動子和位于nadB基因末端的接頭，并使用與上述相同的方法制備pNBHL2A、pNBHL3A、 PNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A 及 pNBFL4A 重組載體。制得的 pNBHLIA、pNBHL2A、pNBHL3A、 PNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A 及 pNBFL4A 分別具有 SEQ ID Ν0· 34、35、36、37、38、39 及 40 的 核苷酸序列。此外，如此制得的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白分別具有 SEQ ID N0. 47、48、49、50、51、52 及 53 的氨基酸序列。圖 2 顯示了質粒 pNBHLlA、pNBHL2A、 PNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A及pNBFL4A的結構，所述質粒表達編碼由多種接頭連 接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的基因。
[0101] 〈1_4>表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及L-天冬氨酸轉氨酶的質粒的制備
[0102] 通過將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板的PCR，獲得了編碼磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶進行編碼的基因 ppc。基于從美國國立衛(wèi)生研究院的基因庫（NIH GenBank)獲得 的SEQIDN0.29的ppc基因的堿基序列（NCBI登記號"GI:89110074"），可以對ppc基因 的含有啟動子至終止子的部分進行擴增，并合成具有限制性內切酶Hindlll和BamHI的識 別位點的SEQ ID N0. 17和18的引物。
[0103] 將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板，使用SEQ ID N0. 17和18的寡核苷酸 作為引物，實施PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30 次循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸4分鐘。 由此，獲得了含有ppc基因和限制性內切酶Hindlll和BamHI的識別位點的約3. lkb擴增 的基因。
[0104] 用限制性內切酶Hindlll和BamHI對通過上述PCR獲得的ppc基因進行處理，然 后通過連接在用限制性內切酶Hindlll和BamHI處理過的pCL1920 (AB236930)載體上將其 克隆，最終制得克隆有ppc基因的pCP重組載體。
[0105] 為了在克隆有ppc基因的pCP重組載體上克隆aspC基因，通過將大腸桿菌W3110 的染色體DNA作為模板的PCR，獲得了編碼L-天冬氨酸轉氨酶的基因 aspC?；趶拿绹鴩?立衛(wèi)生研究院的基因庫（NIH GenBank)獲得的SEQ ID N0. 30的aspC基因的堿基序列（NCBI 登記號"GI = 89107778"），可以對aspC基因的含有啟動子至終止子的部分進行擴增，并合成 了具有限制性內切酶BamHI和ΚρηΙ的識別位點的SEQ ID N0. 19和20的引物。
[0106] 將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板，使用SEQ ID N0. 19和20的寡核苷酸 作為引物，實施PCR。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30 次循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性30秒、50°C下退火30秒及72°C下延伸2分鐘。 由此，獲得了含有aspC基因和限制性內切酶BamHI和ΚρηΙ的識別位點的約1. 5kb擴增的 基因。
[0107] 對通過上述PCR獲得的aspC基因用限制性內切酶BamHI和ΚρηΙ進行處理，然后通 過連接在用限制性內切酶BamHI和ΚρηΙ處理過的pCP載體上而被克隆，最終制得同時克隆 有aspC基因和ppc基因的pCPA重組載體。制得的pCPA載體具有SEQ ID N0. 41的序列。 圖3顯示了質粒pCPA的結構，所述質粒pCPA表達編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L-天冬 氨酸轉氨酶的基因。
[0108] 〈1-5>喹啉酸磷酸核糖基轉移酶缺陷株的制備
[0109] 在本實施例中，通過將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板的PCR，獲得了喹 啉酸分解途徑中的nadC基因?；趶拿绹鴩⑿l(wèi)生研究院的基因庫（NIH GenBank)獲 得的nadC基因的堿基序列（NCBI登記號"GI: 89106990 "），合成了可對nadC基因的下游 (downstream)部分進行擴增的SEQ ID N0. 21和22的引物、對nadC的上游和下游部分及 loxpCm進行擴增的SEQ ID N0. 23和24的引物、對上游部分進行擴增的SEQ ID N0. 25和 26的引物。
[0110] 通過實施將大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板，使用SEQID N0. 21、22和25、 26的寡核苷酸作為引物的PCR，分別擴增了 0. 5kb和0. 3kb的nadC基因的上游部分和下 游部分。此外，通過實施將含有l(wèi)oxpCm的質粒載體pL〇XpCat2載體作為模板，使用SEQ ID NO. 23和24的寡核苷酸作為引物的PCR，擴增了 1. Okb的兩端具有nadC基因同源序列的 loxpCm基因。使用PfuUltra? DNA聚合酶（Stratagene)作為聚合酶，通過重復30次循環(huán) 進行PCR，每個循環(huán)包括96 °C下變性30秒、53 °C下退火30秒及72 °C下延伸1分鐘。之后， 將通過上述的PCR反應獲得的nadC-上游片段、nadC-下游片段、loxpCm片段作為模板，實 施PCR，通過重復10次循環(huán)進行PCR，每個循環(huán)包括96°C下變性60秒、50°C下退火60秒及 72°C下延伸1分鐘，及在添加 SEQ ID N0. 21和26的引物后，實施20次循環(huán)。由此，獲得了 1. 8kb的含有nadC基因上游區(qū)-loxpCm-nadC基因下游區(qū)的nadC缺陷盒。
[0111] 通過電穿孔將制得的nadc缺陷盒轉化到含有PKD46作為λ Red重組酶（lambda red recombinase)表達載體的大腸桿菌W3110中，將其涂抹到含有氯霉素作為選擇標記的 LB(Luria-Bertani)平板培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g及瓊脂1. 5% / L)上，在37°C下過夜培養(yǎng)后，篩選耐氯霉素的菌株。
[0112] 將篩選出的菌株直接作為模板，使用SEQ ID N0. 21和26的引物，在相同條件下實 施卩〇?后，通過在1.0%瓊脂糖凝膠上，確認基因大小在野生株的情況下為1.01^，在1^(1〇 缺陷株的情況下為1.8kb，從而確定nadc基因的缺失。此外，通過與上述方法相同的方法， 使作為野生型大腸桿菌的菌株W3110的nadC基因缺失。
[0113] 實施例2.表達融合蛋白的菌株的制備及評價
[0114] 〈2_1>表汰融合蛋白的菌株的制各
[0115] 將質粒 pNBHLIA、pNBHL2A、pNBHL3A、pNBHL4A、pNBHL5A、pNBFL3A、pNBFL4A 及 pPro-NBA通過CaCl2法轉化到〈實施例1-5>中制備的W3110 Λ nadC菌株后，將菌株涂抹 在LB-Km平板培養(yǎng)基（酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、卡那霉素 25 μ g/L) 上，在37°C下過夜培養(yǎng)，所述質粒表達編碼由上述〈實施例1-3>中制得的多種接頭連接的 L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的單一融合蛋白的基因。之后，篩選耐卡那霉素的菌落。 由此，獲得了將L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶表達為單一融合蛋白的菌株。
[0116] 〈2_2>含有多種接頭的融合蛋白的由天冬氨酸至喹啉酸的產率的比較
[0117] 為了比較含有多種接頭的融合蛋白的由天冬氨酸至喹啉酸的生物合成能 力，將〈實施例2-1>中獲得的表達融合蛋白的菌株接種到于37 °C培養(yǎng)箱中的5ml的 LB-Km-IPTG (酵母提取物 10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨 10g/L、卡那霉素 25 μ g/L、IPTG 10mM)液體培養(yǎng)基中，并在37°C下以250rpm過夜培養(yǎng)后，得到發(fā)酵。將如此獲得的發(fā)酵液 以4000rpm離心10分鐘，得到僅有表達融合蛋白的菌株后，在500 μ 1的pH 7. Otris緩沖 液中再懸浮后，使用超聲裂解細胞法對細胞進行裂解。
[0118] 使用通過上述方法獲得的含有表達的融合蛋白的全細胞裂解液，通過酶促反應對 由L-天冬氨酸至喹啉酸的生物合成能力進行比較。表1顯示了用于比較由L-天冬氨酸至 喹啉酸的生物合成能力的酶促反應液的成分。
[0119] 表 1
[0120]

【權利要求】
1. 一種生產喹啉酸的重組微生物，其表達由接頭連接的L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸 合成酶的融合蛋白。
2. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶具 有分別由SEQ ID NO. 42和SEQ ID NO. 43表示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述接頭由5?30個氨基酸組成。
4. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述接頭具有LA(EAAAK)nAAA(n為1?5 的整數(shù)）或L(GGGS)nAAA(n為1?5的整數(shù)）的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述接頭具有選自SEQ ID NO. 54、55、56、 57、58、59和60的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述融合蛋白具有選自SEQ ID NO. 47、48、 49、50、51、52和53的氨基酸序列。
7. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中喹啉酸磷酸核糖基轉移酶的活性與天然微 生物中的內在活性相比被進一步弱化。
8. 根據(jù)權利要求7所述的重組微生物，其中所述喹啉酸磷酸核糖基轉移酶的活性通過 選自以下的方法減弱：1)編碼酶的基因的部分或全部缺失，2)對表達調控序列進行修飾以 減少所述基因的表達，3)對染色體上的所述基因序列進行修飾，以使所述蛋白質的活性減 弱，以及4)它們的組合。
9. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中選自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨 酸轉氨酶及所述融合蛋白中的一種或多種蛋白質的活性被進一步增強。
10. 根據(jù)權利要求9所述的重組微生物，其中所述蛋白質活性通過選自以下的方法增 強：1)增加編碼所述酶的基因的拷貝數(shù)，2)對表達調控序列進行修飾以增加所述基因的表 達，3)對染色體上的所述基因序列進行修飾，以增強所述酶的活性，以及4)它們的組合。
11. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物選自腸桿菌（Enterbacter sp.)、埃希氏菌（Escherichia sp.)、歐文氏菌（Erwinia sp.)、沙雷氏菌（Serratia sp·)、普羅威登斯菌（Providencia sp·)、棒狀桿菌（Corynebacterium sp.)及短桿菌 (Brevibacterium sp.)〇
12. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物為大腸桿菌（E. coli)。
13. 根據(jù)權利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物的識別登錄號為KCCM11235P 或 KCCM11236P。
14. 生產喹啉酸的方法，包括： (a) 在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物，所述重組微生物表達由接頭連接的L-天 冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白；以及 (b) 回收在所述培養(yǎng)過程中產生的喹啉酸。
【文檔編號】C12N1/21GK104160015SQ201380009522
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月3日 優(yōu)先權日:2012年1月6日
【發(fā)明者】申容旭, 金素影, 許仁庚, 金朱恩, 孫晟光, 李在熙, 李沚泫, 金昌謙 申請人:Cj第一制糖株式會社