用于診斷和治療癌癥的涉及ros1融合的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本文公開用于檢測(cè)受試者中癌癥的存在并且評(píng)估用于所述癌癥的治療的功效的方法和組合物。所公開的方法使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、原位雜交和/或多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)來檢測(cè)ROS1的點(diǎn)突變、截短或融合的存在。
【專利說明】用于診斷和治療癌癥的涉及R0S1融合的方法和組合物
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年2月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/596, 720的權(quán)益，所述臨 時(shí)申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。 技術(shù)背景
[0002] 最近已經(jīng)報(bào)道了 ROSl酪氨酸激酶的致癌融合發(fā)生在幾種人癌癥的亞群中，包括 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM)腦腫瘤以及膽管癌（膽道腫瘤）。表 達(dá)ROSl融合的癌細(xì)胞對(duì)與用于其增殖和存活的激酶的組成型活性嵌合形式相關(guān)的異常信 號(hào)傳導(dǎo)"成癮"。與這種對(duì)異常ROSl信號(hào)傳導(dǎo)的依賴性一致，臨床前研究已經(jīng)證實(shí)ROSl驅(qū) 動(dòng)的癌癥與突變體激酶的藥理學(xué)抑制劑非常敏感。小分子抑制劑目前正處于用于治療患有 ROSl驅(qū)動(dòng)的癌癥的患者的研制階段，但沒有商業(yè)診斷測(cè)試可供用于可靠地且有效地診斷 ROSl融合陽性癌癥。因此，需要的是滿足這種需求的ROSl融合診斷測(cè)試。
[0003] 簡(jiǎn)述
[0004] 本文所公開的方法和組合物涉及以下的領(lǐng)域：檢測(cè)或診斷疾病或病狀如癌癥；評(píng) 估與核酸變異、截短或基因融合相關(guān)的疾病或病狀的易感性或風(fēng)險(xiǎn)；監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展；以及 確定對(duì)治療性治療的易感性或抗性。一方面，本文所公開的檢測(cè)和診斷方法涉及檢測(cè)和/ 或診斷ROSl融合相關(guān)的癌癥。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)目的（如本文所體現(xiàn)和概括描述的），一方面，本發(fā)明涉 及通過檢測(cè)目標(biāo)核酸內(nèi)的核苷酸變異（如融合）來檢測(cè)ROSl相關(guān)癌癥的存在的方法，所述 方法包括對(duì)從來自患有癌癥的受試者的組織樣品提取的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)和或?qū)崟r(shí)RT-PCR，或?qū)淖曰加邪┌Y的受試者提取的RNA 合成的cDNA進(jìn)行PCR ;其中擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)于對(duì)照物的增加指示核苷酸變 異、截短或過度表達(dá)的存在，從而檢測(cè)癌癥的存在。
[0006] 另一方面，本文公開將患有癌癥的受試者診斷為患有ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述 方法進(jìn)一步包括確定野生型ROSl和野生型ROSl激酶的循環(huán)閾值（Ct)值；其中野生型ROSl 相對(duì)于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合的存在。
[0007] 另一方面，本文公開將患有癌癥的受試者診斷為患有ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述 方法包括與融合斷裂點(diǎn)的ROSl融合配偶體（partner)5'結(jié)合的正向引物和與融合斷裂點(diǎn) 的ROSl 3'結(jié)合的反向引物，其中所述引物延伸穿過融合，其中檢測(cè)到具有ROSl核酸和融 合配偶體核酸兩者的擴(kuò)增子的存在指示融合的存在。
[0008] 另一方面，本文公開將患有癌癥的受試者診斷為患有ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述 方法包括a)使用與ROSl融合配偶體結(jié)合的正向引物的第一擴(kuò)增反應(yīng)；其中來自所述第一 反應(yīng)的擴(kuò)增子用作第二擴(kuò)增反應(yīng)的模板；b)在所述第一反應(yīng)之后的第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中對(duì) 于融合斷裂點(diǎn)的ROSl序列3'具有特異性的引物用于第二擴(kuò)增反應(yīng)中；以及c)檢測(cè)來自所 述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中ROSl的存在；其中在來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl指 示ROSl融合的存在。
[0009] 另一方面，本文公開通過檢測(cè)目標(biāo)核酸內(nèi)的核苷酸變異（如融合）來檢測(cè)ROSl相 關(guān)癌癥的存在的方法，所述方法包括對(duì)來自患有癌癥的受試者的組織樣品進(jìn)行熒光原位雜 交（FISH)，其中用于雜交的探針位于ROSl融合的斷裂點(diǎn)的側(cè)面，其中所述探針被不同地標(biāo) 記，并且其中所述探針的分離指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。在基于FISH的檢測(cè)方法的情況 下，緊密放置的雜交探針指示野生型RTK，例如像ROSl。
[0010] 另一方面，本文公開用于診斷ROSl相關(guān)癌癥的試劑盒，所述試劑盒包括（a)用第 一檢測(cè)試劑標(biāo)記的第一引物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是與編碼 SEQ ID NO 1的氨基酸序列的第一多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸；以 及（b)至少一個(gè)第二引物，其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是與編碼野 生型ROSl的第二多核苷酸雜交的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。
[0011] 所公開方法和組合物的另外優(yōu)點(diǎn)將在以下描述中部分闡述，并且將從描述中部分 地理解，或可以通過實(shí)踐所公開的方法和組合物來習(xí)得。所公開方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)將借 助在所附權(quán)利要求書中特別指出的要素和組合來實(shí)現(xiàn)并且達(dá)成。應(yīng)了解上文一般描述與下 文詳細(xì)描述均僅僅是示例性和解釋性的，并且不限制所要求的本發(fā)明。
[0012] 附圖簡(jiǎn)述
[0013] 并入本說明書中并且構(gòu)成本說明書的一部分的【專利附圖】

【附圖說明】所公開方法和組合物的 一些實(shí)施方案，并且與描述一起用于闡釋所公開方法和組合物的原理。
[0014] 圖1示出在由于融合激酶的產(chǎn)生所致的腫瘤發(fā)生中涉及的受體酪氨酸激酶（RTK) 的示意性圖示。所述圖示出正常的跨膜RTK。在各RTK下方以紅色示出的蛋白質(zhì)與所述激 酶形成組成型活性致癌融合。
[0015] 圖2示出代表性ROSl融合激酶，CD74-R0S1融合激酶。（A)人CD74(5q32)和 R0SU6q22)基因的染色體位置。在NSCLC中，涉及染色體5和6的相互平衡的重排在兩種基 因內(nèi)在斷裂之后發(fā)生以便形成⑶74-R0S1融合。（B)正常⑶74和ROSl蛋白以及通過t (5; 6) (q32 ;q22)染色體重排產(chǎn)生的⑶74-R0S1融合蛋白的示意性圖示。
[0016] 圖3示出NSCLC中的ROSl融合。轉(zhuǎn)錄物的示意圖通過具有ROSl基因的染色體易 位產(chǎn)生。外顯子位置被指示來證實(shí)融合構(gòu)型的多樣性。
[0017] 圖4示出ROSl斷裂FISH測(cè)定。將位于ROSl基因內(nèi)的斷裂點(diǎn)位置（在所述位置 處發(fā)生染色體重排以產(chǎn)生人癌癥中的ROSl融合基因（上部示意圖））側(cè)面的基因組DNA克 隆用綠色或紅色熒光染料不同地標(biāo)記，然后與來自正常外周血淋巴細(xì)胞的間期細(xì)胞核和中 期染色體（左下圖）或SLC34A2-R0S1-陽性NSCLC細(xì)胞系（右下圖）雜交。
[0018] 圖5示出Insight ROSl Fusion Screen方法論。測(cè)定在高溫下使用融合特異性 反轉(zhuǎn)錄（FS-RT)以便防止反轉(zhuǎn)錄酶的混雜（promiscuity)以引發(fā)來自位于RNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的 莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的cDNA合成。通過在高溫下進(jìn)行測(cè)定，這些結(jié)構(gòu)在延長(zhǎng)過程期間被最小化并且 使第一鏈cDNA的產(chǎn)生僅限制于ROSl融合。然后使第一鏈反應(yīng)經(jīng)受RNA酶消化以便去除可 能允許在下游PCR檢測(cè)階段中非特異性擴(kuò)增的所有RNA。融合特異性cDNA然后用作通用下 游ROSl激酶定量PCR(qPCR)測(cè)定的模板。多重ROSl融合可通過在反轉(zhuǎn)錄階段過程中使多 個(gè)FS-RT引物多重反應(yīng)來靶向。這種FS-RT引物混合物可容易地進(jìn)行修飾以便捕獲新鑒別 的致癌融合，而無需增加用于監(jiān)測(cè)的引物的數(shù)目，從而維持反應(yīng)的特異性和高通量容量。
[0019] 圖 6 示出 Insight ROSlFusion Screen?。ROSl cDNA、癌癥相關(guān)的 ROSl 融合中斷 裂點(diǎn)的位置以及用于實(shí)時(shí)qPCR測(cè)定的PCR引物組的近似位置的示意性圖示。指示野生型 ROSl表達(dá)的正常水平、野生型ROSl過表達(dá)或ROSl融合的存在的Ct值在下部圖中示出。
[0020] 圖7示出Insight ROSl Screen? v2。R0S1RNA、癌癥相關(guān)的ROSl融合中斷裂點(diǎn)的 位置以及用于cDNA合成的引物的近似位置的示意性圖示。還針對(duì)反應(yīng)的cDNA合成后qPCR 檢測(cè)階段示出ROSl模板特異性激酶反應(yīng)的位置。藍(lán)色箭頭指示SLC34A2 cDNA引物的相對(duì) 位置并且紅色箭頭指示近似于實(shí)際ROSl易位的⑶74特異性cDNA引物的相對(duì)位置。
[0021] 詳述
[0022] 在公開并且描述本發(fā)明化合物、組合物、制品、裝置和/或方法之前，應(yīng)了解除非 另外規(guī)定，否則其不限于特定合成方法或特定重組生物技術(shù)方法，或除非另外規(guī)定，否則不 限于具體試劑，因?yàn)榇祟愴?xiàng)目當(dāng)然可變化。還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅出于描述具體實(shí)施 方案的目的并且不意圖具有限制性。
[0023] 除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式 "一個(gè)"、"一種"和"所述（the) "包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及"藥物載體"包括兩個(gè)或 更多個(gè)這類載體的混合物等。
[0024] 在本文中，范圍可表達(dá)為從"約"一個(gè)特定值和/或至"約"另一個(gè)特定值。當(dāng)表示 這類范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從所述一個(gè)特定值和/或到所述另一個(gè)特定值。類似地， 在通過使用先行詞"約"將值表示為近似值時(shí)，應(yīng)了解具體值形成另一個(gè)實(shí)施方案。應(yīng)進(jìn)一 步了解每個(gè)范圍的端點(diǎn)相對(duì)于另一個(gè)端點(diǎn)，并且與另一個(gè)端點(diǎn)無關(guān)地均為有效的。還應(yīng)理 解，本文公開了多個(gè)值，并且在本文中每個(gè)值除所述值本身之外也公開為"約"所述特定值。 例如，如果公開了值"10"，那么也公開了"約10"。還應(yīng)理解，當(dāng)一個(gè)值被公開時(shí)，那么還公 開了"小于或等于"所述值、"大于或等于所述值"和介于值之間的可能范圍，如本領(lǐng)域技術(shù) 人員所恰當(dāng)?shù)乩斫?。例如，如果公開了值"1〇"，那么還公開了 "小于或等于1〇"以及"大于 或等于10"。還應(yīng)了解在整個(gè)申請(qǐng)中，數(shù)據(jù)以多個(gè)不同格式來提供，并且此數(shù)據(jù)代表端點(diǎn)和 起始點(diǎn)，和數(shù)據(jù)點(diǎn)的任何組合的范圍。例如，如果公開具體數(shù)據(jù)點(diǎn)"10"和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)15,應(yīng) 了解認(rèn)為公開了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10與15之間。
[0025] 在本說明書和以下權(quán)利要求書中，提及多個(gè)術(shù)語，所述術(shù)語應(yīng)被定義為具有以下 含義：
[0026] "任選"或"任選地"意指隨后描述的事件或情況可發(fā)生或可未發(fā)生，并且描述包括 其中所述事件或情況發(fā)生的情況和其中它未發(fā)生的情況。
[0027] "增加"可以指相對(duì)于對(duì)照物產(chǎn)生更大量的組合物或化合物（如擴(kuò)增產(chǎn)物）的任何 變化。因此，例如，擴(kuò)增產(chǎn)物的量的增加可包括但不限于10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、或100%增加。本文進(jìn)一步考慮，檢測(cè)到0嫩、11^離或蛋白質(zhì)相對(duì)于對(duì)照 物的表達(dá)或豐度的增加必然包括在所述DNA、mRNA或蛋白質(zhì)不存在于對(duì)照物中的情況下檢 測(cè)到所述DNA、mRNA或蛋白質(zhì)的存在。
[0028] "獲得組織樣品（obtaining a tissue sample) " 或"獲得組織樣品（obtain a tissue sample)"意指從受試者收集組織樣品或測(cè)量受試者中的組織。應(yīng)了解并且本文考 慮組織樣品可通過本領(lǐng)域已知的任何手段包括創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性技術(shù)來獲得。還應(yīng)了解測(cè) 量方法可以是直接的或間接的。獲得或測(cè)量組織樣品的方法的實(shí)例可以包括但不限于，組 織活檢、組織灌洗、抽吸、組織拭子、脊椎穿刺、磁共振成像（MRI)、計(jì)算機(jī)斷層攝影（CT)掃 描、正電子發(fā)射斷層術(shù)（PET)掃描、以及X-射線（有或無造影劑）。
[0029] DNA中已知位點(diǎn)處的突變的靈敏檢測(cè)可用現(xiàn)有技術(shù)容易地進(jìn)行。等位基因特異 性引物可以被設(shè)計(jì)成靶向已知位置處的突變，以使得其信號(hào)可以優(yōu)先地在野生型DNA上擴(kuò) 增。不幸的是，這在可能在靶序列中的任何位置（堿基）處發(fā)生的未知突變的情況下是不 可能的。
[0030] 應(yīng)了解并且本文考慮，組織樣品可來自體內(nèi)的任何組織。因此，如本文所用，"組 織"是指血液、神經(jīng)組織（例如，腦組織或脊髓組織）、淋巴組織、肝組織、脾組織、肺組織、心 臟組織、胃組織、腸組織、胰組織、來自甲狀腺、唾液腺、關(guān)節(jié)以及皮膚的組織。應(yīng)了解，組織 樣品可僅包括來自靶組織的單個(gè)細(xì)胞或組分。例如，組織樣品可以是外周血單核細(xì)胞、B細(xì) 胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板或其它血細(xì)胞。類似地，細(xì)胞可以是上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、 神經(jīng)元細(xì)胞或其它細(xì)胞。
[0031] 檢測(cè)ROSl相關(guān)癌癥的方法
[0032] 所公開的方法一方面涉及以下的方法：檢測(cè)或診斷疾病或病狀如ROSl相關(guān)癌癥 (例如像，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或膽管癌）的存在，評(píng)估疾病或病狀如ROSl 相關(guān)癌癥（例如像，NSCLC、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或膽管癌）的易感性或風(fēng)險(xiǎn)，監(jiān)測(cè)疾病或病狀如 ROSl相關(guān)癌癥（例如像，NSCLC、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或膽管癌）的進(jìn)展，以及在之前被診斷為患 有癌癥的受試者中確定對(duì)于疾病或病狀如ROSl相關(guān)癌癥（例如像，NSCLC、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或 膽管癌）的治療性治療的易感性或抗性，所述方法包括獲得組織樣品，檢測(cè)來自受試者的 組織樣品的ROSlmRNA的存在或測(cè)量所述ROSlmRNA的表達(dá)水平；其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于 對(duì)照物的增加或僅檢測(cè)到擴(kuò)增子指示癌癥的存在，并且其中所述癌癥與ROSl的核酸變異、 截短或基因融合相關(guān)（即ROSl相關(guān)癌癥）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)或診斷疾病或病狀 如ROSl相關(guān)癌癥的存在可使用原位雜交來完成，其中在基因的斷裂點(diǎn)（即與癌癥中的另一 個(gè)基因融合的位點(diǎn)）側(cè)面的探針的分離指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。在另一實(shí)施方案中，
[0033] 原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前體（ROSl)
[0034] 受體酪氨酸激酶（RTK)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要調(diào)節(jié)因子，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增 殖、分化、遷移以及死亡而在正常發(fā)育中起關(guān)鍵作用。通過各種遺傳改變進(jìn)行的RTK信號(hào)傳 導(dǎo)的微擾可導(dǎo)致失調(diào)的激酶活性以及隨后的惡性轉(zhuǎn)化（圖1)。
[0035] 對(duì)所有58種已知的人RTK的激酶結(jié)構(gòu)域的種系發(fā)生關(guān)系分析證實(shí)ROSl是與間變 性淋巴瘤激酶/白細(xì)胞酪氨酸激酶（ALK/LTK)以及胰島素受體（INSR)家族遠(yuǎn)緣相關(guān)的不 同受體。ROSl是果蠅無七（sevenless)受體酪氨酸激酶（無七的受體，還稱為R0S)的孤 (即，對(duì)于其來說配體仍然有待確定）脊椎動(dòng)物對(duì)應(yīng)受體，其當(dāng)被其配體BOSS (無七的新娘 (bride of sevenless))激活時(shí)造成發(fā)育蠅復(fù)眼中的R7光受體的分化。在Rosi-null小鼠 中所觀察到的唯一異常涉及由于與支持精母細(xì)胞分化的附睪的上皮（其中表達(dá)R0S)的無 能相關(guān)的精子功能缺陷所致的雄性不育癥的情況下，哺乳動(dòng)物ROS的功能似乎在很大程度 上是非必要的。不同于白細(xì)胞酪氨酸激酶（LTK)，ROS是與ALK最高度相關(guān)的受體酪氨酸激 酶。
[0036] 最近，已經(jīng)描述了 ROSl的三種自然發(fā)生的致癌型式。在2003年，在人成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了關(guān)于染色體6q21的中間微缺失，其導(dǎo)致被稱為FIG(在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中 融合的）的新穎基因與編碼ROSl的細(xì)胞內(nèi)部分的序列之間的融合事件。FIG-ROSl在基因 工程化的成年小鼠的CNS中的實(shí)驗(yàn)增強(qiáng)的表達(dá)導(dǎo)致多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤的形成，從而 證實(shí)了這種融合激酶的致癌活性。描述成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腦腫瘤中的FIG-ROSl融合的準(zhǔn)確發(fā) 生率的詳細(xì)臨床研究尚有待報(bào)道。FIG-ROSl融合不僅僅局限于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；在2011年， 這種嵌合激酶被展示也在膽管癌（膽道癌）中表達(dá)，存在于8. 7% (23個(gè)中的2個(gè)）原發(fā)性 腫瘤樣本中。如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和NSCLC，患有膽管癌的患者的預(yù)后-其是第二最常見的原發(fā) 性肝癌-非常差，中位存活期小于兩年。
[0037] 在2007年，在NSCLC中首次報(bào)道兩種新穎的ROSl融合；染色體間易位被展示在 NSCLC細(xì)胞系和患者腫瘤兩者中均導(dǎo)致SLC34A2和⑶74基因與ROSl的細(xì)胞外近膜部分的 融合（作為實(shí)例，CD74-R0S1融合在圖2中示出）。在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膽管癌以及NSCLC中 FIG、CD74、SLC34A2、TPM3、SDC4、EZR、以及LRIG3的N-末端部分與ROSl激酶結(jié)構(gòu)域的融合 導(dǎo)致驅(qū)動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)的組成型激酶活性（圖3)。與這些ROSl融合作為致癌驅(qū)動(dòng)突變的作用 一致，SLC34A2-R0S1的siRNA介導(dǎo)的下調(diào)誘導(dǎo)人NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡。類似地，用ROSl 小分子抑制劑治療由FIG-ROSl表達(dá)在實(shí)驗(yàn)上致使腫瘤發(fā)生的細(xì)胞與穩(wěn)健腫瘤細(xì)胞殺死相 關(guān)。
[0038] 雖然不如NSCLC中的EGFR或ALK RTK突變那么常見，ROS融合是明顯復(fù)發(fā)的-在 最近的研究中，2. 6% (17/656)的NSCLC樣本展示通過免疫組織化學(xué)和FISH為ROSl融合 陽性的，并且從未在同一腫瘤中觀察到ALK和ROSl融合。此外，腫瘤樣本的幾個(gè)獨(dú)立分析 已經(jīng)揭示了 20%至30%的NSCLC中ROSl的顯著升高的表達(dá)，從而支持激酶在肺癌癥發(fā)病 機(jī)理中的更廣泛的作用。然而另外的惡性腫瘤可由異常ROSl信號(hào)傳導(dǎo)驅(qū)動(dòng)；例如在30% 至40%的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤外科腫瘤中發(fā)現(xiàn)了高水平的ROSl表達(dá)，并且已經(jīng)在結(jié)腸直腸和腎 癌細(xì)胞系中鑒別了 ROSl突變。用于檢測(cè)腫瘤中ROSl融合的存在的有效和可靠的診斷測(cè) 試的商業(yè)可用性將極大地促進(jìn)翻譯研究以便針對(duì)這些突變描述其它癌癥，同時(shí)還提供特定 癌癥的更有效和成本更低的診斷，并且使能夠使用這種突變體激酶的抑制劑實(shí)現(xiàn)患有ROSl 融合陽性腫瘤的患者的更有效和成本更低的個(gè)體化治療。
[0039] 因此，雖然已知的ROSl融合不代表這種酪氨酸激酶的最常見的突變，但它們?nèi)哉?酪氨酸激酶融合相關(guān)癌癥的相當(dāng)大的比例，其重要性隨著另外融合配偶體的鑒別而增加。 這類融合包括但不限于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（FIG)-ROSl、SLC34A2-R0S1、TPM3-R0S1、SDC4-R0S1、 EZR-R0S1、LRIG3-R0S1、以及CD74-R0S1中的融合。已經(jīng)在膽管癌、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC) 以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了所有三種融合。因此，一方面，本文公開以下的方法：檢測(cè)或診 斷疾病或病狀如ROSl相關(guān)癌癥；評(píng)估發(fā)展疾病或病狀如ROSl相關(guān)癌癥的易感性或風(fēng)險(xiǎn)； 監(jiān)測(cè)ROSl相關(guān)癌癥的疾病進(jìn)展；以及在患有癌癥的受試者中確定對(duì)于ROSl相關(guān)癌癥的治 療性治療的易感性或抗性，所述方法包括檢測(cè)來自受試者的組織樣品中ROSl擴(kuò)增子的存 在或測(cè)量所述ROSl擴(kuò)增子的量，其中核酸的存在或核酸相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相 關(guān)癌癥（如具有ROSl融合的癌癥）的存在。如本文所用，"R0S-1相關(guān)癌癥"是指其中ROSl 通過ROSl融合、過表達(dá)、突變或其它機(jī)制的存在而失調(diào)的任何癌癥。
[0040] 一方面，所公開的方法可通過定量PCR(qPCR)測(cè)定完成。因此，一方面，本文公開 檢測(cè)（即，診斷）患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)融合的存在，所述方法包括獲得組織樣品， 從所述樣品分離核酸，對(duì)從來自受試者的組織樣品分離的核酸進(jìn)行PCR，其中qPCR測(cè)定的 引物包含對(duì)ROSl激酶具有特異性的引物對(duì)和對(duì)融合斷裂點(diǎn)的wt R0S15'具有特異性的引 物對(duì)；并且其中確定循環(huán)閾值（Ct)值；并且其中野生型ROSl (例如，ROSl的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (ECD))相對(duì)于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合、并且因此ROSl相關(guān)癌癥的存在?；蛘?，本 文公開涉及qPCR的方法，所述方法不涉及測(cè)量Ct值，但包括與融合斷裂點(diǎn)的ROSl融合配 偶體5'結(jié)合的正向引物，與融合斷裂點(diǎn)的R0S13'結(jié)合的反向引物，其中所述引物延伸穿過 融合，其中檢測(cè)具有ROSl和融合配偶體核酸兩者的擴(kuò)增子的存在指示融合、并且因此ROSl 相關(guān)癌癥的存在。因此，所公開的方法可用于診斷ROSl相關(guān)癌癥。
[0041] 應(yīng)了解并且本文考慮，在從受試者去除組織樣品之后，可從所述組織的細(xì)胞分離 核酸（例如，DNA或RNA如mRNA)。因此，另一方面，所公開的方法包括獲得組織樣品并且 從所述組織樣品分離核酸。例如，所述方法可包括取得肺組織活檢或痰樣品并且從所述樣 品分離mRNA。應(yīng)進(jìn)一步了解在從所述組織樣品分離mRNA的情況下，可以從所述mRNA合成 cDNA并且對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR(例如，作為RT-PCR反應(yīng)的一部分）。因此，一方面，本文 公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組 織樣品，從所述組織樣品分離核酸（例如mRNA)，對(duì)所述核酸進(jìn)行RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、或?qū)崟r(shí) RT-PCR，以及檢測(cè)所述組織樣品中與野生型ROSl (例如像，ROSl的E⑶）和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域 中的一個(gè)或組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的量，其中所述PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、 或?qū)崟r(shí)RT-PCR反應(yīng)包括使用與野生型ROSl序列特異性雜交的正向和反向引物對(duì)（例如 像，與ROSl的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（ECD)如SEQ ID NO :13、14、20以及21雜交的引物），和/或 與野生型ROSl激酶結(jié)構(gòu)域序列（例如像，SEQ ID NO :4、5、7、8、15、16、17以及18)特異性 雜交的正向和反向引物對(duì)，以及檢測(cè)所述組織樣品中與野生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域兩 者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常對(duì)照 物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患有ROSl相關(guān)癌癥。還公開診斷患有癌癥的受 試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品 分離核酸，其中來自所述組織樣品的核酸為RNA，其中所述方法進(jìn)一步包括從所述RNA樣品 合成cDNA，對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR ;以及檢測(cè)所述組織樣品中與野生型ROSl (例如像，ROSl 的ECD)和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的 量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常對(duì)照物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患有ROSl相關(guān) 癌癥。還公開所公開的方法可進(jìn)一步包括確定循環(huán)閾值（Ct)值，其中野生型ROSl相對(duì)于 ROSl激酶的高（Ct)值指示融合、并且因此ROSl相關(guān)癌癥的存在；或?qū)U(kuò)增子與標(biāo)記的探 針相接觸以用于檢測(cè)和測(cè)量擴(kuò)增子的量，所述探針與所述擴(kuò)增子的序列互補(bǔ)。
[0042] 在另一種替代方法中，通過使用兩步檢測(cè)的qPCR方法來檢測(cè)ROSl融合，其中在第 一反應(yīng)中僅使用與ROSl融合配偶體結(jié)合的正向引物，并且其中在所述第一反應(yīng)之后的第 二反應(yīng)中，來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子用作第二擴(kuò)增、基于探針的檢測(cè)或測(cè)序反應(yīng)的模板， 其中所使用的探針或引物對(duì)融合斷裂點(diǎn)的ROSl 3'具有特異性，并且其中在來自所述第二 反應(yīng)的擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl指示融合。此外，公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥 的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，使用與ROSl 融合配偶體結(jié)合的正向引物進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)；其中來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子用作第二 擴(kuò)增反應(yīng)的模板；在所述第一反應(yīng)之后進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中對(duì)于融合斷裂點(diǎn)的ROSl序 列3'具有特異性的引物用于所述第二擴(kuò)增反應(yīng)中；以及c)檢測(cè)來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增 子中ROSl的存在；其中在來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl指示ROSl融合的存 在；以及檢測(cè)所述組織樣品中與ROSl激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)的核酸的存在，其中擴(kuò)增子的存在指 示所述受試者患有ROSl相關(guān)癌癥。如以上所描述的方法一樣，這種兩步檢測(cè)可進(jìn)一步包括 確定C(t)值或?qū)U(kuò)增子與標(biāo)記的探針相接觸，所述探針與所述擴(kuò)增子互補(bǔ)。
[0043] 應(yīng)了解并且本文考慮另外qPCR測(cè)定方法可用于得到相同信息。例如，一方面，本 文公開一種檢測(cè)ROSl相關(guān)融合的存在的等位基因特異性方法，所述方法包括對(duì)來自受試 者的組織樣品進(jìn)行qPCR，其中用于所述qPCR測(cè)定的引物包含對(duì)于ROSl激酶具有特異性的 反向引物和結(jié)合ROSl融合配偶體的融合斷裂點(diǎn)的5'的正向引物；并且其中跨所述融合斷 裂點(diǎn)讀取的擴(kuò)增子的存在指示融合的存在，并且因此指示ROSl相關(guān)癌癥。應(yīng)了解在這種方 法中，將存在從反向引物或正向引物得到的擴(kuò)增子，但因?yàn)檫@類擴(kuò)增將僅從單向引物產(chǎn)生， 所以信號(hào)將顯著小于來自融合事件的信號(hào)。此外，這類擴(kuò)增子的大小將不同于融合擴(kuò)增子 的大小，因?yàn)檎蛞飳H擴(kuò)增融合配偶體的剩余部分并且反向引物將僅擴(kuò)增所使用的反 向ROSl激酶引物的ROSl 5'的部分。
[0044] 另一方面，本文公開通過檢測(cè)目標(biāo)核酸內(nèi)的核苷酸變異（如融合）來檢測(cè)ROSl相 關(guān)癌癥的存在的方法，所述方法包括對(duì)來自患有癌癥的受試者的組織樣品進(jìn)行熒光原位雜 交（FISH)，其中用于雜交的探針位于ROSl融合的斷裂點(diǎn)的側(cè)面，其中所述探針被不同地標(biāo) 記，并且其中所述探針的分離指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。在基于FISH的檢測(cè)方法的情況 下，緊密放置的雜交探針指示野生型RTK，例如像ROSl。
[0045] ROSl融合與幾種已知的癌癥類型相關(guān)。應(yīng)了解一種或多種ROSl融合可與特定癌 癥相關(guān)。應(yīng)進(jìn)一步了解，存在與ROSl融合相關(guān)的幾種類型的癌癥，包括但不限于間變性大 細(xì)胞淋巴瘤（ALCL)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、膽管癌、非小細(xì) 胞肺癌（NSCLC)、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì) 胞瘤、炎性肌纖維母細(xì)胞瘤、惡性組織細(xì)胞增生癥以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。因此，一方面，本文公 開診斷R0S-1相關(guān)癌癥的方法，其中所述癌癥是NSCLC、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或膽管癌。還公開確 定對(duì)用針對(duì)R0S-1相關(guān)癌癥的ROSl抑制劑治療性治療的易感性或抗性的方法，其中所述癌 癥是NSCLC、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或膽管癌。一方面，受試者應(yīng)被理解為先前已被診斷患有癌癥，例 如像NSCLC、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或膽管癌。
[0046] 最近研究顯示，用小分子藥物候選物抑制受體酪氨酸激酶（RTK)的這些突變體形 式消除這種異常細(xì)胞增殖并且促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其它RTK驅(qū)動(dòng)的腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞 凋亡。這些發(fā)現(xiàn)突出了對(duì)于RTK突變的專門化的診斷測(cè)試的需要，所述測(cè)試為將具有多種 臨床應(yīng)用的測(cè)試。例如，這種測(cè)定可用于篩選受遺傳性成神經(jīng)細(xì)胞瘤影響的家庭中的兒童 以幫助促進(jìn)在早期階段檢測(cè)腫瘤，此時(shí)它們更易于進(jìn)行治療。RTK介導(dǎo)的癌癥的早期檢測(cè)和 診斷顯著增加患者群體內(nèi)的存活率。一方面，本文公開檢測(cè)或診斷疾病或病狀如癌癥（例 如ROSl相關(guān)癌癥）的存在的方法，所述方法包括檢測(cè)來自受試者的組織樣品的與野生型 ROSl核酸或其變異、截短或融合相關(guān)的DNA、cDNA或mRNA的存在或測(cè)量所述DNA、cDNA的 水平或mRNA的表達(dá)水平；其中ROSl激酶的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物增加而不存在野生 型ROSl的相應(yīng)增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0047] 因此，一方面，在無相應(yīng)ROSl野生型序列的情況下檢測(cè)到ROSl激酶序列或相對(duì) 于ROSl野生型序列的豐度指示ROSl融合序列的存在，并且因此癌癥的存在。因此，本文公 開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述受試者的組織樣品中 mRNA的存在或測(cè)量所述mRNA的表達(dá)水平；其中所述mRNA對(duì)于ROSl融合具有特異性；并且 其中mRNA的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0048] 應(yīng)了解并且本文考慮，所公開的診斷和確定對(duì)ROSl抑制劑治療的易感性或抗性 的方法不僅可以用于之前未被診斷患有癌癥的受試者以便鑒別所述受試者是否患有癌癥， 而且特異性地用于之前已被診斷患有癌癥的受試者，并且所述方法用于診斷所述癌癥是特 異性地ROsl相關(guān)的或?qū)χ委熞赘械暮鸵虼瞬挥糜谠\斷癌癥但用于確定受:試者中的已知癌 癥是否是ROSl相關(guān)的或?qū)τ肦OSl抑制劑治療易感的。
[0049] 還應(yīng)了解并且本文考慮，ROSl相關(guān)癌癥的原因可能不僅是由于野生型ROSl的失 調(diào)或已知的ROS1融合，而且由于一種或多種未鑒別的ROS1融合。僅能夠檢測(cè)已知融合的方 法將不能檢測(cè)之前未知的融合或ROSl的突變。通過不僅檢測(cè)ROSl的截短、核酸變異、ROSl 融合和/或野生型ROSl的存在，而且檢測(cè)ROSl激酶活性或ROSl激酶擴(kuò)增子的存在，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可確定所述癌癥是否是由于失調(diào)的野生型R0S1、已知的ROSl融合或之前未鑒 別的ROSl融合或ROSl的突變。因此，本文公開用于以下的方法：診斷ROSl相關(guān)癌癥，評(píng) 估癌癥的易感性或風(fēng)險(xiǎn)，或檢測(cè)ROSl的失調(diào)的存在和/或野生型ROSl的存在，并且進(jìn)一步 包括檢測(cè)ROSl激酶活性的存在。因此，例如，本文公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān) 癌癥的方法，所述方法包括檢測(cè)受試者中來自組織樣品的與ROSl融合、野生型ROSl和/或 ROSl激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)的核酸的存在。應(yīng)了解并且本文考慮，在本文所公開方法的一方面， 可以測(cè)試單獨(dú)野生型ROSl和ROSl激酶的存在或增加。在這種方面，野生型ROSl和ROSl 激酶的存在或其擴(kuò)增相對(duì)于對(duì)照物的增加可指示ROSl的失調(diào)，所述ROSl的失調(diào)可涉及在 不是由于融合事件的R0S-1相關(guān)癌癥中。相對(duì)于對(duì)照物無變化指示ROSl未涉及在癌癥中。 相比之下，僅ROSl激酶的存在或相對(duì)于對(duì)照物的擴(kuò)增指示ROSl融合。例如，在測(cè)量循環(huán)閾 值（Ct)值的測(cè)定中，應(yīng)了解循環(huán)閾值是基于內(nèi)部對(duì)照物的相對(duì)值并且高Ct指示低表達(dá)水 平。因此，應(yīng)了解，在野生型ROSl引物對(duì)和ROSl激酶引物對(duì)兩者的Ct值均相對(duì)于內(nèi)部對(duì) 照物較高并且未在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同于彼此的情況下，觀察到正常ROSl表達(dá)。在野生型和 ROSl激酶兩者Ct值均較低（即，表達(dá)水平較高），但激酶和野生型引物對(duì)之間不存在統(tǒng)計(jì) 學(xué)上顯著的差異的情況下，ROSl為過表達(dá)的。在其中ROSlCt值相對(duì)于ROSl激酶Ct值較 高（即，低表達(dá)）的測(cè)定中，存在ROSl融合。
[0050] 在診斷ROSl相關(guān)癌癥的替代方法中，所述方法可包括第一擴(kuò)增反應(yīng)，其中僅使用 與融合斷裂點(diǎn)的ROSl融合配偶體5'結(jié)合的正向引物產(chǎn)生擴(kuò)增子。所述擴(kuò)增子用作模板以 用于使用對(duì)于融合斷裂點(diǎn)的ROSl 3'具有特異性的引物或探針進(jìn)行測(cè)序、擴(kuò)增或基于探針 的檢測(cè)。擴(kuò)增子中ROSl的存在指示ROSl融合、并且因此ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0051] 因此，如以上所公開，本文公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法， 所述方法包括對(duì)來自所述受試者的核酸進(jìn)行第一基于PCR的反應(yīng)，并且對(duì)來自所述第一反 應(yīng)的擴(kuò)增子進(jìn)行第二基于PCR的反應(yīng)、測(cè)序反應(yīng)或基于探針的檢測(cè)，其中來自第一 PCR反應(yīng) 的引物是與融合斷裂點(diǎn)的ROSl融合配偶體5'結(jié)合的正向引物，其中所述第二PCR反應(yīng)或 檢測(cè)中使用的任何引物或探針對(duì)于融合斷裂點(diǎn)的3'中的ROSl (例如SEQ ID NO :4、5、7、8、 15、16、17以及18)具有特異性，并且其中來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子中ROSl的存在指示 ROSl融合并且因此ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0052] 另一方面，本文公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包 括對(duì)來自所述受試者的核酸進(jìn)行基于PCR的反應(yīng)，其中正向引物對(duì)ROSl融合配偶體具有特 異性并且結(jié)合融合斷裂點(diǎn)的5'，并且反向引物對(duì)ROSl具有特異性并且結(jié)合融合斷裂點(diǎn)的 3'，其中檢測(cè)到含有ROSl和ROSl融合配偶體的擴(kuò)增子指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0053] 或者，在FISH用作檢測(cè)測(cè)定的情況下，與位于ROSl的斷裂點(diǎn)側(cè)面的序列雜交的單 獨(dú)間隔的探針的存在指示融合事件并且因此癌癥的存在。
[0054] 應(yīng)了解并且本文考慮，一旦使用任何上述診斷方法檢測(cè)到ROSl相關(guān)癌癥或診斷 其存在，所述方法然后就可進(jìn)一步包括向患有ROSl相關(guān)癌癥的受試者施用ROSl抑制劑。
[0055] -方面，本文公開用于診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法 包括檢測(cè)ROSl激酶活性的存在。因此，例如，本文公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相 關(guān)癌癥的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，對(duì)所 述核酸進(jìn)行RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、或?qū)崟r(shí)RT-PCR，以及檢測(cè)所述組織樣品中與野生型ROSl和 ROSl激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的量，其中所述RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR反 應(yīng)包括使用與野生型ROSl序列（例如，SEQ ID NO :13、14、20以及21)特異性雜交的正向 和反向引物對(duì)以及與野生型ROSl激酶結(jié)構(gòu)域序列（例如，SEQ ID SO :4、5、7、8、15、16、17 以及18)特異性雜交的正向和反向引物對(duì)中的一種或其組合，以及檢測(cè)所述組織樣品中與 野生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸 的量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常對(duì)照物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患有ROSl相 關(guān)癌癥。不存在擴(kuò)增子或擴(kuò)增子水平等于正常對(duì)照物指示癌癥是ROSl相關(guān)癌癥。還公開 用于診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組 織樣品，從所述組織樣品分離核酸，其中來自所述組織樣品的核酸為RNA，其中所述方法進(jìn) 一步包括從所述RNA樣品合成cDNA，對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR ;以及檢測(cè)所述組織樣品中與野 生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的 量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常對(duì)照物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患有ROSl相關(guān) 癌癥。另一方面，所公開的方法可使用與具有實(shí)時(shí)RT-PCR的產(chǎn)物的序列（例如，SEQ DI NO: 6、8、19以及22)互補(bǔ)的探針，或所述方法可包括確定野生型ROSl和野生型ROSl激酶的循 環(huán)閾值（Ct)值；其中野生型ROSl相對(duì)于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合的存在。當(dāng)癌癥 被確定為ROSl相關(guān)癌癥時(shí)，還公開以下方法：所述方法進(jìn)一步包括向患有對(duì)ROSl抑制劑治 療易感的癌癥的受試者施用ROSl抑制劑。相反，在癌癥不是rOSl相關(guān)癌癥的情況下，所述 方法可進(jìn)一步包括使用不同于ROSl抑制劑的治療形式來治療患有所述癌癥的受試者。
[0056] 在用于診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的另一種替代方法中，通過使用 兩步檢測(cè)的qPCR方法來檢測(cè)ROSl融合，其中在第一反應(yīng)中僅使用與ROSl融合配偶體結(jié)合 的正向引物，并且其中在所述第一反應(yīng)之后的第二反應(yīng)中，來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子用 作第二擴(kuò)增、基于探針的檢測(cè)或測(cè)序反應(yīng)的模板，其中所使用的探針或引物對(duì)融合斷裂點(diǎn) 的ROSl 3'具有特異性，并且其中在來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl指示融合并 且因此指示ROSl相關(guān)癌癥。此外，公開用于診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方 法，所述方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，使用與ROSl融 合配偶體結(jié)合的正向引物進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)；其中來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子用作第二擴(kuò) 增反應(yīng)的模板；在所述第一反應(yīng)之后進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中對(duì)于融合斷裂點(diǎn)的ROSl序列 3'具有特異性的引物用于所述第二擴(kuò)增反應(yīng)中（例如，SEQ ID勵(lì)：4、5、7、8、15、16、17以及 18);以及檢測(cè)來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中ROSl的存在；其中在來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò) 增子中檢測(cè)到ROSl指示ROSl融合并且因此ROSl相關(guān)癌癥的存在。當(dāng)癌癥被確定為ROSl 相關(guān)癌癥時(shí)，還公開以下方法：所述方法進(jìn)一步包括向患有對(duì)ROSl抑制劑治療易感的癌癥 的受試者施用ROSl抑制劑。相反，在癌癥不是rOSl相關(guān)癌癥的情況下，所述方法可進(jìn)一步 包括使用不同于ROSl抑制劑的治療形式來治療患有所述癌癥的受試者。
[0057] 本文還公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括將細(xì)胞中的核酸 與和ROSl激酶雜交的第一探針和與ROSl的融合斷裂點(diǎn)的ROSl序列3'雜交的第二探針相 接觸；其中所述探針被不同地標(biāo)記；其中檢測(cè)到由分離的探針?biāo)甘镜钠茐牡幕蜃甘?ROSl融合的存在，所述ROSl融合的存在指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。一方面，本文公開探 針包含與具有實(shí)時(shí)RT-PCR的產(chǎn)物的序列互補(bǔ)的序列，并且其中所述探針在其一端上具有 報(bào)道基因染料并且在其另一端上具有淬滅染料。應(yīng)進(jìn)一步了解探針可選自表7中的任何探 針，包括但不限于SEQ ID NO :6、8、19以及22。
[0058] mRNA檢測(cè)和量化
[0059] 本文所公開的方法涉及檢測(cè)呈例如點(diǎn)突變和截短形式的核酸變異，或檢測(cè)ROSl 融合的表達(dá)、異常野生型ROSl表達(dá)、野生型ROSl表達(dá)或ROSl截短突變體的表達(dá)。對(duì)于這 些后面的表達(dá)水平檢測(cè)來說，所述方法包括檢測(cè)mRNA的豐度或存在或兩者。因此，本文公 開用于診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法和組合物，所述方法包括測(cè)量來自所述受試者 的組織樣品的mRNA的存在或水平；其中mRNA的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥 的存在。
[0060] 存在多種廣泛使用的工序用于檢測(cè)和確定總或聚（A) RNA樣品中特定mRNA的豐 度。例如，可使用以下來檢測(cè)特異性mRNA :Northern印跡分析、核酸酶保護(hù)測(cè)定（NPA)、原 位雜交（例如，熒光原位雜交）、實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)或反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)、以及 微陣列。
[0061] 這些技術(shù)中的每種可用于檢測(cè)特異性RNA并且精確地確定其表達(dá)水平。一般來 說，Northern分析是提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄物大小的信息的唯一方法，而NPA是同時(shí)檢查多個(gè)消息 的最容易的方式。原位雜交用于定位組織或細(xì)胞類型內(nèi)的特定基因的表達(dá)，并且RT-PCR是 用于檢測(cè)和定量基因表達(dá)的最靈敏的方法。
[0062] 實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR以及實(shí)時(shí)RT-PCR允許檢測(cè)任何基因的RNA轉(zhuǎn)錄物，不管起始材 料的稀缺性（scarcity)或特異性mRNA的相對(duì)豐度。在RT-PCR中，使用反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄 酶將RNA模板拷貝成互補(bǔ)DNA (cDNA)。然后使用DNA聚合酶通過PCR將cDNA成指數(shù)地?cái)U(kuò) 增。反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)可在同一或不同管中發(fā)生。RT-PCR在某種程度上容忍降解的RNA。 只要所述RNA在由引物跨越的區(qū)域內(nèi)是完整的，那么靶標(biāo)將進(jìn)行擴(kuò)增。
[0063] 相對(duì)定量RT-PCR涉及與目標(biāo)基因同時(shí)地?cái)U(kuò)增內(nèi)部對(duì)照物。內(nèi)部對(duì)照物用于標(biāo)準(zhǔn) 化樣品。一旦標(biāo)準(zhǔn)化，可以在樣品間進(jìn)行特異性mRNA的相對(duì)豐度的直接比較。選擇在所有 實(shí)驗(yàn)樣品間具有恒定表達(dá)水平的內(nèi)部對(duì)照物（即，不受實(shí)驗(yàn)治療的影響）是至關(guān)重要地。通 常使用的內(nèi)部對(duì)照物（例如，GAPDH、β-肌動(dòng)蛋白、親環(huán)蛋白（cyclophilin))經(jīng)常在表達(dá) 方面變化，并且因此可能不是適當(dāng)?shù)膬?nèi)部對(duì)照物。另外，最常見的內(nèi)部對(duì)照物以比所研究的 mRNA高得多的水平表達(dá)。為了使相對(duì)RT-PCR結(jié)果有意義，PCR反應(yīng)的所有產(chǎn)物必須在擴(kuò)增 的線性范圍中進(jìn)行分析。這對(duì)于具有廣泛不同的豐度水平的轉(zhuǎn)錄物來說變得困難。
[0064] 競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR用于絕對(duì)定量。這種技術(shù)涉及設(shè)計(jì)、合成并且精確地定量競(jìng)爭(zhēng)者 RNA，所述競(jìng)爭(zhēng)者RNA可在大小或序列方面與內(nèi)源性靶存在較小差異。將已知量的競(jìng)爭(zhēng)者 RNA添加至實(shí)驗(yàn)樣品并且進(jìn)行RT-PCR。將來自內(nèi)源性靶的信號(hào)與來自所述競(jìng)爭(zhēng)者的信號(hào)進(jìn) 行比較以確定樣品中所存在的靶的量。
[0065] 一方面，本文公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括對(duì)來自所述 受試者的組織樣品的核酸（例如像mRNA或DNA)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或其它PCR反應(yīng)； 其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的反向引物和至 少一個(gè)正向引物；并且其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。 本文還公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括對(duì)來自所述受試者的組織 樣品進(jìn)行FISH ;其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括能夠在ROSl融合斷裂點(diǎn)的單獨(dú)側(cè)上與一個(gè) 或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的探針；并且其中由分離的探針指示的破壞的基因座指示 ROSl相關(guān)癌癥的存在。用于在這一測(cè)定中使用的探針的實(shí)例包括表7中所發(fā)現(xiàn)的那些。 [0066] 因?yàn)樗_的方法可以用于檢測(cè)野生型R0S1、ROSl融合以及ROSl激酶結(jié)構(gòu)域活 性，所以本文還公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥或檢測(cè)受試者中ROSl激酶失調(diào)的方法，所 述方法包括對(duì)來自所述受試者的組織樣品的mRNA進(jìn)行第一 RT-PCR反應(yīng)；其中所述反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)包括能夠與ROSl激酶序列（例如像SEQ ID NO :4、5、7、8、15、16、 17以及18)特異性地雜交的一個(gè)引物對(duì)，和能夠與任何融合斷裂點(diǎn)的ROSl 5'（即，外部野 生型ROSl位點(diǎn)，例如像SEQ ID NO :13、14、20以及21)特異性地雜交的至少一個(gè)引物對(duì)，以 及確定來自各引物對(duì)的擴(kuò)增子的循環(huán)閾值；并且其中野生型引物對(duì)擴(kuò)增子的循環(huán)閾值高于 ROSl激酶的循環(huán)閾值統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量，這指示融合或突變的ROSl的存在。還公開診斷受 試者中ROSl相關(guān)癌癥或檢測(cè)受試者中ROSl激酶失調(diào)的方法，所述方法包括對(duì)來自所述受 試者的組織樣品的mRNA進(jìn)行第一 RT-PCR反應(yīng)；其中所述反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR) 包括能夠與任何融合斷裂點(diǎn)的ROSl融合配偶體5'特異性地雜交并且僅在正向方向上擴(kuò)增 的一個(gè)引物對(duì)；其中所述方法進(jìn)一步包括使用與融合斷裂點(diǎn)的ROSl序列3'特異性地雜交 的一個(gè)或多個(gè)引物來檢測(cè)來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子的存在或擴(kuò)增所述擴(kuò)增子，其中來自 所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子中ROSl序列的存在指示ROSl融合的存在。
[0067] Northern分析是用于確定轉(zhuǎn)錄物大小并且用于鑒別選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄物和多基 因家族成員的最簡(jiǎn)單的方法。它還可用于在印跡上的所有樣品之間直接地比較給定消息的 相對(duì)豐度。Northern印跡工序是直接的并且提供評(píng)價(jià)各點(diǎn)處的進(jìn)展（例如，RNA樣品的完 整性和它轉(zhuǎn)移到膜的有效程度）的機(jī)會(huì)。RNA樣品首先在變性條件下在瓊脂糖凝膠中經(jīng)由 電泳通過大小分離。所述RNA然后轉(zhuǎn)移至膜、交聯(lián)并且與標(biāo)記的探針雜交。非同位素或高比 活性放射性標(biāo)記的探針可以用于，包括隨機(jī)引發(fā)的、切口-移位的或PCR產(chǎn)生的DNA探針、 體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針以及寡核苷酸。另外，僅具有部分同源性的序列（例如，來自不同物種 的cDNA或可能包含外顯子的基因組DNA片段）可以用作探針。
[0068] 核酸酶保護(hù)測(cè)定（NPA)(包括核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定和Sl核酸酶測(cè)定）是用于檢測(cè) 和定量特異性mRNA的靈敏方法。NPA的基礎(chǔ)是反義探針（放射性標(biāo)記的或非同位素）與 RNA樣品的溶液雜交。在雜交后，單鏈、未雜交的探針和RNA被核酸酶降解。剩余受保護(hù)的 片段在丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離。溶液雜交通常比基于膜的雜交更有效，并且與印跡雜交 的20至30 μ g最大量相比，其可容納高達(dá)100 μ g的樣品RNA。NPA對(duì)RNA樣品降解的敏感 性也比Northern分析低，因?yàn)閮H在與探針重疊的區(qū)域中檢測(cè)到裂解（探針的長(zhǎng)度通常為約 100至400個(gè)堿基）。
[0069] NPA是用于同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)RNA物種的選擇的方法。在溶液雜交和隨后分析過程中， 單獨(dú)的探針/靶相互作用是完全彼此獨(dú)立的。因此，可同時(shí)測(cè)定幾個(gè)RNA靶和適當(dāng)?shù)膶?duì)照 物（已經(jīng)在同一反應(yīng)中使用了多達(dá)十二個(gè)），其條件是各個(gè)探針具有不同的長(zhǎng)度。NPA還通 常用于精確地繪制mRNA末端和內(nèi)含子/外顯子接點(diǎn)。
[0070] 原位雜交（ISH)是用于定位細(xì)胞或組織中的特異性mRNA的強(qiáng)大且通用的工具。 與Northern分析和核酸酶保護(hù)測(cè)定不同，ISH不需要RNA的分離或電泳分離。探針的雜交 發(fā)生在細(xì)胞或組織內(nèi)。由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)在整個(gè)工序中得以維持，ISH提供關(guān)于組織樣品內(nèi)的 mRNA的位置的信息。ISH可與熒光標(biāo)記物組合以達(dá)成熒光原位雜交（FISH)。
[0071] 工序開始于將樣品固定在中性緩沖福爾馬林中，并且將組織包埋在石蠟中。然后 將樣品切成薄切片并且安裝到顯微鏡載玻片上。（或者，組織可進(jìn)行冰凍切片并且后固定在 多聚甲醛中。）在一系列洗滌以脫蠟和再水化切片之后，進(jìn)行蛋白酶K消化以增加探針可接 近性，并且然后將標(biāo)記的探針與樣品切片進(jìn)行雜交。放射性標(biāo)記的探針可使用干燥到載玻 片上的液膜進(jìn)行可視化，而非同位素標(biāo)記的探針可用比色或熒光試劑方便地檢測(cè)。
[0072] DNA檢測(cè)和量化
[0073] 本文所公開的方法涉及檢測(cè)呈例如點(diǎn)突變和截短形式的核酸變異，或檢測(cè)ROSl 融合的表達(dá)、異常野生型ROSl表達(dá)或ROSl截短突變體的表達(dá)。對(duì)于這些后面的表達(dá)水平檢 測(cè)來說，所述方法包括檢測(cè)mRNA的豐度或存在或兩者?；蛘撸瑱z測(cè)可涉及DNA (例如cDNA) 的豐度或存在。因此，本文公開用于診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法和組合物，所述方 法包括測(cè)量來自所述受試者的組織樣品的DNA的存在或水平；其中DNA的量相對(duì)于對(duì)照物 的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0074] 存在多種廣泛使用的工序用于檢測(cè)和確定樣品中特定DNA的豐度。例如，PCR技 術(shù)允許擴(kuò)增并且隨后檢測(cè)靶核酸的微量。PCR的細(xì)節(jié)在本領(lǐng)域，包括例如Mullis等人的美 國(guó)專利號(hào)4, 683, 195、Mullis的4, 683, 202以及Mullis等人的4, 965, 188中進(jìn)行了良好描 述。通常，將寡核苷酸引物退火至靶核酸的變性鏈，并且引物延伸產(chǎn)物通過聚合酶聚合脫氧 核苷三磷酸形成。典型的PCR方法涉及模板核酸變性、引物退火以及退火引物的通過熱穩(wěn) 定聚合酶的作用的延伸的重復(fù)循環(huán)。所述過程產(chǎn)生靶核酸的指數(shù)擴(kuò)增，并且因此允許檢測(cè) 樣品中以極低濃度存在的靶。應(yīng)理解并且本文考慮存在也可用于所公開方法中的本領(lǐng)域已 知的變化形式的PCR方法，例如，定量PCR(QPCR);微陣列；實(shí)時(shí)PCT ;熱啟動(dòng)PCR ;巢式PCR ; 等位基因特異性PCR ;以及降落（Touchdown) PCR。
[0075] 微陣列
[0076] 陣列是樣品的有序排列，從而提供用于基于堿基配對(duì)規(guī)則來匹配已知和未知的 DNA樣品并且自動(dòng)進(jìn)行鑒別未知的過程的培養(yǎng)基。陣列實(shí)驗(yàn)可利用常見測(cè)定系統(tǒng)，如微量 培養(yǎng)板或標(biāo)準(zhǔn)印跡膜，并且可手工或利用機(jī)器人技術(shù)來沉積樣品而建立。一般來說，陣列被 描述為宏陣列（macroarray)或微陣列，區(qū)別在于樣品斑點(diǎn)的大小。宏陣列包含約300微米 或更大的樣品斑點(diǎn)大小，并且可容易地通過現(xiàn)有凝膠和印跡掃描器成像。微陣列中的樣品 斑點(diǎn)大小可以是300微米或更小，但直徑通常小于200微米，并且這些陣列通常包含數(shù)千個(gè) 斑點(diǎn)。微陣列需要通常不是作為完整系統(tǒng)可商購(gòu)的專門化的機(jī)器人技術(shù)和/或成像設(shè)備。 已經(jīng)在文獻(xiàn)中用于描述這種技術(shù)的術(shù)語包括但不限于：生物芯片、DNA芯片、DNA微陣列、 GENECHIP? (Affymetrix，Inc.其是指其高密度、基于寡核苷酸的DNA陣列）以及基 因陣列。
[0077] DNA微陣列或DNA芯片通過高速機(jī)器人技術(shù)、通常在玻璃或尼龍底物上來制作，具 有已知身份的探針被用于所述微陣列以便確定互補(bǔ)結(jié)合，從而允許大規(guī)模平行基因表達(dá)和 基因發(fā)現(xiàn)研究。使用單個(gè)DNA芯片的實(shí)驗(yàn)可同時(shí)提供關(guān)于數(shù)千個(gè)基因的信息。本文考慮所 公開的微陣列可用于監(jiān)測(cè)基因表達(dá)、疾病診斷、基因發(fā)現(xiàn)、藥物發(fā)現(xiàn)（藥物基因組學(xué)）以及 毒理學(xué)研究或毒理基因組學(xué)。
[0078] 就具有已知身份的排列的DNA序列的特性而言，存在DNA微陣列技術(shù)的兩種變化 形式。I型微陣列包含探針cDNA (500至5, 000個(gè)堿基長(zhǎng)），所述探針cDNA使用機(jī)器人點(diǎn)樣 固定至固體表面（如玻璃）并且暴露于一組單獨(dú)地或呈混合物的靶標(biāo)。所述方法傳統(tǒng)上被 稱為DNA微陣列。使用I型微陣列，定位的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列的多個(gè)拷貝、優(yōu)選單個(gè) 多核苷酸序列的拷貝被固定在底物表面的多個(gè)限定區(qū)域上。多核苷酸是指5至10, 000個(gè) 核苷酸范圍的核苷酸鏈。這些固定的多核苷酸序列的拷貝適用于用作雜交實(shí)驗(yàn)中的探針。
[0079] 為了制備用固定的探針涂覆的珠粒，將珠粒浸入含有所需探針序列的溶液，并且 然后通過共價(jià)或非共價(jià)方式固定在珠粒上?；蛘?，當(dāng)探針被固定在棒上時(shí)，給定探針可被點(diǎn) 樣在所述棒的限定區(qū)域處。典型的分配器包括用控制微量移液管相對(duì)于底物的位置的機(jī)器 人系統(tǒng)將溶液遞送至底物的微量移液管?？纱嬖诙鄠€(gè)分配器，以使得試劑可被同時(shí)遞送至 反應(yīng)區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，微陣列是基于壓電效應(yīng)通過使用油墨噴射技術(shù)形成，由此含有 目標(biāo)液體如寡核苷酸合成試劑的窄管被適配器環(huán)繞。通過適配器發(fā)送的電荷使所述適配器 以不同于管的速率膨脹并且迫使一小滴液體到底物上。
[0080] 樣品可以是含有目標(biāo)多核苷酸（多核苷酸靶標(biāo)）的任何樣品并且從任何體液（血 液、尿、唾液、痰、胃液等）、培養(yǎng)細(xì)胞、活組織檢查或其它組織制備物獲得。DNA或RNA可以 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法中的任何一種從樣品分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，總RNA 是使用 TRIzol 總 RNA 分離試劑（Life Technologies，Inc.，Rockville，Md.)進(jìn)行分離并 且RNA是使用寡d(T)柱色譜法或玻璃珠粒進(jìn)行分離。在雜交和加工之后，所獲得的雜交信 號(hào)應(yīng)準(zhǔn)確地反映添加至樣品的對(duì)照靶多核苷酸的量。
[0081] 底物上的多個(gè)限定區(qū)域可以各種格式布置。例如，所述區(qū)域可垂直或平行于腸衣 的長(zhǎng)度布置。此外，靶標(biāo)不必與底物直接結(jié)合，而是可通過連接基團(tuán)與底物結(jié)合。連接基團(tuán) 通常可從約6至50個(gè)原子長(zhǎng)變化。連接基團(tuán)包括乙二醇低聚物、二胺、二酸和類似物。底 物表面上的反應(yīng)性基團(tuán)與接頭的一個(gè)末端部分反應(yīng)以便使接頭與底物結(jié)合。所述接頭的另 一末端部分然后進(jìn)行官能化以用于結(jié)合探針。
[0082] 樣品多核苷酸可用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記部分進(jìn)行標(biāo)記以便允許檢測(cè)雜交的探針/靶 多核苷酸復(fù)合物。標(biāo)記部分可包括能夠通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、生物電子、免疫化學(xué)、 電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)的組合物。標(biāo)記部分包括放射性同位素（如32P、33P或35S)、化 學(xué)發(fā)光化合物、標(biāo)記的結(jié)合蛋白、重金屬原子、光譜標(biāo)記物（如熒光標(biāo)記物和染料）、磁性標(biāo) 記、連接酶、質(zhì)譜標(biāo)簽、自旋標(biāo)記、電子轉(zhuǎn)移供體和受體、生物素等。
[0083] 標(biāo)記可在擴(kuò)增反應(yīng)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程中進(jìn)行?；蛘撸?標(biāo)記部分可在雜交一旦形成探針-靶標(biāo)復(fù)合物之后摻入。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物素如以 上所描述在擴(kuò)增步驟過程中首先引入。在雜交反應(yīng)后，未結(jié)合的核酸被沖洗掉以使得僅仍 與底物結(jié)合的生物素附接至與多核苷酸探針雜交的靶多核苷酸。然后，添加以高親和力結(jié) 合生物素的抗生物素蛋白綴合的熒光團(tuán)，如抗生物素蛋白-藻紅蛋白。
[0084] 雜交引起多核苷酸探針和互補(bǔ)靶標(biāo)通過堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈體。雜交方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。用于雜交的嚴(yán)格條件可通過鹽濃度、溫度以及其它化學(xué)品和條件 定義。如雜交時(shí)間、洗滌劑（十二烷基硫酸鈉，SDS)或溶劑（甲酰胺）的濃度以及包含或 不包含載體DNA的各種其它參數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些條件的另外變化對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
[0085] 用于檢測(cè)復(fù)合物形成的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，將多 核苷酸探針用熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記并且復(fù)合物形成的水平和模式的測(cè)量是通過熒光顯微術(shù)、 優(yōu)選共焦熒光顯微術(shù)來完成。氬離子激光器激發(fā)所述熒光標(biāo)記，將發(fā)射引導(dǎo)至光電倍增管 并且檢測(cè)和定量所發(fā)射的光的量。檢測(cè)信號(hào)應(yīng)在微陣列的每個(gè)位置處與探針/靶多核苷酸 復(fù)合物的量成比例。熒光顯微鏡可與計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的掃描器裝置相關(guān)聯(lián)以便產(chǎn)生雜交強(qiáng)度的 定量二維圖像。檢查掃描的圖像以便確定每個(gè)雜交的靶多核苷酸的豐度/表達(dá)水平。
[0086] 在差示雜交實(shí)驗(yàn)中，將來自兩個(gè)或更多個(gè)不同生物樣品的多核苷酸靶標(biāo)用兩種或 更多種具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的不同熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。分別用不同的光電倍增管設(shè)置檢測(cè)熒 光信號(hào)以便檢測(cè)特定波長(zhǎng)。獲得兩個(gè)或更多個(gè)樣品中靶多核苷酸的相對(duì)豐度/表達(dá)水平。 通常，微陣列熒光強(qiáng)度可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以便在類似測(cè)試條件下使用多于一個(gè)微陣列時(shí)將雜交 強(qiáng)度的變化考慮在內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將單獨(dú)多核苷酸探針/靶復(fù)合物雜交強(qiáng)度使用 源自每個(gè)微陣列上所包含的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照物的強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0087] II型微陣列包含原位（芯片上）或通過常規(guī)合成接著芯片上固定來合成的寡核苷 酸（20至80鏈節(jié)寡核苷酸）或肽核酸（PNA)探針的陣列。將陣列暴露于標(biāo)記的樣品DNA，雜 交并且確定互補(bǔ)序列的身份/豐度。"歷史上"稱為DNA芯片的這種方法是在Affymetrix， Inc.開發(fā)的，所述公司以GENECHIP?商標(biāo)出售其光刻制作的產(chǎn)品。
[0088] 使用II型陣列用于基因表達(dá)背后的基本概念很簡(jiǎn)單：將源自實(shí)驗(yàn)樣品的mRNA的 標(biāo)記的cDNA或cRNA祀標(biāo)與附接至固相支持體的核酸探針雜交。通過監(jiān)測(cè)與每個(gè)DNA位置 相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記的量，有可能推斷所表示的每個(gè)mRNA樣本的豐度。雖然雜交已經(jīng)使用了數(shù)十 年來檢測(cè)和定量核酸，但本技術(shù)的小型化與大且增長(zhǎng)量的序列信息的組合已經(jīng)極大地?cái)U(kuò)展 了可以研究基因表達(dá)的規(guī)模。
[0089] 微陣列制造可開始于5平方英寸的石英晶片。最初洗滌石英以確?？缙浔砻娴木?勻羥基化。因?yàn)槭⑹亲匀涣u基化的，所以它提供用于化學(xué)品（如接頭分子）附接的優(yōu)異 底物，所述化學(xué)品隨后用于定位陣列上的探針。
[0090] 將晶片放置在硅烷浴中，所述硅烷與石英的羥基反應(yīng)并且形成共價(jià)連接分子的基 質(zhì)。這些硅烷分子之間的距離決定探針的填充密度，從而允許陣列在僅1. 28平方厘米內(nèi)保 持超過500, 000個(gè)探針位置或者特征。這些特征中的每個(gè)均含有數(shù)百萬個(gè)相同的DNA分子。 硅烷薄膜提供均勻的羥基密度以便啟動(dòng)探針組裝。附接至硅烷基質(zhì)的接頭分子提供可在空 間上被光激活的表面。
[0091] 探針合成并行發(fā)生，從而導(dǎo)致A、C、T或G核苷酸同時(shí)添加至多個(gè)生長(zhǎng)鏈。為了定 義哪些寡核苷酸鏈將在每個(gè)步驟中接收核苷酸，將攜帶對(duì)應(yīng)于單獨(dú)特征的尺寸的18至20 平方微米窗口的光刻掩模放置在涂覆的晶片上。所述窗口基于每個(gè)探針的所需序列分布在 掩模上。當(dāng)紫外光在第一合成步驟中照射在掩模上時(shí)，暴露的接頭變成脫保護(hù)的并且可供 用于核苷酸偶聯(lián)。
[0092] -旦所需特征已被激活，含有單一類型的具有可去除的保護(hù)基團(tuán)的脫氧核苷酸的 溶液在晶片的表面上進(jìn)行沖洗。核苷酸附接至激活的接頭，從而啟動(dòng)合成過程。
[0093] 雖然寡核苷酸的序列中的每個(gè)位置可以由4個(gè)核苷酸中的1個(gè)占據(jù)，從而導(dǎo)致每 個(gè)晶片25X4或100個(gè)不同的掩模的表觀需要，但合成過程可被設(shè)計(jì)成顯著減少這種要求。 幫助最小化掩模使用的算法計(jì)算如何在同一掩模可多次使用時(shí)通過調(diào)節(jié)單獨(dú)探針的合成 速率和識(shí)別情況來最佳地協(xié)調(diào)探針生長(zhǎng)。
[0094] 選擇和設(shè)計(jì)的一些關(guān)鍵要素對(duì)于所有微陣列的產(chǎn)生來說是共用的，而不管其意圖 應(yīng)用。例如，用于優(yōu)化探針雜交的策略總是包括在探針選擇的方法中。在特定pH、鹽以及溫 度條件下的雜交可通過將解鏈溫度考慮在內(nèi)并且使用與所需雜交行為相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)法則來 進(jìn)行優(yōu)化。
[0095] 為獲得基因活性的完整圖像，一些探針選自由多個(gè)剪接或聚腺苷酸化變體共享的 區(qū)域。在其它情況下，區(qū)分變體的獨(dú)特探針是有利的。還將探針分離距離作為選擇方法的 因素考慮。
[0096] 不同組的策略用于選擇用以基因分型依賴于多個(gè)探針的陣列的探針以便詢問序 列中的單獨(dú)核苷酸?？梢允褂脙H在靶標(biāo)位置上變化的四個(gè)相同探針來推導(dǎo)靶堿基的身份， 每個(gè)探針含有四種可能的喊基中的一種。
[0097] 或者，可使用一個(gè)或兩個(gè)表示特定等位基因的探針來測(cè)試共有序列的存在。為了 基因分型雜合的或遺傳混合的樣品，可建立具有許多探針的陣列以便提供冗余信息，從而 導(dǎo)致明確的基因分型。此外，通用探針可用于一些應(yīng)用中以最大化柔性。例如一些探針陣 列允許單獨(dú)反應(yīng)產(chǎn)物與復(fù)合物混合物的分離和分析，如用于一些方案中來鑒別單個(gè)核苷酸 多態(tài)性（SNP)的那些。
[0098] 實(shí)時(shí) PCR
[0099] -方面，所公開的診斷方法可通過實(shí)時(shí)PCR方法來進(jìn)行。例如，一方面，本文公開 檢測(cè)ROSl相關(guān)融合的存在的方法或診斷ROSl相關(guān)癌癥或檢測(cè)受試者中ROSl激酶的失調(diào) 的方法，所述方法包括對(duì)來自所述受試者的組織樣品的mRNA進(jìn)行第一 RT-PCR反應(yīng)；其中反 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)包含能夠與ROSl激酶序列特異性地雜交的一個(gè)引物對(duì)和能 夠與任何融合斷裂點(diǎn)的ROSl 5'（即外部野生型ROSl位點(diǎn)）特異性地雜交的至少一個(gè)引物 對(duì)，以及確定來自每個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增子的循環(huán)閾值；并且其中野生型引物對(duì)擴(kuò)增子的循環(huán) 閾值高于ROSl激酶的循環(huán)閾值統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的量指示融合或突變的ROSl的存在。
[0100] 實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)在反應(yīng)過程中作為每個(gè)PCR循環(huán)過程中擴(kuò)增子產(chǎn)生的指標(biāo)的所發(fā)射 的熒光（即，實(shí)時(shí)），而不是終點(diǎn)檢測(cè)?？稍谝恍┫到y(tǒng)中觀察反應(yīng)的實(shí)時(shí)進(jìn)展。實(shí)時(shí)PCR不檢 測(cè)擴(kuò)增子的大小，并且因此不允許區(qū)分DNA和cDNA擴(kuò)增，然而，其不受非特異性擴(kuò)增影響， 除非使用SYBR Green。實(shí)時(shí)PCR定量消除PCR產(chǎn)物的PCR后加工。這有助于增加通量并且 減少攜帶污染的機(jī)會(huì)。實(shí)時(shí)PCR還提供高達(dá)IO 7倍的寬動(dòng)態(tài)范圍。任何測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍決 定靶濃度可以變化并且仍然被定量的范圍。寬動(dòng)態(tài)范圍意指靶標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)化子（normalise!·) 比率的寬范圍可用相等靈敏度和特異性進(jìn)行測(cè)定。由此可見，動(dòng)態(tài)范圍越寬，定量越精確。 當(dāng)與RT-PCR組合時(shí)，實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)通過在擴(kuò)增過程正在進(jìn)行時(shí)提供擴(kuò)增子的可視化來 減少測(cè)量擴(kuò)增子的量所需的時(shí)間。
[0101] 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)是基于檢測(cè)和定量的熒光報(bào)道分子。所述信號(hào)與反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的 量成正比地增加。通過記錄每個(gè)循環(huán)的熒光發(fā)射的量，有可能在指數(shù)期過程中監(jiān)測(cè)PCR反 應(yīng)，其中PCR產(chǎn)物的量的第一次顯著增加與靶標(biāo)模板的初始量相關(guān)。核酸靶標(biāo)的起始拷貝 數(shù)目越高，所觀察到的熒光的顯著增加越快。在3至15個(gè)循環(huán)過程中測(cè)量的熒光高于基線 值的顯著增加可指示檢測(cè)到累積的PCR產(chǎn)物。
[0102] 固定熒光閾值被設(shè)置成顯著高于可由操作者改變的基線。參數(shù)Ct (閾值循環(huán)）被 定義為熒光發(fā)射超過固定閾值的循環(huán)數(shù)。
[0103] 對(duì)于DNA擴(kuò)增來說存在三種主要的熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)：（1)水解探針；（2)雜交探針； 以及（3) DNA結(jié)合劑。水解探針包括TaqMan探針、分子信標(biāo)以及蝎（scorpion)。它們使用 Taq聚合酶的熒光5'外切核酸酶活性來測(cè)量cDNA樣品中靶序列的量。
[0104] TaqMan探針是比引物（20至30個(gè)堿基長(zhǎng)，其中Tm值高于KTC )長(zhǎng)的寡核苷酸， 所述寡核苷酸通常在5'堿基上包含熒光染料并且通常在3'堿基上包含淬滅染料（通常 TAMRA)。當(dāng)照射時(shí)，激發(fā)的熒光染色將能量轉(zhuǎn)移至附近的淬滅染料分子而不是發(fā)熒光（這 被稱為FRET= RVrsier或熒光共振能量轉(zhuǎn)移）。因此，報(bào)道子和淬滅劑的緊密靠近防止在 探針是完整時(shí)任何熒光的發(fā)射。TaqMan探針被設(shè)計(jì)成退火至PCR產(chǎn)物的內(nèi)部區(qū)域。當(dāng)聚合 酶復(fù)制TaqMan探針?biāo)Y(jié)合的模板時(shí)，其5'外切核酸酶活性使探針裂解。這結(jié)束了淬滅劑 (無 FRET)的活性，并且報(bào)道染料開始發(fā)射熒光，所述熒光在每個(gè)循環(huán)中與探針裂解的速率 成比例地增加。PCR產(chǎn)物的累積是通過監(jiān)測(cè)報(bào)道染料的熒光的增加來檢測(cè)（注意引物未進(jìn) 行標(biāo)記）。TaqMan測(cè)定使用通用的熱循環(huán)參數(shù)和PCR反應(yīng)條件。由于裂解僅在探針與靶標(biāo) 雜交的情況下發(fā)生，所以所檢測(cè)的熒光的原點(diǎn)是特異性擴(kuò)增。雜交和裂解的過程不干擾產(chǎn) 物的指數(shù)累積。用于熒光探針的一個(gè)具體要求是在5'端不存在G。與報(bào)道染料相鄰的"G" 可甚至在裂解之后淬滅報(bào)道分子熒光。
[0105] 分子信標(biāo)還在任一端包含熒光團(tuán)（FAM、TAMRA、TET、R0X)和淬滅染料（通常 DABCYL)，但它們被設(shè)計(jì)成采用發(fā)夾結(jié)構(gòu)，同時(shí)在溶液中游離以便使熒光染料和淬滅劑緊密 靠近，以用于FRET發(fā)生。它們具有帶互補(bǔ)序列的兩個(gè)臂，所述臂形成非常穩(wěn)定的雜交體或 莖。所述發(fā)夾構(gòu)型中報(bào)道分子與淬滅劑的緊密靠近抑制報(bào)道分子熒光。當(dāng)信標(biāo)與靶標(biāo)在退 火步驟過程中雜交時(shí)，報(bào)道染料與淬滅劑分尚并且報(bào)道分子發(fā)突光（FRET不會(huì)發(fā)生）。分子 信標(biāo)在PCR過程中保持完整并且必須在每一循環(huán)與靶標(biāo)再結(jié)合以用于熒光發(fā)射。這將與可 獲得的PCR產(chǎn)物的量相關(guān)。所有實(shí)時(shí)PCR化學(xué)允許通過將每個(gè)探針/信標(biāo)設(shè)計(jì)為具有光譜 獨(dú)特的熒光/淬火對(duì)來檢測(cè)多種DNA物種（多重反應(yīng)），只要平臺(tái)在使用SYBR綠的情況下 適用于解鏈曲線分析。通過多重反應(yīng)，一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)和內(nèi)源對(duì)照可在單個(gè)試管中進(jìn)行擴(kuò) 增。
[0106] 使用Scorpion探針，序列特異性引發(fā)和PCR產(chǎn)物檢測(cè)是使用單個(gè)寡核苷酸來實(shí) 現(xiàn)。Scorpion探針在未雜交狀態(tài)中保持莖-環(huán)構(gòu)型。熒光團(tuán)附接至5'端并且通過偶聯(lián)至 3'端的部分淬滅。莖的3'部分還包含與引物的延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列。所述序列經(jīng)由不可 擴(kuò)增的單體連接至特定引物的5'端。在Scorpion引物的延伸之后，特異性探針序列能夠 與延伸的擴(kuò)增子內(nèi)的其互補(bǔ)序列結(jié)合，從而打開發(fā)夾環(huán)。這防止熒光被淬滅并且觀察到信 號(hào)。
[0107] 另一種替代方案是雙鏈DNA結(jié)合染料化學(xué)，其通過使用非序列特異性熒光嵌入劑 (SYBR-綠I或溴化乙錠）來定量擴(kuò)增子產(chǎn)生（包括非特異性擴(kuò)增和引物二聚體復(fù)合物）。 它不與ssDNA結(jié)合。SYBR綠是熒光小溝結(jié)合染料，所述染料當(dāng)在溶液中時(shí)表現(xiàn)出很少熒光 但在結(jié)合雙鏈DNA之后發(fā)射強(qiáng)熒光信號(hào)?；赟YBR綠的實(shí)時(shí)PCR的缺點(diǎn)包括需要廣泛優(yōu) 化。此外，非特異性擴(kuò)增需要后續(xù)測(cè)定（熔點(diǎn)曲線或解離分析）以用于擴(kuò)增子鑒別。所述方 法已用于HFE-C282Y基因分型中。另一個(gè)可控制的問題是，較長(zhǎng)擴(kuò)增子產(chǎn)生更強(qiáng)信號(hào)（如 果與其它因素組合，這可以引起CDC照相機(jī)飽和度，見下文）。通常在單重反應(yīng)中使用SYBR 綠，然而當(dāng)與熔點(diǎn)分析結(jié)合時(shí)，其可以用于多重反應(yīng)。
[0108] 閾值循環(huán)或Ct值是首次檢測(cè)到ARn的顯著增加的循環(huán)（對(duì)于ARn的定義，參 見下文）。閾值循環(huán)是在對(duì)數(shù)-線性期過程中當(dāng)系統(tǒng)開始檢測(cè)到與PCR產(chǎn)物的指數(shù)生長(zhǎng)相 關(guān)的信號(hào)的增加時(shí)。所述期提供關(guān)于反應(yīng)的最有用的信息（當(dāng)然比端點(diǎn)更重要）。所述對(duì) 數(shù)-線性期的斜率是擴(kuò)增效率的反映。反應(yīng)的效率（Eff)可由以下公式計(jì)算：Eff = 10H/ 斜率>-1。PCR的效率應(yīng)是90%至100% (3.6 >斜率>3.1)。許多變量可能影響PCR的效 率。這些因素包括擴(kuò)增子的長(zhǎng)度、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及引物質(zhì)量。雖然可獲得不屬于效率范圍內(nèi) 的有效數(shù)據(jù)，但qRT-PCR應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化或替代擴(kuò)增子設(shè)計(jì)。對(duì)于為真實(shí)擴(kuò)增（而不是 信號(hào)漂移）的指示符的斜率來說，必須存在拐點(diǎn)。這是當(dāng)對(duì)數(shù)線性期開始時(shí)生長(zhǎng)曲線上的 點(diǎn)。它還表示沿生長(zhǎng)曲線的最大變化速率。（信號(hào)漂移的特征在于熒光的逐漸增加或減小 而無產(chǎn)物的擴(kuò)增。）用于定量的重要參數(shù)是(^。基因組DNA的初始量越高，越早在PCR過 程中檢測(cè)到累積產(chǎn)物，并且C t值越低。閾值將被放置高于任何基線活性并且在指數(shù)增加期 內(nèi)（其在對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化中看起來是線性的）。一些軟件允許通過生長(zhǎng)曲線的數(shù)學(xué)分析來確定循 環(huán)閾值（C t)。這提供更好的運(yùn)行到運(yùn)行可再現(xiàn)性。40的Ct值意指無擴(kuò)增并且所述值不能 包括在計(jì)算中。除了用于定量，C t值可用于作為通過/失敗測(cè)量的定性分析。
[0109] 可使用多種具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的染料進(jìn)行多重TaqMan測(cè)定。為此目的可用染料 是FAM、TET、VIC以及JOE (最昂貴的）。TAMRA作為淬滅劑保留在探針上并且ROX作為無源 參考（passive reference)。為了獲得最佳結(jié)果，推薦FAM(祀標(biāo)）與VIC(內(nèi)源對(duì)照）的組 合（它們具有發(fā)射最大值的最大差別），而JOE和VIC不應(yīng)進(jìn)行組合。重要的是，如果沒有 正確地選擇染料層，那么機(jī)器將仍然讀取其它染料的光譜。例如，VIC和FAM兩者在彼此相 似的范圍內(nèi)發(fā)射熒光并且當(dāng)進(jìn)行單個(gè)染料時(shí)，孔應(yīng)被正確地標(biāo)記。在多重反應(yīng)的情況下，應(yīng) 打開運(yùn)行后分析的光譜補(bǔ)償（在ABI7700上：儀器/診斷/高級(jí)選項(xiàng)/雜項(xiàng)）。激活光譜 補(bǔ)償改進(jìn)染料光譜分辨率。
[0110] 巢式 PCR
[0111] 所公開的方法可進(jìn)一步利用巢式PCR。巢式PCR通過減少由于DNA的非特異性擴(kuò) 增所致的背景來增加 DNA擴(kuò)增的特異性。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)PCR中。在第一反應(yīng)中， 一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物，所述DNA產(chǎn)物除所意圖的靶標(biāo)之外還可由非特異性擴(kuò)增的DNA 片段組成。所述一種或多種產(chǎn)物然后用于使用一組引物的第二PCR中，所述引物的結(jié)合位 點(diǎn)完全或部分不同于并且位于所述第一反應(yīng)中所使用的每個(gè)引物的3'。巢式PCR經(jīng)常在 特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段方面比常規(guī)PCR更成功，但它需要靶序列的更詳細(xì)的知識(shí)。
[0112] 因此，一方面，本文公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括對(duì)來 自所述受試者的組織樣品的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)；其中所述PCR反應(yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè) ROSl序列特異性地雜交的反向引物和至少一個(gè)正向引物；并且其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于 對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0113] 引物和探針
[0114] 如本文所用，"引物"是探針的子集，所述探針能夠支持一些類型的酶操作并且能 夠與靶核酸雜交以使得可發(fā)生酶操作。引物可由本領(lǐng)域可獲得的不會(huì)干擾酶操作的核苷酸 或核苷酸衍生物或類似物的任何組合制成。
[0115] 如本文所用，"探針"是通常以序列特異性方式，例如通過雜交能夠與靶核酸相互 作用的分子。核酸的雜交是本領(lǐng)域充分了解的并且在本文進(jìn)行了討論。通常探針可由本領(lǐng) 域可獲得的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物的任何組合制成。如本文所用，探針可包含在 其一端上的報(bào)道染料和在其另一端上的淬滅染料。
[0116] 公開包含引物和探針的組合物，所述引物和探針能夠與所公開的核酸如SEQ ID NO :1或其互補(bǔ)序列（如表7中所列出的那些）相互作用（例如，為與SEQ ID NO :1相互作 用的引物的SEQIDN0:4、5、7、8、12、13、14、15、16、17、18、20、以及21和為與SEQIDN0 :1 相互作用的探針的SEQ ID NO :6、8、19以及22)。所公開的引物和探針可用于以下中：用于 診斷本文所公開的ROSl相關(guān)癌癥的任何所公開的方法以及用于確定癌癥是否對(duì)用ROSl抑 制劑治療具有易感性或抗性的方法。在某些實(shí)施方案中，所述引物用于支持核酸延伸反應(yīng)、 核酸復(fù)制反應(yīng)和/或核酸擴(kuò)增反應(yīng)。通常所述引物將能夠以序列特異性方式延伸。引物以 序列特異性方式的延伸包括任何方法，其中引物與其雜交或以另外方式締合的核酸分子的 序列和/或組成引導(dǎo)或影響通過引物的延伸所產(chǎn)生的產(chǎn)物的組成或序列。引物以序列特異 性方式的延伸因此包括但不限于PCR、DNA測(cè)序、DNA延伸、DNA聚合、RNA轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄。公 開了以序列特異性方式擴(kuò)增引物的技術(shù)和條件。在某些實(shí)施方案中，引物用于DNA擴(kuò)增反 應(yīng)，如PCR或直接測(cè)序。應(yīng)了解在某些實(shí)施方案中，引物還可使用非酶技術(shù)進(jìn)行延伸，其中 例如用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸進(jìn)行修飾以使得它們將對(duì)以序列特異性方式延伸 引物具有化學(xué)反應(yīng)。通常所公開的引物與所公開的核酸或核酸的區(qū)域雜交或它們與所述核 酸的互補(bǔ)序列或所述核酸的區(qū)域的互補(bǔ)序列雜交。作為引物的用途的實(shí)例，一種或多種引 物可用于從第一核酸產(chǎn)生延伸產(chǎn)物和產(chǎn)生通過第一核酸模板化的延伸產(chǎn)物。
[0117] 用于與核酸相互作用的引物或探針的大小可為支持引物的所需酶操作（如DNA 擴(kuò)增或探針或引物的簡(jiǎn)單雜交）的任何大小。典型的引物或探針將是至少6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、 300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、 1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、或4000 個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
[0118] 在其它實(shí)施方案中，引物或探針可以是少于或等于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、 400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、 2000、2250、2500、2750、3000、3500、或 4000 個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
[0119] 用于目標(biāo)核酸的引物通常將用于產(chǎn)生包含目標(biāo)核酸的的區(qū)域的延伸產(chǎn)物和/或 其它復(fù)制的或擴(kuò)增的產(chǎn)物。產(chǎn)物的大小可以是使得所述大小可被精確地確定至在3、或2或 1個(gè)核苷酸內(nèi)。
[0120] 在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)物可以是例如至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、 225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、或 4000 個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
[0121] 在其它實(shí)施方案中，產(chǎn)物可以是例如少于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、 175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、 800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500、或 4000 個(gè)核 苷酸長(zhǎng)。
[0122] 因此，應(yīng)了解并且本文考慮所公開的RT-PCR和PCR反應(yīng)需要至少一個(gè)正向引物和 /或至少一個(gè)反向引物以便擴(kuò)增靶核酸。本文公開正向引物可以是例如細(xì)胞內(nèi)（即ROSl 斷裂點(diǎn)的3，）ROSl引物或ROSl激酶正向引物，例如像SEQ ID NO :4、7、15、17或20。反向 引物可以是例如ROSl激酶反向引物，例如像SEQ ID N0:5、8、12、16、18或21。應(yīng)了解所述 方法可包括至少一個(gè)正向引物和反向引物。因此，本文公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的 方法，所述方法包括對(duì)來自所述受試者的組織樣品的核酸（如mRNA或DNA)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、 RT-PCR、或其它PCR反應(yīng)；其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl 序列特異性地雜交的一個(gè)或多個(gè)反向引物和至少一個(gè)正向引物；其中所述正向引物可以是 例如 CD74-R0S1 引物（例如像 SEQ ID NO :2 和 10)、FIG-ROSl 引物、SLC34A2-R0S(短）弓丨 物、SLC34A2-R0S (短和長(zhǎng)）引物（例如像 SEQ ID NO :3 和 11)、SLC34A2-R0S (長(zhǎng)）引物、 ROSl激酶引物（例如像SEQ ID NO :4、7、15或17)、和/或野生型ROSl引物，包括結(jié)合融合 斷裂點(diǎn)的5'的野生型ROSl引物（例如像SEQ ID NO. 13或20);并且其中ROSl激酶的擴(kuò)增 產(chǎn)物的量相對(duì)于野生型ROSl中無相應(yīng)增加的對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。在 使用與ROSl融合配偶體結(jié)合的引物的情況下，已知的R0S1-融合相關(guān)癌癥的存在由相對(duì)于 對(duì)照物ROSl激酶的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的增加和所述融合配偶體的擴(kuò)增的增加指示。應(yīng)了解融 合配偶體的擴(kuò)增可通過使用包含與斷裂點(diǎn)的ROSl 3'雜交的反向引物和與斷裂點(diǎn)的融合配 偶體5'雜交的正向引物的引物對(duì)或僅使用與融合配偶體雜交的正向引物。在使用由與融 合配偶體結(jié)合的正向引物和與融合斷裂點(diǎn)的ROSl 3'結(jié)合的反向引物組成的引物對(duì)的方法 中，使用僅正向或反向引物在擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl和融合配偶體兩者、對(duì)于包含引物之間 的融合的擴(kuò)增子來說檢測(cè)到適當(dāng)大小的擴(kuò)增子、或檢測(cè)到擴(kuò)增子的量大于對(duì)照物指示ROSl 融合。在使用具有與融合配偶體結(jié)合的正向引物的引物對(duì)的情況下，與斷裂點(diǎn)的ROSl 5' 雜交的引物對(duì)用作針對(duì)融合事件的錯(cuò)誤鑒別和未知融合的確定的對(duì)照物?；蛘?，一方面，本 文所公開的方法可包括僅使用與融合配偶體結(jié)合的正向引物來在第一反應(yīng)中擴(kuò)增來自受 試者的核酸，和使用與融合斷裂點(diǎn)的ROSl 3'結(jié)合的引物對(duì)來擴(kuò)增所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子， 其中含有ROSl序列的擴(kuò)增子指不ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0123] 另一方面，還公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括對(duì)來自所述 受試者的組織樣品的核酸（如mRNA或DNA)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或其它PCR反應(yīng)；其中所 述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的反向引物和至少一個(gè) 正向引物；其中所述正向引物是外部野生型ROSl引物（即融合斷裂點(diǎn)的5'），并且其中擴(kuò) 增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。
[0124] 應(yīng)了解并且本文考慮存在以下情況：其中可能有利的是使用多于一個(gè)引物對(duì)來檢 測(cè)融合、截短或過表達(dá)突變的存在。如實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或其它PCR反應(yīng)可單獨(dú)地或在單個(gè) 反應(yīng)中進(jìn)行。當(dāng)多個(gè)引物對(duì)被放置至單個(gè)反應(yīng)中時(shí)，這被稱為"多重PCR"。例如，反應(yīng)可包 括與反向引物配對(duì)的野生型ROSl引物，以及與相同反向引物配對(duì)的ROSl激酶引物。因此， 本文公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括對(duì)來自所述受試者的組織樣 品的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)或RT-PCR反應(yīng)；其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl 序列特異性地雜交的反向引物和至少兩個(gè)正向引物；并且其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于ROSl 激酶的對(duì)照物而不是兩種引物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在。類似地公開包括至少三 個(gè)正向引物的方法。應(yīng)了解并且本文考慮本文所公開的兩個(gè)或更多個(gè)或三個(gè)或更多個(gè)正向 引物的任何組合可用于多重反應(yīng)中。因此，例如，本文公開診斷方法，其中正向引物是ROS1 融合引物（例如像CD74-R0S1、FIG-ROSl或SLC34-R0S1)、ROSl激酶引物以及野生型ROSl 引物。
[0125] 本文還公開診斷患有癌癥的受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括從所 述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，對(duì)核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增過程，以及檢測(cè)所 述組織樣品中與野生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在 或測(cè)量所述核酸的量，其中所述擴(kuò)增過程是對(duì)cDNA的PCR或?qū)RNA的實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或 實(shí)時(shí)RT-PCR，其中所述PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR或?qū)崟r(shí)RT-PCR反應(yīng)包括使用與野生型ROSl 序列特異性地雜交的正向和反向引物對(duì)（例如像與ROS1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的引物，如正 向引物SEQ ID NO :13和20和反向引物SEQ ID NO :14和21)和與野生型ROSl激酶結(jié)構(gòu)域 序列特異性地雜交的正向和反向引物對(duì)（例如像，正向引物SEQ ID NO :4、7、13、15、17或20 和反向引物（SEQ ID NO :5、8、12、14、16、18或21)。應(yīng)了解可使用特定野生型ROSl或ROSl 激酶結(jié)構(gòu)域的正向和反向引物的任何組合。例如，野生型ROSl (例如ROSl的E⑶）的正向 和反向引物對(duì)可以是SEQ ID N0:13和14;SEQ ID N0:13和21;SEQ ID N0:20和21;或 SEQ ID NO :20和14。類似地，對(duì)ROSl的激酶結(jié)構(gòu)域具有特異性的引物可以是所述激酶結(jié) 構(gòu)域的正向引物和反向引物的任何組合，例如像SEQ ID N0:4和5;SEQ ID N0:4和8;SEQ ID NO :4 和 14 ;SEQ ID NO :4 和 16 ;SEQ ID NO :4 和 18 ;SEQ ID NO :4 和 21 ;SEQ ID NO :7 和 5 ;SEQ ID NO :7 和 8 ;SEQ ID NO :7 和 14 ;SEQ ID NO :7 和 16 ;SEQ ID NO :7 和 18 ;SEQ ID NO :7 和 21 ;SEQ ID NO :13 和 5 ;SEQ ID NO :13 和 8 ;SEQ ID NO :13 和 14 ;SEQ ID NO : 13 和 16 ;SEQ ID NO :13 和 18 ;SEQ ID NO :13 和 21 ;SEQ ID NO :15 和 5 ;SEQ ID NO :15 和 8;SEQIDN0:15和14;SEQIDN0:15和16 ;SEQIDN0:15和18;SEQIDN0:15和21 ; SEQ ID NO :17 和 5 ;SEQ ID NO :17 和 8 ;SEQ ID NO :17 和 14 ;SEQ ID NO :17 和 16 ;SEQ ID NO :17 和 18 ;SEQ ID NO :17 和 21 ;SEQ ID NO :20 和 5 ;SEQ ID NO :20 和 8 ;SEQ ID NO :20 和 14 ;SEQ ID NO :20 和 16 ;SEQ ID NO :20 和 18 ;以及 SEQ ID NO :20 和 21。
[0126] 熒光變化探針和引物
[0127] 熒光變化探針和熒光變化引物是指涉及基于探針或引物和待檢測(cè)、測(cè)定或復(fù)制的 核酸的形式或構(gòu)象的變化的熒光強(qiáng)度或波長(zhǎng)的變化的所有探針和引物。熒光變化探針和引 物的實(shí)例包括分子信標(biāo)、Amplifluor、FRET探針、可裂解的FRET探針、TaqMan探針、蝎形引 物、熒光三鏈體寡核苷酸（包括但不限于三鏈體分子信標(biāo)或三鏈體FRET探針）、熒光水溶性 綴合的聚合物、PNA探針和QPNA探針。
[0128] 熒光變化探針和引物可根據(jù)其結(jié)構(gòu)和/或功能進(jìn)行分類。熒光變化探針包括發(fā)夾 淬滅的探針、裂解淬滅的探針、裂解激活的探針以及熒光激活的探針。熒光變化引物包括莖 淬滅的引物和發(fā)夾淬滅的引物。
[0129] 發(fā)夾淬滅的探針是以下探針，所述探針在未與靶序列結(jié)合時(shí)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（并且 通常為環(huán)），所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)使熒光標(biāo)記和淬滅部分靠近以使得來自所述標(biāo)記的熒光被淬滅。 當(dāng)探針與靶序列結(jié)合時(shí)，莖被破壞，淬滅部分不再與熒光標(biāo)記靠近并且熒光增加。發(fā)夾淬滅 的探針的實(shí)例是分子信標(biāo)、熒光三鏈體寡核苷酸、三鏈體分子信標(biāo)、三鏈體FRET探針以及 QPNA探針。
[0130] 裂解激活的探針是其中熒光通過探針的裂解而增加的探針。裂解激活的探針可包 括靠近的熒光標(biāo)記和淬滅部分以使得來自所述標(biāo)記的熒光被淬滅。當(dāng)探針被剪除或消化時(shí) (通常在擴(kuò)增過程中通過聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性），淬滅部分不再靠近熒光標(biāo)記 并且熒光增加。TaqMan探針是裂解激活的探針的實(shí)例。
[0131] 裂解淬滅的探針是其中熒光通過探針的裂解而減少或改變的探針。裂解淬滅的探 針可包括受體熒光標(biāo)記和供體部分，以使得當(dāng)受體和供體靠近時(shí)，從供體至受體的熒光共 振能量轉(zhuǎn)移引起受體發(fā)熒光。所述探針因此例如在與靶序列雜交時(shí)是熒光的。當(dāng)探針被剪 除或消化時(shí)（通常在擴(kuò)增過程中通過聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性），供體部分不再靠 近受體熒光標(biāo)記并且來自受體的熒光減少。如果供體部分本身是熒光標(biāo)記，那么它可在不 靠近受體時(shí)釋放作為熒光的能量（通常以與受體的熒光不同的波長(zhǎng)）?？傮w作用然后將是 受體熒光的減少和供體熒光的增加。在裂解淬滅的探針的情況下，供體熒光等于由裂解激 活的探針產(chǎn)生的熒光，其中受體是淬滅部分并且供體是熒光標(biāo)記?？闪呀獾腇RET(熒光共 振能量轉(zhuǎn)移）探針是裂解淬滅的探針的實(shí)例。
[0132] 熒光激活的探針是其中熒光通過探針與靶序列的雜交增加或改變的探針或探針 對(duì)。熒光激活的探針可包括受體熒光標(biāo)記和供體部分，以使得當(dāng)受體和供體靠近時(shí)（當(dāng)探 針與靶序列雜交時(shí)），從供體至受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移引起受體發(fā)熒光。熒光激活的探針 通常是被設(shè)計(jì)成與相鄰序列雜交以使得受體和供體靠近的探針對(duì)。熒光激活的探針還可以 是含有供體和受體兩者的單個(gè)探針，其中當(dāng)探針未與靶序列雜交時(shí)供體和受體不靠近，但 其中當(dāng)探針與靶序列雜交時(shí)供體和受體靠近。這可例如通過以下方式來完成：將供體和受 體放置在探針的相對(duì)端上并且將靶互補(bǔ)序列放置在探針的每一端處，其中靶互補(bǔ)序列是與 靶序列中的相鄰序列互補(bǔ)的。如果熒光激活的探針的供體部分本身是熒光標(biāo)記，那么它可 在未靠近受體時(shí)（即，在探針未與靶序列雜交時(shí)）釋放作為熒光的能量（通常以與受體的 熒光不同的波長(zhǎng)）。當(dāng)探針與靶序列雜交時(shí)，總體作用然后將是供體熒光的減少和受體熒光 的增加。FRET探針是熒光激活的探針的實(shí)例。
[0133] 莖淬滅的引物是以下引物，所述引物在未與互補(bǔ)序列雜交時(shí)形成莖結(jié)構(gòu)（分子內(nèi) 莖結(jié)構(gòu)或分子間莖結(jié)構(gòu)），所述莖結(jié)構(gòu)使熒光標(biāo)記和淬滅部分靠近，這樣使得來自標(biāo)記的熒 光被淬滅。當(dāng)引物與互補(bǔ)序列結(jié)合時(shí)，莖被破壞，淬滅部分不再與熒光標(biāo)記靠近并且熒光增 力口。在所公開的方法中，莖淬滅的引物用作核酸合成的引物并且因此變成摻入到合成的或 擴(kuò)增的核酸中。莖淬滅的引物的實(shí)例是肽核酸淬滅的引物和發(fā)夾淬滅的引物。
[0134] 肽核酸淬滅的引物是與肽核酸淬滅劑或肽核酸熒光締合以形成莖結(jié)構(gòu)的引物。所 述引物包含熒光標(biāo)記或淬滅部分并且分別與肽核酸淬滅劑或肽核酸熒光締合。這樣使得熒 光標(biāo)記靠近淬滅部分。當(dāng)引物復(fù)制時(shí)，肽核酸被置換，從而允許熒光標(biāo)記產(chǎn)生熒光信號(hào)。
[0135] 發(fā)夾淬滅的引物是以下引物，所述引物在未與互補(bǔ)序列雜交時(shí)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（并 且通常為環(huán)），所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)使熒光標(biāo)記和淬滅部分靠近以使得來自所述標(biāo)記的熒光被淬 滅。當(dāng)引物與互補(bǔ)序列結(jié)合時(shí)，莖被破壞，淬滅部分不再與熒光標(biāo)記靠近并且熒光增加。發(fā) 夾淬滅的引物通常用作核酸合成的引物并且因此變成摻入到合成的或擴(kuò)增的核酸中。發(fā)夾 淬滅的引物的實(shí)例是Amplifluor引物和蝎形引物。
[0136] 裂解激活的引物與裂解激活的探針類似，除了他們是摻入到復(fù)制鏈中并且然后隨 后裂解的引物。
[0137] 標(biāo)記
[0138] 為了使用所公開的方法幫助檢測(cè)和定量所產(chǎn)生的核酸，標(biāo)記可以直接地?fù)饺胫梁?苷酸或核酸中或可與檢測(cè)分子如探針和引物偶聯(lián)。如本文所用，標(biāo)記是可與核苷酸或核酸 直接地或間接地締合并且直接地或間接地產(chǎn)生可測(cè)量的、可檢測(cè)的信號(hào)的任何分子。用于 摻入至核苷酸和核酸或與核酸探針偶聯(lián)的許多這類標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。適用于 在所公開的方法中使用的標(biāo)記的實(shí)例是放射性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體以及 配體。熒光標(biāo)記，尤其是在熒光變化探針和引物的背景下，適用于擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測(cè)。
[0139] 適合的熒光標(biāo)記的實(shí)例包括異硫氰酸熒光素（FITC)、5,6-羧甲基熒光素、德克薩 斯紅、硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基（NBD)、香豆素、丹磺酰氯、羅丹明、氨基-甲基香 豆素（AMCA)、曙紅、藻紅、BODIPY?、CASCADE BLUE?、OREGON GREEN*'、芘、麗絲胺 (Iissamine)、咕噸（xanthenes)、Π 丫陡、P惡嗪、藻紅蛋白、鑭系元素離子的大環(huán)螯合劑如量子 染料?、熒光能量轉(zhuǎn)移染料如噻唑橙-乙啡啶異源二聚體、以及花青染料Cy3、Cy3. 5、Cy5、 Cy5. 5以及Cy7。其它特異性熒光標(biāo)記的實(shí)例包括3-羥基芘5,8,10-三磺酸、5-羥基色 胺（5-HT)、酸性品紅、茜素絡(luò)合酮（Alizarin Complexon)、茜紅（Alizarin Red)、別藻藍(lán) 素（Allophycocyanin)、氨基香豆素（Aminocoumarin)、蒽基硬脂酸酯、Astrazon 亮紅 4G、 Astrazon 澄 R、Astrazon 紅 6B、Astrazon 黃 7GLL、阿的平（Atabrine)、金胺（Auramine)、 金膦（Aurophosphine)、金膦G、BA09(雙氨基苯基卩惡二唑）、BCECF、硫酸黃連素、雙苯甲酰 胺、Blancophor FFG 溶液、Blancophor SV、氟硼突（Bodipy)Fl、亮 Sulphoflavin FF、?丐 黃綠素藍(lán)（Calcien Blue)、|丐綠（Calcium Green)、Calcofluor RW 溶液、Calcofluor 白、 Calcophor白ABT溶液、Calcophor白標(biāo)準(zhǔn)溶液、Carbostyryl、Cascade黃、兒茶酚胺、奎納 克林（Chinacrine)、Coriphosphine 0、香豆素-鬼筆環(huán)膚（Phalloidin)、CY3. 18、CY5. 18、 CY7、Dans(l-二甲基氨基萘5磺酸）、Dansa (二氨基萘基磺酸）、丹酰NH-CH3、二氨基苯基 噁二唑（DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亞甲基二氟化硼、二苯基亮黃素7GFF、多巴胺、 藻紅ITC、吖啶橙、FIF(甲醛誘導(dǎo)的熒光）、Flazo橙、Fluo3、熒光胺、Fura-2、Genacryl亮 紅 B、Genacryl 亮黃 10GF、Genacryl 粉 3G、Genacryl 黃 5GF、乙醒酸（Gloxalic Acid)、粒狀 藍(lán)、血口卜啉（Haematoporphyrin)、Indo-I、Intrawhite Cf 液體、Leucophor PAF、Leucophor SF、Leucophor WS、麗絲胺羅丹明 B200(RD200)、熒光黃 CH、熒光黃 VS、萘紅（Magdala Red)、 Marina藍(lán)、Maxilon亮黃素10GFF、Maxilon亮黃素8GFF、MPS (甲基綠派若寧二苯乙烯）、 光輝霉素（Mithramycin)、NBD胺、硝基苯并卩惡二唑（Nitrobenzoxadidole)、去甲腎上腺 素、核固紅、核黃、Nylosan亮黃素 E8G、噁二唑、太平洋藍(lán)（Pacific Blue)、堿性副品紅 (Pararosaniline) (Feulgen)、Phorwite AR 溶液、Phorwite BKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、Phosphine3R、酞菁染料、藻紅蛋白 R、藻紅蛋白 B、Polyazaindacene Pontochrome 藍(lán) 黑、卩卜啉（Porphyrin)、搜草靈（Primuline)、普施安黃（PrccionYellow)、派若寧、派若寧 B、Pyrozal亮黃素7GF、氮芥喹卩丫因 （Quinacrine Mustard)、羅丹明123、羅丹明5GLD、羅 丹明6G、羅丹明B、羅丹明B200、羅丹明B Extra、羅丹明BB、羅丹明BG、羅丹明WT、血清素、 Sevron 亮紅 2B、Sevron 亮紅 4G、Sevron 亮紅 B、Sevron 澄、Sevron 黃 L、SITS (搜草靈）、 SITS(二苯乙烯異硫磺酸）、二苯乙烯、Snarfl、磺基羅丹明B Can C、磺基羅丹明G Extra、 四環(huán)素、噻嗪紅R、硫磺素 S、硫磺素 TCN、硫磺素5、Thiolyte、Thiozol橙、Tinopol CBS、真 藍(lán)、Ultralite、熒光素鈉（Uranine) B、Uvitex SFC、二甲苯橙、以及 XRITC。
[0140] 這些熒光劑中的一些的吸收和發(fā)射最大值分別是：FITC (490nm ;520nm)、 Cy3 (554nm ;568nm)、Cy3. 5 (581nm ;588nm)、Cy5 (652nm ;672nm)、Cy5. 5 (682nm ;703nm)以 及Cy7 (755nm ;778nm)，從而允許其同時(shí)檢測(cè)。熒光素染料的其它實(shí)例包括6-羧基熒光素 (6-卩六厘)、2/，4 /，1，4，-四氯熒光素〇^1')、2/，4/，5/，7 /，1，4-六氯熒光素（冊(cè)父)、 2'，7'-二甲氧基-4' ,5'-二氯-6-羧基羅丹明（JOE)、2'-氯-5'-氟-7' ,8'-融 合的苯基-1，4-二氯-6-羧基熒光素（NED)、以及2'-氯-7'-苯基-1，4-二氯-6-羧 基突光素（VIC)。突光標(biāo)記可從多種商業(yè)來源獲得，包括Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ；Molecular Probes, Eugene, OR ;以及 Research Organics, Cleveland, Ohio。
[0141] 另外目標(biāo)標(biāo)記包括僅在所述標(biāo)記所締合的探針與靶分子特異性地結(jié)合時(shí)提供信 號(hào)的那些，其中這類標(biāo)記包括：如 Tyagi&Kramer，Nature Biotechnology (1996) 14 :303 和 EPO 070 685R1中所描述的"分子信標(biāo)"。其它目標(biāo)標(biāo)記包括美國(guó)專利號(hào)5, 563, 037中所描 述的那些，所述專利以引用的方式并入本文。
[0142] 標(biāo)記的核苷酸是標(biāo)記的在合成過程中可直接地?fù)饺胫翑U(kuò)增產(chǎn)物中的形式?？蓳?入至擴(kuò)增的核酸中的標(biāo)記的實(shí)例包括核苷酸類似物如BrdUrd、氨基烯丙基脫氧尿苷、5-甲 基胞啼陡、溴尿苷，和用生物素或用適合的半抗原修飾的核苷酸如地高辛（digoxygenin)。 適合的熒光標(biāo)記的核苷酸是異硫氰酸熒光素-dUTP、菁藍(lán)-3-dUTP以及菁藍(lán)-5-dUTP。 用于DNA的核苷酸類似物標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例是BrdUrd (溴脫氧尿苷，BrdUrd、BrdU、 BUdR，Sigma-Aldrich Co)。用于將標(biāo)記摻入至DNA中的核苷酸類似物的其它實(shí)例是 AA-dUTP (氨基烯丙基-脫氧尿苷三磷酸酯，Sigma-Aldrich Co.)和5-甲基-dCTP (Roche Molecular Biochemicals)。用于將標(biāo)記摻入至RNA中的核苷酸類似物的一個(gè)實(shí)例是生物 素 _16_UTP(生物素-16-尿昔-5'-三憐酸醋，Roche Molecular Biochemicals)。突光 素、Cy3以及Cy5可連接至dUTP以用于直接標(biāo)記。Cy3. 5和Cy7是作為用于生物素或地高 辛標(biāo)記的探針的二次檢測(cè)的抗生物素蛋白或抗地高辛綴合物可獲得的。
[0143] 摻入至擴(kuò)增的核酸中的標(biāo)記如生物素可隨后使用本領(lǐng)域熟知的靈敏方法進(jìn)行檢 測(cè)。例如，生物素可使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物（Tr 〇piX，Inc.)進(jìn)行檢測(cè)，其與生 物素結(jié)合并且隨后通過適合的底物（例如，化學(xué)發(fā)光底物csro :二鈉，3-(4-甲氧基螺-[1， 2，-二氧雜環(huán)丁燒-3-2' -(5'-氯）二環(huán)[3. 3.1. I3'7]癸燒]_4_基）憐酸苯酯；Tropix， Inc.)的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記還可以是酶，如堿性磷酸酶、大豆過氧化物酶、辣根過氧化 物酶以及聚合酶，所述酶可例如用化學(xué)信號(hào)擴(kuò)增或通過使用酶的底物來進(jìn)行檢測(cè)，所述底 物產(chǎn)生光（例如，化學(xué)發(fā)光1，2_二氧雜環(huán)丁烷底物）或熒光信號(hào)。
[0144] 組合兩種或更多種這些標(biāo)記的分子也被認(rèn)為是標(biāo)記。任何已知標(biāo)記可以與所公開 的探針、標(biāo)簽以及方法一起使用以便使用所公開的方法標(biāo)記并且檢測(cè)所擴(kuò)增的核酸。用于 檢測(cè)和測(cè)量由標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，放射性同位素可 通過閃爍計(jì)數(shù)或直接可視化檢測(cè)；熒光分子可用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)；磷光分子可用分光 光度計(jì)檢測(cè)或用照相機(jī)直接可視化；酶可通過檢測(cè)或可視化由所述酶催化的反應(yīng)的產(chǎn)物來 進(jìn)行檢測(cè)；抗體可通過檢測(cè)與所述抗體偶聯(lián)的二級(jí)標(biāo)記來進(jìn)行檢測(cè)。如本文所用，檢測(cè)分子 是與擴(kuò)增的核酸相互作用并且一種或多種標(biāo)記所偶聯(lián)的分子。
[0145] 應(yīng)了解并且本文考慮，評(píng)估具體mRNA是否增加或mRNA的表達(dá)是否發(fā)生或具體 mRNA是否存在的一種方法是通過與對(duì)照樣品進(jìn)行比較。因此，本文考慮診斷受試者中的癌 癥的方法，所述方法包括用來自所述受試者的組織樣品的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR、或其 它PCR反應(yīng)；其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性 地雜交的至少一個(gè)反向引物和至少一個(gè)正向引物；其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物的增加 指示ROSl相關(guān)癌癥的存在；并且其中所獲得的對(duì)照組織是非癌組織。應(yīng)進(jìn)一步了解關(guān)于 ROSl相關(guān)癌癥，非癌組織對(duì)照物的使用可利用但不是必要的，因?yàn)檫€可使用來自非ROSl相 關(guān)癌癥的癌組織。因此，本文公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括對(duì)來 自所述受試者的組織樣品的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR或反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)反應(yīng)；其中所述聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的反向引物和至少一個(gè)正向 引物；并且其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在；并且其中對(duì) 照組織是從非ROSl相關(guān)癌組織獲得。
[0146] 所公開的方法可以用于診斷其中在本文被稱為"癌癥"的不受控制的細(xì)胞增殖發(fā) 生的任何疾病。不同類型的ROSl相關(guān)癌癥的非限制性列表如下：淋巴瘤（霍奇金氏和非霍 奇金氏）、白血病、癌、實(shí)體組織癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、高級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 胚細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、缺氧腫瘤、骨髓瘤、AIDS 相關(guān)淋巴瘤或肉瘤、轉(zhuǎn)移性癌癥或一般癌癥。
[0147] 所公開的方法可用于診斷的癌癥的代表性但非限制性列表如下：淋巴瘤、B細(xì)胞 淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫、霍奇金氏病、髓細(xì)胞性白血病、膀胱癌、腦癌、神經(jīng)系統(tǒng) 癌、頭頸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌（lung cancer)如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌、 成神經(jīng)細(xì)胞瘤/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、肝癌、黑色素瘤，口腔、 咽、喉和肺的鱗狀細(xì)胞癌，結(jié)腸癌、膽管癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌（cervical cancer)、宮頸癌 (cervical carcinoma)、乳腺癌和上皮癌、腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌（pulmonary cancer)、 食道癌、頭頸癌、大腸癌、造血癌、睪丸癌、結(jié)腸和直腸癌、前列腺癌或胰腺癌。
[0148] 因此，本文公開診斷癌癥的方法，其中所述癌癥選自由以下各項(xiàng)組成的組：非小細(xì) 胞肺癌、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤、系統(tǒng)性組織細(xì)胞增多癥、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、食管鱗狀細(xì) 胞癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膽管癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及 炎性肌纖維母細(xì)胞腫瘤（IMT)。例如，本文公開診斷受試者中ROSl相關(guān)癌癥的方法，所述方 法包括對(duì)來自所述受試者的組織樣品的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或其它PCR反應(yīng)；其中 所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的反向引物和至少一 個(gè)正向引物；其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示ROSl相關(guān)癌癥的存在，并且其中 所述癌癥選自由以下各項(xiàng)組成的組：非小細(xì)胞肺癌、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤、系統(tǒng)性組織細(xì) 胞增多癥、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膽 管癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及炎性肌纖維母細(xì)胞腫瘤（IMT)。
[0149] 評(píng)估針對(duì)ROSl的治療的適合性的方法
[0150] 雖然不希望受現(xiàn)有理論束縛，據(jù)信用小分子藥物候選物抑制這些形式的RTK基因 消除相關(guān)的異常細(xì)胞增殖并且促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其它RTK相關(guān)腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞凋 亡；此外，臨床前動(dòng)物模型和使用這些抑制劑的早期臨床經(jīng)驗(yàn)兩者均表明，RTK小分子抑制 劑不僅具有針對(duì)RTK相關(guān)癌癥的顯著抗腫瘤活性，而且對(duì)無限制性靶標(biāo)相關(guān)的毒性還是良 好耐受的。
[0151] 這些發(fā)現(xiàn)突出了對(duì)于ROSl突變的專門化的診斷測(cè)試的需要。例如，這種測(cè)定可用 于篩選受遺傳性成神經(jīng)細(xì)胞瘤影響的家庭中的兒童以幫助促進(jìn)在早期階段檢測(cè)腫瘤，此時(shí) 所述腫瘤更易于進(jìn)行治療。因此，本文公開評(píng)估受試者中針對(duì)癌癥的ROSl抑制劑治療的適 合性的方法，所述方法包括測(cè)量來自所述受試者的組織樣品的核酸；其中ROSl序列mRNA的 量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示可以用ROSl抑制劑治療的癌癥。
[0152] 應(yīng)了解并且本文考慮，本文所公開的任何所公開的mRNA測(cè)量技術(shù)可用于這些方 法中。因此，例如，本文公開評(píng)估受試者中針對(duì)癌癥的ROSl抑制劑治療的適合性的方法，所 述方法包括用來自所述受試者的組織樣品的mRNA或DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或其它PCR 反應(yīng)；其中所述PCR反應(yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的反向引物和至少 一個(gè)正向引物；并且其中擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于對(duì)照物的增加指示可用ROSl抑制劑治療的 癌癥。應(yīng)進(jìn)一步了解所公開的方法可進(jìn)一步包括本文所公開的任何引物并且利用所公開的 多重PCR技術(shù)。
[0153] 因此，一方面，本文公開在受試者中評(píng)估疾病或病狀的易感性或風(fēng)險(xiǎn)、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn) 展、確定癌癥對(duì)于治療性ROSl抑制劑治療的易感性或抗性、或確定針對(duì)與核酸變異、截短 或TOSl融合相關(guān)的癌癥的ROSl抑制劑治療的適合性的方法，所述方法包括檢測(cè)來自所述 受試者的組織樣品的DNA、cDNA的存在或測(cè)量DNA、cDNA的水平或mRNA的表達(dá)水平；其中 ROSl激酶的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于不存在野生型ROSl的相應(yīng)增加的對(duì)照物的增加指示ROSl 相關(guān)癌癥的存在，并且因此指示對(duì)ROSl抑制劑治療易感的癌癥的存在。這類方法可用擴(kuò)增 方法如PCR、實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或?qū)崟r(shí)RT-PCR或通過進(jìn)行原位雜交方法如FISH來完成。
[0154] 一方面，本文公開用于確定患有癌癥的受試者中對(duì)于ROSl抑制劑的癌癥的治療 性治療的易感性或抗性或針對(duì)癌癥的ROSl治療劑治療的適合性的方法，所述方法包括檢 測(cè)ROSl激酶活性的存在。因此，例如，本文公開確定患有癌癥的受試者中針對(duì)ROSl相關(guān) 癌癥的治療性治療的易感性或抗性或待用ROSl抑制劑治療的癌癥的適合性的方法，所述 方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，對(duì)所述核酸進(jìn)行RT-PCR、 實(shí)時(shí)PCR、或?qū)崟r(shí)RT-PCR，以及檢測(cè)所述組織樣品中與野生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān) 的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的量，其中所述RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)包括使用與野生型 ROSl序列（例如，ROSl的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列，如SEQ ID NO :13、14、20以及21)特異性地 雜交的正向和反向引物對(duì)和/或與野生型ROSl激酶結(jié)構(gòu)域序列（例如，SEQ ID SO :4、5、 7、8、15、16、17以及18)特異性地雜交的正向和反向引物對(duì)，以及檢測(cè)所述組織樣品中與野 生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu)域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的 量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常對(duì)照物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患有ROSl相關(guān) 癌癥并且因此對(duì)用ROSl抑制劑治療是易感的。不存在擴(kuò)增子或擴(kuò)增子水平等于正常對(duì)照 物指示所述癌癥不對(duì)ROSl治療易感并且將對(duì)這種治療具有抗性。還公開用于確定患有癌 癥的受試者中對(duì)于針對(duì)ROSl相關(guān)癌癥的治療性治療的易感性或抗性或待用ROSl抑制劑治 療的癌癥的適合性的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分 離核酸，其中來自所述組織樣品的核酸為RNA，其中所述方法進(jìn)一步包括從所述RNA樣品合 成cDNA，對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR ;以及檢測(cè)所述組織樣品中與野生型ROSl和ROSl激酶結(jié)構(gòu) 域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè)量所述核酸的量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常 對(duì)照物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患有ROSl相關(guān)癌癥。另一方面，所公開的方 法可使用與具有實(shí)時(shí)RT-PCR的產(chǎn)物的序列（例如，SEQ DI NO :6、8、19以及22)互補(bǔ)的探 針，或所述方法可包括確定野生型ROSl和野生型ROSl激酶的循環(huán)閾值（Ct)值；其中野生 型ROSl相對(duì)于ROSl激酶的高（Ct)值指示融合的存在并且因此指示所述癌癥對(duì)用ROSl抑 制劑治療易感或ROSl抑制性治療適合用于所述癌癥。在使用探針的情況下，應(yīng)了解探針可 包含在其一端上的報(bào)道染料和在其另一端上的淬滅染料。當(dāng)癌癥被確定為對(duì)用ROSl抑制 劑治療易感或適合用于用ROSl抑制劑治療時(shí)，還公開以下方法：所述方法進(jìn)一步包括向患 有對(duì)ROSl抑制劑治療易感的癌癥的患者施用ROSl抑制劑。相反，在癌癥不對(duì)ROSl抑制劑 易感的情況下，所述方法可進(jìn)一步包括使用不同于ROSl抑制劑的治療形式來治療患有所 述癌癥的受試者。
[0155] 在用于確定患有癌癥的受試者中針對(duì)ROSl相關(guān)癌癥的治療性治療的易感性或 抗性或待用ROSl抑制劑治療的癌癥的適合性的另一種替代方法中，通過使用兩步檢測(cè)的 qPCR方法來檢測(cè)ROSl融合，其中在第一反應(yīng)中僅使用與ROSl融合配偶體結(jié)合的正向引物， 并且其中在所述第一反應(yīng)之后的第二反應(yīng)中，來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子用作第二擴(kuò)增、 基于探針的檢測(cè)或測(cè)序反應(yīng)的模板，其中所使用的探針或引物對(duì)融合斷裂點(diǎn)的ROSl 3'具 有特異性，并且其中在來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl指示ROSl融合并且因此 指示對(duì)ROSl抑制劑治療易感的ROSl相關(guān)癌癥。此外，公開用于確定患有癌癥的受試者中 對(duì)于針對(duì)ROSl相關(guān)癌癥的治療性治療的易感性或抗性或待用ROSl抑制劑治療的癌癥的 適合性的方法，所述方法包括從所述受試者獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，使用 與ROSl融合配偶體結(jié)合的正向引物進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)；其中來自所述第一反應(yīng)的擴(kuò)增子 用作第二擴(kuò)增反應(yīng)的模板；在所述第一反應(yīng)之后進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中對(duì)于融合斷裂點(diǎn) 的ROSl序列3'具有特異性的引物用于所述第二擴(kuò)增反應(yīng)中（例如，SEQ ID NO :4、5、7、8、 15、16、17以及18);以及檢測(cè)來自所述第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中ROSl的存在；其中在來自所述 第二反應(yīng)的擴(kuò)增子中檢測(cè)到ROSl指示ROSl融合的存在；并且檢測(cè)所述組織樣品中與ROSl 激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)的核酸的存在，其中擴(kuò)增子的存在指示所述受試者將是對(duì)用ROSl抑制劑 治療易感的并且存在在擴(kuò)增子將指示所述癌癥對(duì)ROSl抑制劑治療具有抗性或不具有易感 性。當(dāng)癌癥被確定為對(duì)用ROSl抑制劑治療易感或適合用于用ROSl抑制劑治療時(shí)，還公開以 下方法：所述方法進(jìn)一步包括向患有對(duì)ROSl抑制劑治療易感的癌癥的患者施用ROSl抑制 齊U。相反，在癌癥不對(duì)ROSl抑制劑易感的情況下，所述方法可進(jìn)一步包括使用不同于ROSl 抑制劑的治療形式來治療患有所述癌癥的受試者。
[0156] 篩選方法
[0157] 本文所公開的ROSl融合是癌癥治療的靶標(biāo)。因此，本文公開在受試者中針對(duì)抑制 ROSl相關(guān)癌癥的藥劑進(jìn)行篩選的方法，所述方法包括
[0158] a)從患有ROSl相關(guān)癌癥的受試者獲得組織樣品；
[0159] b)從所述組織樣品提取mRNA ;
[0160] c)使所述組織樣品與所述藥劑相接觸；
[0161] d)對(duì)來自所述組織樣品的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR或其它PCR反應(yīng)；
[0162] 其中所述RT-PCR反應(yīng)包括能夠與一個(gè)或多個(gè)ROSl序列特異性地雜交的反向引物 和至少一個(gè)正向引物；并且其中指示ROSl融合的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相對(duì)于未治療的對(duì)照物的 減少指不可抑制ROSl相關(guān)癌癥的藥劑。應(yīng)了解并且本文考慮通過所述藥劑有效治療的一 個(gè)度量是融合斷裂點(diǎn)的ROSl 5'的擴(kuò)增子的循環(huán)閾值相對(duì)于未治療的對(duì)照物的減少。應(yīng)了 解并且本文考慮進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)的過程涉及從分離的RNA合成cDNA并且對(duì)所述cDNA進(jìn) 行 PCR。
[0163] 核酸
[0164] 所公開的方法和組合物利用各種核酸。一般來說，任何核酸可用于所公開的方法 中。例如，所公開的目標(biāo)核酸和所公開的參考核酸可基于所需分析和待獲得或評(píng)估的信息 進(jìn)行選擇。所公開的方法還產(chǎn)生新的和改變的核酸。這類核酸的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)將通過以下方 式形成：其中所述核酸在所述方法中產(chǎn)生和操作。因此，例如，延伸產(chǎn)物和雜交核酸在所公 開的方法中產(chǎn)生。如本文所用，雜交核酸是延伸產(chǎn)物和第二核酸的雜交體。
[0165] 應(yīng)了解并且本文考慮目標(biāo)核酸可以是任何核酸，對(duì)于所述核酸來說需要確定核苷 酸變異的存在或不存在。因此，例如，目標(biāo)核酸可包含對(duì)應(yīng)于參考核酸的野生型序列的序 列。本文進(jìn)一步公開，所公開的方法可在以下情況下進(jìn)行：其中第一核酸是參考核酸并且第 二核酸是目標(biāo)核酸，或其中第一核酸是目標(biāo)核酸并且第二核酸是參考核酸。
[0166] 應(yīng)了解并且本文考慮，參考核酸可以是目標(biāo)核酸有待針對(duì)其進(jìn)行比較的任何核 酸。通常，參考核酸具有已知序列（和/或已知具有作為參考的目標(biāo)序列）。雖然不要求， 但以下情況是有用的：如果參考序列與目標(biāo)核酸具有已知或疑似的緊密關(guān)系。例如，如果希 望檢測(cè)單個(gè)核苷酸變異，參考序列可以被有用地選擇為以下序列：所述序列是目標(biāo)核酸的 同系物或與目標(biāo)核酸緊密匹配，如來源于來自相同或相關(guān)生物體或個(gè)體的相同基因或遺傳 元件的核酸。因此，例如，本文考慮參考核酸可包含野生型序列或可替代地包含已知突變， 包括例如以下突變：所述突變的存在或不存在與疾病或?qū)χ委熜灾委煹目剐韵嚓P(guān)。因此，例 如，考慮所公開的方法可用于通過以下方式來檢測(cè)或診斷目標(biāo)核酸中已知突變的存在：通 過將目標(biāo)核酸與包含野生型序列（即，已知不具有所述突變）的參考核酸進(jìn)行比較并且針 對(duì)目標(biāo)核酸中變異的存在或不存在進(jìn)行檢查，其中不存在變異將指示不存在突變?；蛘撸瑓?考核酸可具有已知突變。因此，例如，考慮所公開的方法可用于通過以下方式來檢測(cè)疾病或 病狀的易感性：通過將目標(biāo)核酸與包含已知突變（其指示對(duì)于疾病的易感性）的參考核酸 進(jìn)行比較并且檢查所述突變的存在或不存在，其中所述突變的存在指示疾病。
[0167] 在本文，術(shù)語"核苷酸變異"是指目標(biāo)核酸的核苷酸序列相對(duì)于參考核酸的核苷酸 序列的任何變化或不同。因此，核苷酸變異據(jù)說在以下情況下發(fā)生：當(dāng)參考核酸與目標(biāo)核酸 (或其互補(bǔ)序列，如在上下文中適當(dāng)?shù)模┲g的序列不同時(shí)。因此，例如，核酸中特定位置處 腺嘌呤（A)對(duì)鳥嘌呤（G)的取代將是核苷酸變異，其條件是參考核酸包含在相應(yīng)位置處的 A。應(yīng)了解并且本文考慮確定變異是基于參考核酸并且不指示序列是否是野生型的。因此， 例如，當(dāng)具有已知突變的核酸用作參考核酸時(shí)，不具有所述突變的核酸（包括野生型核酸） 將被認(rèn)為具有核苷酸變異（相對(duì)于參考核酸）。
[0168] 核苷酸
[0169] 所公開的方法和組合物利用各種核苷酸。在整個(gè)本申請(qǐng)中和本文所公開的方法參 考了核苷酸的堿基類型。應(yīng)了解并且本文考慮其中在參考一種類型的堿基的情況下，這是 指在核酸鏈中的核苷酸中能夠與限定組的一個(gè)或多個(gè)規(guī)范堿基雜交（結(jié)合）的堿基。因此， 例如，在參考在存在三種類型的核酸酶抗性的核苷酸和不存在包含相同類型的堿基作為修 飾的核苷酸的核苷酸的情況下延伸的延伸產(chǎn)物的情況下，這意味著例如如果所述修飾的核 苷酸的堿基是腺嘌呤（A)，那么所述核酸酶抗性的核苷酸可以是例如鳥嘌呤（G)、胸腺嘧啶 (T)以及胞嘧啶（C)。這些堿基（其表示四種規(guī)范堿基）各自能夠與所述四種規(guī)范堿基中 的不同的一個(gè)雜交并且因此各自適合作為如本文所定義的不同類型的堿基。作為另一個(gè)實(shí) 例，肌苷堿基主要與腺嘌呤和胞嘧啶（DNA中）配對(duì)，并且因此可被認(rèn)為是與腺嘌呤和胞嘧 啶（分別與胸腺嘧啶和鳥嘌呤配對(duì)的堿基）不同類型的堿基，但不是與鳥嘌呤或胸腺嘧啶 不同類型的堿基（分別與胞嘧啶和腺嘌呤配對(duì)的堿基），因?yàn)轼B嘌呤和胸腺嘧啶的堿基配 對(duì)與肌苷的雜交模式重疊（即，沒有不同）。
[0170] 任何類型的修飾的或替代堿基可用于所公開的方法和組合物中，通常僅受用于使 用這類堿基的酶的能力的限制。許多修飾的和替代核苷酸和堿基是已知的，它們中的一些 在下文和本文的其它地方進(jìn)行了描述。這類修飾的和替代堿基所表示的堿基的類型可通過 如本文所描述的所述堿基的堿基配對(duì)的模式來確定。因此，例如，如果所修飾的核苷酸是腺 嘌呤，那么主要與胸腺嘧啶堿基配對(duì)的任何類似物、衍生物、修飾的或變體堿基將被認(rèn)為是 與腺嘌呤相同類型的堿基。換句話說，只要類似物、衍生物、修飾的或變體具有與另一個(gè)堿 基相同模式的堿基配對(duì)，它就可被認(rèn)為是相同類型的堿基?？蓪?duì)核苷酸的糖基或磷酸酯基 進(jìn)行修飾。通常這類修飾將不會(huì)改變所述堿基的堿基配對(duì)模式。然而，核酸鏈中核苷酸的 堿基配對(duì)模式?jīng)Q定所述核苷酸中堿基的堿基類型。
[0171] 待摻入至延伸產(chǎn)物中并且待通過所公開的方法中的所公開的藥劑選擇性地去除 的修飾的核苷酸可以是任何修飾的核苷酸，所述核苷酸如本文其它地方所描述根據(jù)需要在 所公開的方法中起作用。修飾的核苷酸還可在現(xiàn)有核酸鏈中產(chǎn)生，如通過例如化學(xué)修飾、酶 修飾或組合的延伸產(chǎn)物。
[0172] 許多類型的核酸酶抗性核苷酸是已知的并且可用于所公開的方法中。例如，具有 修飾的磷酸酯基和/或修飾的糖基的核苷酸可以是對(duì)一種或多種核酸酶抗性的。核酸酶抗 性在本文被定義為對(duì)通過任何一種或多種核酸酶從核酸去除是抗性的。通常，特定核苷酸 的核酸酶抗性可就相關(guān)核酸酶而言進(jìn)行定義。因此，例如，如果特定核酸酶用于所公開的方 法中，那么核酸酶抗性的核苷酸僅需要對(duì)所述特定核酸酶是抗性的。有用的核酸酶抗性的 核苷酸的實(shí)例包括硫代修飾的核苷酸和硼烷合修飾的核苷酸。
[0173] 存在多種本文所公開的為基于核酸的分子。這些和其它分子的非限制性實(shí)例在 本文進(jìn)行論述。應(yīng)了解，例如核苷酸是包含堿基部分、糖部分以及磷酸部分的分子。核苷 酸可通過其產(chǎn)生核苷間鍵聯(lián)的磷酸部分和糖部分來連接在一起。核苷酸的堿基部分可為 腺嘌呤-9-基（腺嘌呤，A)、胞嘧啶-1-基（胞嘧啶，C)、鳥嘌呤-9-基（鳥嘌呤，G)、尿嘧 啶-1-基（尿嘧啶，U)以及胸腺嘧啶-1-基（胸腺嘧啶，T)。核苷酸的糖部分是核糖或脫 氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五價(jià)磷酸。核苷酸的非限制性實(shí)例將是3' -AMP(3'-腺苷 單磷酸）或5' -GMP (5'-鳥苷單磷酸）。
[0174] 核苷酸類似物是含有堿基、糖或磷酸部分的某種類型修飾的核苷酸。對(duì)堿基部 分的修飾將包括A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶堿基的天然和合成修飾，如尿嘧 啶-5-基（Ψ)、次黃嘌呤-9-基（肌苷，I)、以及2-氨基腺嘌呤-9-基。修飾的堿基包括 但不限于5-甲基胞嘧啶（5-甲基-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、 腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生 物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿 嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4_硫脲嘧啶、 8_鹵代、8-氨基、8-氫硫基、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵 代，特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基 腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌 呤和3-脫氮腺嘌呤。另外的堿基修飾可例如在美國(guó)專利號(hào)3, 687, 808中找到，所述美國(guó)專 利針對(duì)其堿基修飾的教義整體并入本文。某些核苷酸類似物，如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧 啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔 基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶可增加雙鏈體形成的穩(wěn)定性。經(jīng)常時(shí)基修飾可與例如糖修飾（如 2' -0-甲氧基乙基）組合以便實(shí)現(xiàn)獨(dú)特特性，如增加的雙鏈體穩(wěn)定性。
[0175] 核苷酸類似物還可包括糖部分的修飾。對(duì)糖部分的修飾將包括核糖和脫氧核糖的 天然修飾以及合成修飾。糖修飾包括但不限于在W位置處的以下修飾：0H;F ;0-、S-或 N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0-烷基-0-烷基，其中所述烷基、烯基和炔 基可為取代的或未取代的：Cl至ClO烷基或C2至ClO烯基和炔基。2'糖修飾還包括但不 限于 _〇[(CH2)n 0]m CH3、-0(CH2)n 0CH3、-0(C H2)n NH2、-0(CH2)n CH3、-0(CH2)n-0NH2、 以及-0(CH2)n0N[(C H2)n CH3)]2,其中 n 和 m 是從 I 至約 10。
[0176] 2'位置處的其它修飾包括但不限于：Cl至ClO低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳 基、芳烷基、〇-烷芳基或 〇-芳烷基，SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、 0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、 RNA裂解基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于改進(jìn)寡核苷酸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)或用于 改進(jìn)寡核苷酸的藥效學(xué)特性的基團(tuán)，以及具有類似特性的其它取代基。類似修飾還可在糖 上的其它位置處進(jìn)行，特別是:V端核苷酸上或2' -5'連接型寡核苷酸中的糖的:V位置 和Y端核苷酸的Y位置。修飾的糖還將包括包含在橋接環(huán)氧處的修飾如CH2和S的那 些。核苷酸糖類似物還可具有糖模擬物（如環(huán)丁基部分）以替代戊呋喃糖基糖。
[0177] 核苷酸類似物還可在磷酸部分處進(jìn)行修飾。修飾的磷酸部分包括但不限于那些可 進(jìn)行修飾以使得兩個(gè)核苷酸之間的鍵聯(lián)包含以下的那些：硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亞烷基膦酸 酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、 硫羰氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯以及硼磷酸酯。應(yīng)了解兩個(gè)核苷酸之 間的這些磷酸或修飾的磷酸鍵聯(lián)可通過3' -5'鍵聯(lián)或2' -5'鍵聯(lián)，并且所述鍵聯(lián)可包含反 轉(zhuǎn)的極性如3'-5'至5' -3'或2'-5'至5'-2'。還包括各種鹽、混合鹽以及游離酸形式。
[0178] 應(yīng)了解核苷酸類似物僅需要包含單個(gè)修飾，但還可包含所述部分中的一個(gè)內(nèi)或不 同部分之間的多重修飾。
[0179] 核苷酸取代物是具有與核苷酸類似的功能特性、但不含有磷酸部分的分子，如肽 核酸（PNA)。核苷酸取代物是將以Watson-Crick或Hoogsteen方式來識(shí)別核酸、但通過不 同于磷酸部分的部分連接在一起的分子。在與適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)核酸相互作用時(shí)，核苷酸取代物 能夠符合雙螺旋類型結(jié)構(gòu)。
[0180] 核苷酸取代物是磷酸部分和/或糖部分已經(jīng)被替代的核苷酸或核苷酸類似物。核 苷酸取代物不包含標(biāo)準(zhǔn)磷原子。磷酸的取代物可以是例如，短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵聯(lián)、 混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵聯(lián)、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵聯(lián)。 這些包括具有以下的那些：?jiǎn)徇I聯(lián)（部分由核苷的糖部分形成）；硅氧烷主鏈；硫化 物、亞砜和砜主鏈；甲?；╢ormacetyl)和硫代甲酰基主鏈；亞甲基甲酰基和硫代甲?；?主鏈；含烯烴的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺 主鏈；酰胺主鏈；以及具有混合的N、0、S和CH2組成部分的其它主鏈。
[0181] 還應(yīng)了解在核苷酸取代物中，核苷酸的糖部分和磷酸部分兩者均可通過例如酰 胺類型鍵聯(lián)（氨基乙基甘氨酸）（PNA)被替代。美國(guó)專利5, 539, 082 ;5, 714, 331 ;以及 5, 719, 262教導(dǎo)如何制備和使用PNA分子，所述專利各自以引用的方式并入本文。
[0182] 還有可能將其它類型的分子（綴合物）連接至核苷酸或核苷酸類似物。綴合物可 化學(xué)連接至核苷酸或核苷酸類似物。這類綴合物包括但不限于脂質(zhì)部分，如膽固醇部分、 膽酸、硫醚（例如己基-S-三苯甲基硫醇基）、硫代膽固醇、脂肪族鏈（例如十二烷二醇或 十一烷基殘基）、磷脂（例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1，2-二-0-十六烷基-外消 旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨）、聚胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八烷基胺 或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。
[0183] Watson-Crick相互作用是至少一個(gè)與核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的 Watson-Crick端面的相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的Watson-Crick端 面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的C2、Nl和C6位置，和基于嘧啶 的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的C2、N3、C4位置。
[0184] Hoogsteen相互作用是在核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen端面上發(fā)生的相互 作用，所述端面暴露于雙鏈DNA的大溝中。Hoogsteen端面包括噪呤核苷酸的C6位置處的 N7位置和反應(yīng)性基團(tuán)（NH2或0)。
[0185] 雜交/選擇性雜交
[0186] 術(shù)語雜交通常意指至少兩個(gè)核酸分子如引物或探針與基因之間的序列驅(qū)動(dòng)的相 互作用。序列驅(qū)動(dòng)的相互作用意指以核苷酸特異性方式在兩個(gè)核苷酸或核苷酸類似物或核 苷酸衍生物之間發(fā)生的相互作用。例如，G與C相互作用或A與T相互作用是序列驅(qū)動(dòng)的相 互作用。通常序列驅(qū)動(dòng)的相互作用在核苷酸的Watson-Crick端面或Hoogsteen端面上發(fā) 生。兩種核酸的雜交受本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多個(gè)條件和參數(shù)影響。例如，鹽濃度、pH以 及反應(yīng)溫度都影響兩個(gè)核酸分子是否將會(huì)雜交。
[0187] 用于兩個(gè)核酸分子之間的選擇性雜交的參數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，在 一些實(shí)施方案中，選擇性雜交條件可以被定義為嚴(yán)格雜交條件。例如，雜交的嚴(yán)格度受雜交 步驟和洗滌步驟中的任一者或兩者的溫度和鹽濃度兩者控制。例如，用于實(shí)現(xiàn)選擇性雜交 的雜交條件可涉及在低于Tm(-半分子從其雜交配偶體解離的解鏈溫度）約12°C至25°C 的溫度下在高離子強(qiáng)度溶液SSC或6X SSPE)中雜交，接著在所選擇的溫度和鹽濃度的 組合下洗滌，以使得洗滌溫度是低于Tm約5°C至20°C。溫度和鹽條件可憑初步實(shí)驗(yàn)中的經(jīng) 驗(yàn)容易地確定，在初步實(shí)驗(yàn)中，使固定在濾膜上的參考DNA的樣品與標(biāo)記的目標(biāo)核酸雜交， 并且然后在不同的嚴(yán)格度條件下洗滌。對(duì)于DNA-RNA和RNA-RNA雜交來說，雜交溫度通常 較高。所述條件可如以上所描述來使用以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格度，或如本領(lǐng)域所已知。用于DNA=DNA 雜交的優(yōu)選嚴(yán)格雜交條件可以是在約68°C下（在水溶液中）在6X SSC或6X SSPE中，接著 在68°C下洗滌。如果需要，雜交和洗滌的嚴(yán)格度可隨著減少所需的互補(bǔ)性程度而相應(yīng)地降 低，并且進(jìn)一步取決于其中搜索變異性的任何區(qū)域的G-C或A-T豐度。同樣，如果需要，雜 交和洗滌的嚴(yán)格度可隨著所需的同源性增加而相應(yīng)地增加，并且進(jìn)一步取決于其中需要高 同源性的任何區(qū)域的G-C或A-T豐度，均如本領(lǐng)域所已知。
[0188] 用于定義選擇性雜交的另一種方式是通過查看所述核酸中的一種與另一種核酸 結(jié)合的量（百分比）。例如，在一些實(shí)施方案中，選擇性雜交條件將是當(dāng)至少約60、65、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100百分比的限制性核酸與非限制性核酸結(jié)合時(shí)。通常，非限制性引物是呈例 如10或100或1000倍過量。這種類型的測(cè)定可在以下條件下進(jìn)行，其中限制性和非限制 性引物兩者均是例如低于其k d10倍或100倍或1000倍，或其中所述核酸分子中的僅一個(gè) 是10倍或100倍或1000倍或其中一個(gè)或兩個(gè)核酸分子高于其k d。
[0189] 用于定義選擇性雜交的另一種方式是通過查看在雜交被要求促進(jìn)所需的酶操作 的條件下得到酶操作的引物的百分比。例如，在一些實(shí)施方案中，選擇性雜交條件將是當(dāng)至 少約 60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的引物在促進(jìn)酶操作的條件下進(jìn)行酶操作時(shí)，例如 如果酶操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件將是當(dāng)至少約60、65、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 百 分比的引物分子被延伸時(shí)。條件還包括由制造商建議的或本領(lǐng)域中所指示的如對(duì)于進(jìn)行操 作的酶來說適當(dāng)?shù)哪切?br> [0190] 正如同源性一樣，應(yīng)了解存在多種本文所公開的方法用于確定兩個(gè)核酸分子之間 的雜交水平。應(yīng)了解這些方法和條件可提供兩個(gè)核酸分子之間的不同百分比的雜交，但除 非另外指明，否則滿足任何方法的參數(shù)將是足夠的。例如，如果需要80%雜交并且只要雜交 在這些方法中的任一種中的所要求的參數(shù)內(nèi)發(fā)生，那么它被認(rèn)為是本文所公開的。
[0191] 應(yīng)了解，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如果組合物或方法滿足用于一起或單獨(dú)地確定雜交 的這些標(biāo)準(zhǔn)中的任一個(gè)，那么它就是本文所公開的組合物或方法。
[0192] 試劑盒
[0193] 本文公開被抽入至可用于實(shí)踐本文所公開的方法的試劑的試劑盒。具體地說，所 述試劑盒可包括本文所討論的或?qū)⒈焕斫鉃槭菍?shí)踐所公開的方法中所要求的或有益的任 何試劑或試劑的組合。例如，所述試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)本文所公開的引物以便進(jìn)行在 所述方法的某些實(shí)施方案中所討論的延伸、復(fù)制和擴(kuò)增反應(yīng)；以及如所意圖地使用所述引 物所需的緩沖液和酶。
[0194] 應(yīng)了解為了檢測(cè)ROSl相關(guān)融合，可使用與野生型ROSl雜交的反向引物。因此，本 文公開包括至少一個(gè)反向引物的試劑盒，其中所述反向引物與野生型ROSl的一部分如野 生型ROSl的激酶結(jié)構(gòu)域雜交。另外，應(yīng)了解本文所公開的試劑盒可包括與ROSl和/或野 生型ROSl的融合配偶體特異性地雜交的一個(gè)或多個(gè)正向引物。因此，例如，正向引物可與 野生型ROSl雜交，如ROSl融合的斷裂點(diǎn)區(qū)域（即，融合斷裂點(diǎn)的3'）、CD74、FIG、SLC34A2 或其它融合配偶體外部的ROSl序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解適合的是具有包括多于單 個(gè)引物或引物對(duì)并且可包括例如單個(gè)反向引物如SEQ ID NO :5、8、12、14、15、18或21和多 個(gè)正向引物的試劑盒?；蛘?，試劑盒可包括用于融合斷裂點(diǎn)（即，融合斷裂點(diǎn)的3'）外部 的野生型ROSl的引物對(duì)和用于ROSl激酶的引物對(duì)。試劑盒可進(jìn)一步包括與野生型ROSl、 ⑶74、FIG、SLC34A2特異性地雜交的一個(gè)或多個(gè)正向引物和/或一個(gè)或多個(gè)反向引物。
[0195] 因此，一方面，本文公開用于診斷ROSl相關(guān)癌癥或確定癌癥對(duì)于治療的易感性或 用于癌癥的治療的適合性的試劑盒，所述試劑盒包括（a)用第一檢測(cè)試劑標(biāo)記的第一引 物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是與編碼SEQ ID NOl的氨基酸序列 的第一多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸；以及（b)至少一個(gè)第二引物， 其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是與編碼野生型ROSl的第二多核苷酸 雜交的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。
[0196] 本文還公開包括與ROSl的E⑶（例如SEQ ID NO : 13和20)特異性地結(jié)合的一個(gè) 或多個(gè)正向引物的試劑盒。還公開包括與ROSl激酶結(jié)構(gòu)域（例如SEQ ID NO :4、7、15或 17)特異性地結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)正向引物的試劑盒。應(yīng)了解試劑盒可包括對(duì)于ROSl的ECD 和激酶結(jié)構(gòu)域具有特異性的一個(gè)或多個(gè)正向引物。還公開進(jìn)一步包括對(duì)于ROSl的E⑶（例 如，SEQ ID NO :14和21)具有特異性的一個(gè)或多個(gè)反向引物的試劑盒。還公開包括與ROSl 激酶結(jié)構(gòu)域（例如SEQ ID NO :5、8、12、16以及18)特異性地結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)反向引物的 試劑盒。還公開包括對(duì)于ROSl的ECD和激酶結(jié)構(gòu)域具有特異性的一個(gè)或多個(gè)反向引物的 組合的試劑盒。應(yīng)進(jìn)一步了解本文所公開的任何一個(gè)或多個(gè)正向引物可在試劑盒中與一個(gè) 或多個(gè)反向引物進(jìn)行組合。因此，本文公開包括一個(gè)或多個(gè)正向引物例如像ROSl特異性正 向引物（SEQ ID NO :4、7、13、15、17或20)和/或一個(gè)或多個(gè)ROSl特異性反向引物（SEQ ID N0:5、8、12、14、16、18 以及 21)的試劑盒。
[0197] 本文還公開包括一個(gè)或多個(gè)多核苷酸探針的試劑盒，其中所述一個(gè)或多個(gè)探針的 是約20至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)并且包括在其一端上的報(bào)道染料和在其另一端上的淬滅染料， 例如像 SEQ ID N0:6、9、19 或 22。
[0198] 應(yīng)了解所公開的試劑盒還可包括對(duì)照物以便確保本文所公開的方法是適當(dāng)起作 用的并且以便標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定之間的結(jié)果。因此，例如，本文公開陽性cDNA對(duì)照物、陰性cDNA對(duì) 照物以及對(duì)照引物對(duì)。例如，所公開的試劑盒可包括用于檢測(cè)以下各項(xiàng)的對(duì)照引物對(duì)：智人 ATP合酶、H+轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體的Fl復(fù)合物、O亞單位（ATP50)、編碼線粒體蛋白mRNA的核基因； 智人NADH脫氫酶（泛醌）1 α亞復(fù)合物、2,8kDa (NDUFA2)、mRNA ;智人甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（GAPDH)、mRNA ;智人H3組蛋白、家族3A(H3F3A)、mRNA ;智人蛋白酶體（前體，巨蛋白因 子）亞單位、β類型、4(PSMB4)、mRNA ;智人核糖體蛋白S27a(RPS27A)、轉(zhuǎn)錄物變體UmRNA ; 智人真核翻譯起始因子4A、同種型2 (EIF4A2)、mRNA ;智人核糖體蛋白L18 (RPL18)、mRNA ;智 人腺苷脫氨酶、RNA-特異性（ADAR)、轉(zhuǎn)錄物變體1、mRNA ;或智人細(xì)胞色素 c氧化酶亞單位 Vb (C0X5B)、mRNA。引物對(duì)的實(shí)例包括但不限于表1中所找到的引物對(duì)。
[0199]表 1
【權(quán)利要求】
1. 一種診斷患有癌癥的受試者中R0S1相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括從所述受試者 獲得組織樣品，從所述組織樣品分離核酸，對(duì)所述核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增過程，以及檢測(cè)所述組 織樣品中與野生型R0S1和R0S1激酶結(jié)構(gòu)域兩者之一或兩者的組合相關(guān)的核酸的存在或測(cè) 量所述核酸的量，其中擴(kuò)增子相對(duì)于正常對(duì)照物的增加或擴(kuò)增子的存在指示所述受試者患 有R0S1相關(guān)癌癥。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中來自所述組織樣品的所述核酸是RNA，其中所述方法 進(jìn)一步包括從所述RNA樣品合成cDNA，并且其中所述方法包括對(duì)所述cDNA進(jìn)行PCR。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增過程是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述RT-PCR是實(shí)時(shí)RT-PCR。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述實(shí)時(shí)RT-PCR采用與具有所述實(shí)時(shí)RT-PCR的產(chǎn) 物的序列互補(bǔ)的探針，并且其中所述探針具有在其一端上的報(bào)道染料和在其另一端上的淬 滅染料。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述探針選自由SEQ ID NO :6、9、19、或22組成的 組。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增過程是實(shí)時(shí)PCR。
8. 如權(quán)利要求2、3或7所述的方法，其中所述PCR、RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)包括使用 與野生型R0S1序列特異性地雜交的正向和反向引物對(duì)以及與野生型R0S1激酶結(jié)構(gòu)域序列 特異性地雜交的正向和反向引物對(duì)。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中至少一個(gè)反向引物SEQ ID NO. 5、8、12、14、15、18或 21。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中至少一個(gè)正向引物包含SEQ ID NO :4、7、13、15、17 或20。
11. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中至少一個(gè)正向引物與野生型R0S1的細(xì)胞外區(qū)域雜 交。
12. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述正向引物是SEQ ID NO :13或20。
13. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)包括使用能夠與R0S1 激酶結(jié)構(gòu)域特異性地雜交的正向。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述正向引物是SEQ ID NO :4、7、15或17。
15. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述反向引物或所述野生型R0S1和所述R0S1激酶 是同一引物。
16. 如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括確定野生型R0S1和野生型R0S1激 酶的循環(huán)閾值（Ct)值；其中野生型R0S1相對(duì)于R0S1激酶的高（Ct)值指示融合的存在。
17. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括與所述融合斷裂點(diǎn)的R0S1融合配偶體5' 結(jié)合的正向引物和與所述融合斷裂點(diǎn)的R〇S 13 '結(jié)合的反向引物，其中所述引物延伸穿過所 述融合，其中檢測(cè)到具有R0S1核酸和融合配偶體核酸兩者的擴(kuò)增子的存在指示融合的存 在。
18. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括 a)使用與R0S1融合配偶體結(jié)合的正向引物的第一擴(kuò)增反應(yīng)；其中來自所述第一反應(yīng) 的所述擴(kuò)增子用作第二擴(kuò)增反應(yīng)的模板； b) 在所述第一反應(yīng)之后的第二擴(kuò)增反應(yīng)，其中對(duì)于所述融合斷裂點(diǎn)的R0S1序列3'具 有特異性的引物用于所述第二擴(kuò)增反應(yīng)中；以及 c) 檢測(cè)來自所述第二反應(yīng)的所述擴(kuò)增子中R0S1的存在；其中在來自所述第二反應(yīng)的 所述擴(kuò)增子中檢測(cè)到R0S1指示R0S1融合的存在。
19. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥選自由以下各項(xiàng)組成的組：成神經(jīng)細(xì)胞 瘤、乳癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管鱗狀細(xì)胞癌、間 變性大細(xì)胞淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、炎性肌纖維母細(xì)胞瘤、惡性組織細(xì)胞增生癥、膽管癌、腎 癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
20. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括隨后通過向被鑒別為患有R0S1相 關(guān)癌癥的受試者施用ROS1抑制劑來治療所述受試者。
21. -種診斷受試者中ROS1相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括將細(xì)胞中的核酸與和ROS1 激酶雜交的第一探針和與ROS1的所述融合斷裂點(diǎn)的ROS1序列3'雜交的第二探針相接觸； 其中所述探針被不同地標(biāo)記；其中檢測(cè)到由分離的探針?biāo)甘镜钠茐牡幕蜃甘綬OS1 融合的存在，所述ROS1融合的存在指示ROS1相關(guān)癌癥的存在。
22. -種用于診斷ROS1相關(guān)癌癥的試劑盒，所述試劑盒包括（a)用第一檢測(cè)試劑標(biāo)記 的第一引物，其中所述第一引物是反向引物，其中所述反向引物是與編碼SEQ ID NO 1的氨 基酸序列的第一多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸；以及（b)至少一個(gè)第 二引物，其中所述第二引物是正向引物，其中所述正向引物是與編碼野生型R〇S 1的第二多 核苷酸雜交的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。
23. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述正向引物與野生型R0S1的細(xì)胞外區(qū)域特異 性地雜交。
24. 如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述正向引物是SEQ ID NO :13或20。
25. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述正向引物與所述R0S1激酶結(jié)構(gòu)域特異性地 雜父。
26. 如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述正向引物是SEQ ID NO :4、7、15或17。
27. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括第二正向引物和第二反向引 物。
28. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述反向引物是SEQ ID NO :5、8、12、14、16、18 或21。
29. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述第一正向引物和第一反向引物與野生型 R0S1的所述激酶結(jié)構(gòu)域特異性地雜交并且所述第二正向引物和第二反向引物與野生型 R0S1特異性地雜交。
30. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括對(duì)照引物對(duì)。
31. 如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述對(duì)照引物對(duì)與C0X5B特異性地雜交。
32. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述第一引物和所述第二引物分別用第一檢測(cè) 試劑和第二檢測(cè)試劑標(biāo)記。
33. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括多核苷酸探針，其中所述探 針是約20至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)并且包含在其一端上的報(bào)道染料和在其另一端上的淬滅染 料。
34.如權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述多核苷酸探針包含如SEQ ID NO :6、9、19或 22中所提出的序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104364391SQ201380013401
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月8日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·豪特, 約翰·漢德舒 申請(qǐng)人:因賽特遺傳學(xué)公司