使用可裂解探針復合檢測慢性粒細胞性白血病基因的方法
【專利摘要】一個具體的實施例的一種形式提供了用于檢測慢性粒細胞性白血病基因表達的量的檢測試劑盒，包含特異性地結(jié)合至慢性粒細胞性白血病基因的一對引物，以及可裂解探針，其特異性地結(jié)合至由該一對引物擴增的慢性粒細胞性白血病擴增產(chǎn)物之內(nèi)。在另一個具體的實施例中，通過使用根據(jù)該一個具體的實施例的檢測試劑盒測量樣品中慢性粒細胞性白血病基因表達的量。當使用根據(jù)該具體的實施例的方法時，可以有效地實時檢測甚至是處于低濃度下的慢性粒細胞性白血病基因表達的量，并因此在慢性粒細胞性白血病的診斷和預(yù)后方面可以是有用的。
【專利說明】使用可裂解探針復合檢測慢性粒細胞性白血病基因的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及慢性粒細胞性白血病基因診斷試劑盒和使用該試劑盒的診斷方法。更 具體地，本發(fā)明涉及通過使用引物組和可裂解探針使得能夠?qū)崟r地檢測基因的試劑盒，以 及使用該試劑盒的診斷方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 白血病泛指其中白細胞瘤性（neoplastically)增殖的所有疾病。根據(jù)白細胞起 源的白細胞，白血病被分為"粒細胞性白血?。ㄋ杓毎园籽。琺yelogenous leukemia)" 和"淋巴性白血?。馨图毎园籽?，lymphatic leukemia)",或根據(jù)進展速度，白血病 被分為急性白血病和慢性白血病。根據(jù)疾病的類型和所侵襲的細胞的特征，白血病的臨床 類型（臨床證型，clinical pattern)不同。淋巴性白血病是由淋巴性血細胞的突變引起 的，粒細胞性白血病是由粒細胞性（骨髓性，myelogenous)血細胞的突變引起的，而慢性粒 細胞性白血?。–ML)是由成熟細胞的突變引起的，換言之，由多能造血干細胞的惡性克隆 引起的。急性粒細胞性白血病是由成髓性干細胞（myeloblastic stem cell)從血細胞生 成的早期階段開始分化的缺陷引起的。
[0003] 在這些不同類型的白血病中，CML是其中成髓性細胞（原始粒細胞，myeloblast cell)在骨髓中增殖并侵襲外周血或其他器官的惡性血惡液質(zhì)（hematodyscrasia)，并且 CML在成人中的發(fā)病率很高。診斷CML最重要的事情是通過進行染色體檢驗來檢測費城染 色體，其獲得在95%或更多的患者中的陽性結(jié)果。
[0004] 已經(jīng)查明CML的多種病因，但CML的最常見病因是染色體易位。特別是，已知9 號染色體和22號染色體的易位為CML的主要病因。實踐中，在約95%的CML患者中發(fā)現(xiàn) 了 9號染色體和22號染色體的相互（reciprocal)易位。該相互易位由位于9號染色體 的q34區(qū)域的abl (Abelson癌基因）基因的一部分轉(zhuǎn)移至位于22號染色體的qll. 2區(qū)域 的bcr(斷裂點簇區(qū)，breakpoint cluster region)基因形成的。此重排被稱為BCR-ABL 重排。對于由BCR-ABL重排引起的CML，以Glivec?的商品名市售的藥物甲磺酸伊馬替尼 (imatinibmesylate)具有優(yōu)異的治療效果。因此，BCR-ABL重排的早期診斷在患者治療方 案的決定和預(yù)后中非常重要。
[0005] 為檢測BCR-ABL重排，通常使用使BCR-ABL融合基因的重組程度量化的 方法。目前開展了大量研究以開發(fā)以更方便的方式使BCR-ABL融合基因的重組程 度量化的方法。例如，開發(fā)了使用FISH(熒光原位雜交法）的診斷方法（Tkachuk et al·，Science, 250 (4980) : 559-562, 1990)、使用體細胞 DNA 的 PCR 的方法 (Dobrovic et al·，Blood, 72(6):2063-2065, 1998)、使用 RT-PRC 的方法（Lee et al.，Blood, 73(8):2165-2170, 1989)以及使用巢式 PCR(nested PCR)的方法（Hessner et al. , Genet. Anal. Tech. Appl. , 11 (4) :90-94, 1994) 〇
[0006] 然而，以上列出的方法中，基于FISH的方法是用于直接檢測其中已經(jīng)發(fā)生 BCR-ABL重排的單個細胞，并且因此，基于FISH的方法不允許早期檢測CML。RT-PCR方法 具有較高的靈敏度，但需要細胞遺傳學方法，因為它通常難以設(shè)計出允許診斷患有非常罕 見的CML患者的引物組。出于上述原因，在疑似患有CML的患者的情況下，在診斷的早期進 行多種細胞遺傳學方法。然而，細胞遺傳學方法包括許多限制：只有在骨髓白細胞的細胞周 期到達"中期（metaphase) "時才能進行細胞遺傳學方法，需要滿足各種條件如增殖細胞的 提取和培養(yǎng)，并且需要足夠的增殖細胞數(shù)量等。此外，常規(guī)的RT-PCR法是復雜的，因為根據(jù) BCR-ABL基因的類型應(yīng)當進行獨立的反應(yīng)用于分析BCR-ABL基因。因此，通過改進傳統(tǒng)的方 法，已經(jīng)研究了在診斷CML中可能是更加有用的檢測方法。其結(jié)果是，開發(fā)了根據(jù)本發(fā)明的 使用可裂解探針的檢測試劑盒和使用其的診斷方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因斷裂點的試劑盒，其 中，該試劑盒包含引物組和可裂解探針，其使得能夠特異性地擴增BCR-ABL融合基因斷裂 點。
[0009] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了診斷慢性粒細胞性白血病的方法，其中，該方法 使用引物組和可裂解探針，其使得能夠特異性地擴增BCR-ABL融合基因斷裂點。
[0010] 技術(shù)方案
[0011] 本發(fā)明的一個方面提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的試劑盒， 其中，該試劑盒包含至少一個引物組以及可裂解探針，其使得能夠特異性地擴增BCR-ABL 融合基因的el9a2斷裂點。
[0012] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的檢測 試劑盒，其中，該試劑盒包含：包括含有SEQ ID NO: 1的核酸的引物和含有SEQ ID N0:2的 核酸的引物的第一引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0013] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的檢 測試劑盒，其中，該試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物和含有SEQ ID N0:4 的核酸的引物的第二引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0014] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了一種用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂 點的檢測試劑盒，其中，該試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物和含有SEQ ID N0:6的核酸的引物的第三引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0015] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了一種用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂 點的檢測試劑盒，其中，該試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:7的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的引物的第四引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0016] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了一種用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂 點的檢測試劑盒，其中，該試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 10的核酸的引物的第五引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0017] 本文所用的術(shù)語"引物"可以與"寡核苷酸"或"多核苷酸"互換地使用。引物是指 一種寡核苷酸，其在PCR中可作為DNA合成的起點。引物通常包括約15至約35個核苷酸 并與靶序列的互補區(qū)雜交。
[0018] 本文使用的術(shù)語"探針"指的是特異性地結(jié)合至靶序列的寡核苷酸，并且包括，例 如，含有特定區(qū)域的多核苷酸，該特定區(qū)域被設(shè)計為通過序列特異性的方法與特定核酸序 列（如靶核酸序列）的互補區(qū)域雜交。在本發(fā)明的一個實施方式中，寡核苷酸探針包含約 15至約60個核苷酸。適當?shù)?，寡核苷酸探針包含約18至約30個核苷酸。
[0019] 本文使用的術(shù)語"可裂解探針（可斷裂探針，cleavable probe) "是指包括兩種類 型的核酸的探針，例如，在DNA探針的內(nèi)部包括一些RNA核苷酸的DNA探針。
[0020] 可以使用可以互補結(jié)合至共同（commonly)存在于以下中的序列的任何序列作為 可裂解探針的序列：通過使用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6擴增的擴 增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8擴增的擴增產(chǎn)物以及通過使用SEQ ID N0:9 和SEQ ID NO: 10擴增的擴增產(chǎn)物。
[0021] 可裂解探針可以包括其中約1至10個DNA核苷酸被RNA核苷酸取代、其中約2至 8個DNA核苷酸被RNA核苷酸取代或者其中約3至7個DNA核苷酸被RNA核苷酸取代的內(nèi) 部區(qū)域，但不限于此。此外，RNA核苷酸可以連續(xù)地或不連續(xù)地定位在探針內(nèi)?？闪呀馓结?可以是含有SEQ ID N0:33的多核苷酸的探針。
[0022] 此外，可裂解探針在探針的兩端或內(nèi)部可以標記有可檢測物質(zhì)。用于PCR的混合 物包含RNA酶（RNase酶，核糖核酸酶），其可特異性地切割RNA-DNA雙鏈的RNA序列部分。 在由RNA酶切割后，可裂解探針的所有片段在反應(yīng)溫度下從靶擴增子解離并散布在反應(yīng)溶 液中。由于探針中經(jīng)標記的供體和受體被分離，可以監(jiān)測由供體的熒光發(fā)射。
[0023] 本文使用的術(shù)語"標記（標簽，label)"或"可檢測標記"指的是通過共價鍵或非 共價鍵結(jié)合至探針的熒光染料化合物，并且可以是包括熒光供體和熒光受體的熒光共振能 量轉(zhuǎn)移（FRET)對。
[0024] 本文使用的術(shù)語"熒光染料（熒光物，fluorochrome) "是指由具有短于所發(fā)射的 光波長的波長的光激發(fā)后發(fā)光的熒光化合物。此外，術(shù)語"熒光供體"是指發(fā)射由本發(fā)明中 公開的測定法測量的光的熒光染料。此外，熒光供體可以提供由熒光受體吸收的光。本文 使用的術(shù)語"熒光受體"是指吸收從熒光供體發(fā)射的能量的二級熒光染料或猝滅劑。二級 熒光染料吸收從熒光供體發(fā)射的能量并且隨后發(fā)射具有長于由熒光供體發(fā)射的光的波長 的波長的光。猝滅劑吸收從熒光供體發(fā)射的能量。
[0025] 任何發(fā)光分子，適當?shù)兀瑹晒馊玖虾?或猝滅劑，都可以在本發(fā)明的實施方式中 使用。例如，發(fā)光分子可以是 Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、7_ 二乙氛基香?素 _3_ 竣 酸、突光素 、Oregon Green 488、Oregon Green 514、四甲基若丹明、若丹明X、德克薩斯紅 (Texas Red)染料、QSY 7、QSY33、Dabcyl、B0DIPY FL、B0DIPY 630/650、B0DIPY6501665、 B0DIPY TMR-X、B0DIPY TR-X、二烷基氨基香豆素、Cy3(青色素 3)、Cy3. 5、Cy5. 5、Cy5、 DTPA(Eu3+)-AMCA以及TTHA(Eu3+)AMCA，但不限于此。適當?shù)?，發(fā)光分子可以是包括6-FAM 和愛荷華黑BQ(Iowa Black BQ)的FRET對，但不限于此。
[0026] 此外，用于檢測c-Met基因的試劑盒可以進一步含有熱穩(wěn)定聚合酶或RNA酶，并且 包含在試劑盒中的酶可以是熱穩(wěn)定聚合酶及熱穩(wěn)定RNA酶。
[0027] 在本文中使用并應(yīng)用于酶的術(shù)語"熱穩(wěn)定的"，是指酶在升高的溫度（如55°C或 更高）下、或在重復加熱和冷卻的循環(huán)中保持生物活性。熱穩(wěn)定的多核苷酸聚合酶可以尤 適用于PCR擴增反應(yīng)。在本發(fā)明的實施方式中，熱穩(wěn)定的多核苷酸聚合酶可以是Taq聚合 酶。熱穩(wěn)定的多核苷酸聚合酶可以是選自由AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel片段、SuperTaq、 SuperTaq plus、LA Taq、LApro Taq以及EX Taq組成的組中的Taq聚合酶。此外，在本文 中使用的術(shù)語"RNA酶"是指特異性切割RNA的酶。RNA可以是雙鏈RNA，其可以是由RNA和 DNA的雜交形成的雜交雙鏈。
[0028] 此外，試劑盒可以提供為包括具有一種或多種試劑的包裝單元（package unit)的 試劑盒。試劑盒可以包括選自由以下物品組成的組中的至少一種：緩沖液、操作指南和陽性 或陰性對照組。試劑盒可以包括以適當比例混合以完成本文所描述的方法的試劑的容器。 該試劑容器適當?shù)匕▎挝粩?shù)（unit number)的試劑以省略完成該方法時的衡量（計量， measuring)。在本發(fā)明的另一各實施方式中，試劑盒進一步包括用于從生物學樣品提取基 因組DNA或RNA的試劑。此外，試劑盒試劑可以包括用于逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析的試劑。
[0029] 用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的試劑盒可以包含選自由第一引物組 至第五引物組組成的組中的一個引物組以鑒定el9a2斷裂點，但也可以包含所有五個引物 組以提商精確度。
[0030] 本發(fā)明的另一個方面提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的e 13a2、e 14a2、e 13a3或 el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含引物組以及可裂解探針，其使得能夠特異性地擴 增BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3或el4a3斷裂點。
[0031] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3 或el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID NO: 11的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:12的核酸的引物的第六引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0032] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3 或el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:13的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:14的核酸的引物的第七引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0033] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3 或el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:15的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:16的核酸的引物的第八引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0034] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3 或el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:17的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:18的核酸的引物的第九引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0035] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3 或el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:19的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:20的核酸的引物的第十引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0036] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3 或el4a3斷裂點的試劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:21的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:22的核酸的引物的第i^一引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0037] 用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3或el4a3斷裂點的試劑盒可以 包含選自由第六引物組至第十一引物組組成的組中的一個引物組以鑒定斷裂點，但也可以 包含所有六個引物組以提高精確度。
[0038] 可以使用可以互補結(jié)合至共同存在于以下中的序列的任何序列作為可裂解探針 的序列：通過使用SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID N0:13 和SEQ ID NO: 14擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16擴增的擴增產(chǎn) 物、通過使用SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20擴增的擴增產(chǎn)物以及通過使用SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22擴增的擴增產(chǎn) 物。可裂解探針可以是含有SEQ ID N0:33的多核苷酸的探針。
[0039] 本發(fā)明的另一個方面提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試劑 盒，其中，試劑盒包含引物組和可裂解探針，其使得能夠特異性地擴增BCR-ABL融合基因的 ela2斷裂點。
[0040] 本發(fā)明的一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試劑 盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:23的核酸的引物和含有SEQ ID N0:24的核酸 的引物的第十二引物組；以及SEQ ID NO: 33的可裂解探針。
[0041] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試 劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:25的核酸的引物和含有SEQ ID N0:26的核 酸的引物的第十三引物組；以及SEQ ID NO: 33的可裂解探針。
[0042] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試 劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:27的核酸的引物和含有SEQ ID N0:28的核 酸的引物的第十四引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0043] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試 劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:29的核酸的引物和含有SEQ ID N0:30的核 酸的引物的第十五引物組；以及SEQ ID N0:33的可裂解探針。
[0044] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試 劑盒，其中，試劑盒包含：包括含有SEQ ID N0:31的核酸的引物和含有SEQ ID N0:32的核 酸的引物的第十六引物組；以及SEQ ID NO: 33的可裂解探針。
[0045] 用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試劑盒可以包含選自由第十二引物 組至第十六引物組所組成的組中的一個引物組，但也可以包含所有五個引物組以提高精確 度。
[0046] 可以使用可以互補結(jié)合至共同存在于以下中的序列的任何序列作為可裂解探針 的序列：通過使用SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID N0:25 和SEQ ID NO: 26擴增的擴增產(chǎn)物、通過使用SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28擴增的擴增產(chǎn) 物、通過使用SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30擴增的擴增產(chǎn)物以及通過使用SEQ ID N0:31 和SEQ ID NO:32擴增的擴增產(chǎn)物。可裂解探針可以是含有SEQ ID NO:33的多核苷酸的探 針。
[0047] 本發(fā)明的另一個方面提供了用于檢測CML基因的復合試劑盒（多重試劑盒， multiplex kit)，其中，試劑盒包含第一引物組至第十六引物組和可裂解探針。
[0048] 為了檢測CML，可以使用選自由第一引物組至第十六引物組組成的組中的一個引 物組。然而，由于易位發(fā)生在CML的不同區(qū)域，CML具有多種斷裂點。因此，為了更精確的 檢測，用于檢測CML基因的試劑盒可以包含包括以下的所有引物組：能夠檢測el9a2斷裂點 的引物組，能夠檢測el3a2、el4a2、el3a3或el4a3斷裂點的引物組以及能夠檢測ela2斷裂 點的引物組。換言之，用于檢測CML基因的試劑盒可以適當?shù)匕ǎ哼x自由第一引物組至第 五引物組成的組中的一個引物組、選自由第六引物組至第i^一引物組組成的組中的一個引 物組以及選自由第十二引物組至第十六引物組組成的組中的一個引物組。
[0049] 此外，能夠擴增CML基因的可裂解探針并不限于特定的序列，只要該序列可特異 性結(jié)合至由引物組所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物即可?？闪呀馓结樋梢允呛蠸EQ ID N0:33的多核 苷酸的探針。
[0050] 引物組可以進一步含有熱穩(wěn)定聚合酶或RNA酶。
[0051] 本發(fā)明的另一個方面提供了通過使用用于檢測CML基因的試劑盒檢測CML基因的 復合方法（多重方法，multiplex method)，其中，試劑盒包含第一引物組至第十六引物組和 可裂解探針。
[0052] 本發(fā)明的一個實施方式提供了檢測CML基因的復合方法，包括：從樣品獲取DNA ; 使至少一個引物組、SEQ ID N0:33的可裂解探針和所獲得的DNA樣品混合以制備混合樣 品，其中，至少一個引物組選自由以下組成的組中：包括含有SEQ ID N0:1的核酸的引物和 含有SEQ ID N0:2的核酸的引物的第一引物組；包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物和含 有SEQ ID N0:4的核酸的引物的第二引物組；包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物和含 有SEQ ID N0:6的核酸的引物的第三引物組；包括含有SEQ ID N0:7的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:8的核酸的引物組成第四引物組；包括含有SEQ ID N0:9的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:10的核酸的引物的第五引物組；包括含有SEQ ID N0:11的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:12的核酸的引物的第六引物組；包括含有SEQ ID N0:13的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:14的核酸的引物的第七引物組；包括含有SEQ ID N0:15的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:16的核酸的引物的第八引物組；包括含有SEQ ID N0:17的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:18的核酸的引物的第九引物組；包括含有SEQ ID N0:19的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:20的核酸的引物的第十引物組；包括含有SEQ ID N0:21的核酸的引物和含有 SEQ ID N0:22的核酸的引物的第i^一引物組；包括含有SEQ ID N0:23的核酸的引物和含 有SEQ ID N0:24的核酸的引物的第十二引物組；包括含有SEQ ID N0:25的核酸的引物和 含有SEQ ID N0:26的核酸的引物的第十三引物組；包括含有SEQ ID N0:27的核酸的引物 和含有SEQ ID N0:28的核酸的引物的第十四引物組；包括含有SEQ ID N0:29的核酸的引 物和含有SEQ ID N0:30的核酸的引物的第十五引物組；包括含有SEQ ID N0:31的核酸的 引物和含有SEQ ID N0:32的核酸的引物的第十六引物組；使聚合酶、RNA酶和擴增緩沖液 與混合樣品混合以擴增DNA ;和檢測由探針上的標記發(fā)出的信號的增加。
[0053] 檢測CML基因的復合方法詳細說明如下。
[0054] 首先，檢測CML基因的復合方法可以包括從樣品獲得DNA。樣品可以獲自CML患者 和想要經(jīng)歷CML發(fā)展的診斷的人。此外，樣品可以直接地取自特定的人體部位。
[0055] 隨后，檢測CML基因的復合方法可以包括使至少一個引物組、SEQ ID N0:33的可裂 解探針以及獲得的DNA樣品混合以制備混合樣品，其中，至少一個引物組選自由以下組成 的組中：包括含有SEQ ID NO: 1的核酸的引物和含有SEQ ID N0:2的核酸的引物的第一引 物組；包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物和含有SEQ ID N0:4的核酸的引物的第二引物 組；包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物和含有SEQ ID N0:6的核酸的引物的第三引物組； 包括含有SEQ ID N0:7的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的引物的第四引物組；包 括含有SEQ ID N0:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 10的核酸的引物的第五引物組；包括 含有SEQ ID NO: 11的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 12的核酸的引物的第六引物組；包括 含有SEQ ID NO: 13的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 14的核酸的引物的第七引物組；包括 含有SEQ ID NO: 15的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 16的核酸的引物的第八引物組；包括 含有SEQ ID NO: 17的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 18的核酸的引物的第九引物組；包括 含有SEQ ID NO: 19的核酸的引物和含有SEQ ID N0:20的核酸的引物的第十引物組；包括 含有SEQ ID N0:21的核酸的引物和含有SEQ ID N0:22的核酸的引物的第i^一引物組；包 括含有SEQ ID N0:23的核酸的引物和含有SEQ ID N0:24的核酸的引物的第十二引物組； 包括含有SEQ ID N0:25的核酸的引物和含有SEQ ID N0:26的核酸的引物的第十三引物組； 包括含有SEQ ID N0:27的核酸的引物和含有SEQ ID N0:28的核酸的引物的第十四引物 組；包括含有SEQ ID N0:29的核酸的引物和含有SEQ ID N0:30的核酸的引物的第十五引 物組；包括含有SEQ ID N0:31的核酸的引物和含有SEQ ID N0:32的核酸的引物的第十六 引物組。
[0056] 可以使用選自由第一引物組至第十六引物組組成的組中的兩個或多個引物組。此 夕卜，可以同時使用全部十六個引物組。
[0057] 可裂解探針可以在不同DNA部分的兩端標記有可檢測物質(zhì)?？闪呀馓结樋梢詷擞?有包括熒光供體和熒光受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)對。
[0058] 隨后，檢測CML基因的復合方法可以包括使聚合酶、RNA酶和擴增緩沖液與混合樣 品混合以擴增DNA。可以使用任何熱穩(wěn)定聚合酶或RNA酶。
[0059] 本文中所使用的術(shù)語"擴增緩沖液"是指被添加至擴增反應(yīng)以控制擴增反應(yīng)并因 此修改擴增反應(yīng)的至少一個要素的穩(wěn)定性、活性和/或生命周期（lifecycle)的復合物 (混合物、化合物，compound)。擴增緩沖液可以與PCR擴增和RNase Η切割活性相容。緩 沖液的實例包括包含4-(2-羥乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES)、3-(Ν-嗎啉代）丙烷磺酸 (MOPS)、乙酸鹽或磷酸鹽的緩沖液，但不限于此。
[0060] PCR緩沖液通?？砂s70mM或更低的KC1，約1. 5mM或更高的MgCl2，以及約50 至200 μ Μ的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的每種。緩沖液可以進一步包含用于更有效的逆轉(zhuǎn)錄 酶PCR或優(yōu)化PCR的添加劑。
[0061] 添加劑是指為了改變組合物的至少一個要素的穩(wěn)定性、活性和/或生命周期而 添加的化合物。例如，添加劑的實例包括甜菜堿、甲酰胺、KC1、CaCl 2、MgOAc、MgCl2、NaCl、 NH40Ac、Nal、Na (C03) 2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亞砜（DMS0)、甘油、乙二醇、二硫蘇糖 醇（DTT)、焦磷酸酶、無機焦磷酸酶（TAP)、陽離子、以及其他化合物、蛋白質(zhì)或輔因子等，其 可以改變擴增效率，但不限于此。可以選擇性地加入添加劑以選擇性地促進引物退火。
[0062] 隨后，檢測CML基因的復合方法可以包括檢測由探針上的標記發(fā)射的信號的增 力口。發(fā)射的信號可以是突光?？梢酝ㄟ^使用適當?shù)难b置如Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR系統(tǒng)或Biorad CFX96 real-time PCR熱循環(huán)儀檢測熒光發(fā)射的結(jié)果，但可 以使用在本領(lǐng)域中可用的所有裝置。
[0063] 此外，檢測CML基因的復合方法可以包括逆轉(zhuǎn)錄PCR，其中，從樣品獲得RNA并通過 使用逆轉(zhuǎn)錄酶擴增該RNA以將獲得的cDNA作為樣品DNA。RNA可以取自CML患者或想要經(jīng) 歷CML診斷的人，并隨后可以通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶擴增該RNA以獲得cDNA?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域 中可用的任何方法完成通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶來逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0064] 在逆轉(zhuǎn)錄酶PCR中，使用模板特異性DNA引物以產(chǎn)生互補DNA鏈。然后，在PCR 中，產(chǎn)物被改變，并且將第二模板特異性引物結(jié)合至cDNA并延伸以形成雙鏈體DNA (duplex DNA)。在接下來的溫度循環(huán)中擴增所得到的產(chǎn)物。為了保持最高靈敏度，防止RNA在cDNA 合成之前被降解是非常重要的。
[0065] 有益效果
[0066]當使用根據(jù)本發(fā)明實施方式的引物組和探針（其中，該引物組和探針特異性結(jié)合 至慢性粒細胞性白血?。–ML)基因）時，可以檢測出含有斷裂點（其引起CML)的基因的極 少量的表達，并因此可以診斷與CML基因表達相關(guān)的CML并且可以容易地確定預(yù)后。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0067] 圖1至圖5示出通過使用1-5編號的引物組擴增el9a2靶核苷酸序列的實驗結(jié)果。
[0068] 圖6至圖11示出通過使用6-11編號的引物組擴增el4a2靶核苷酸序列的實驗結(jié) 果。
[0069] 圖12至圖17示出通過使用6-11編號的引物組擴增el3a2靶核苷酸序列的實驗 結(jié)果。
[0070] 圖18至圖23示出通過使用6-11編號的引物組擴增el4a3靶核苷酸序列的實驗 結(jié)果。
[0071] 圖24至圖29示出通過使用6-11編號的引物組擴增el3a3靶核苷酸序列的實驗 結(jié)果。
[0072] 圖30至圖34示出通過使用12-16編號的引物組擴增ela2靶核苷酸序列的實驗 結(jié)果。

【具體實施方式】
[0073] 實施例
[0074] 以下，參照下面的實施例對本發(fā)明進行更詳細地說明。然而，這些實施例僅用于說 明目的，并不意在限制本發(fā)明的范圍。
[0075] 實施例1 :制備用于CML檢測的引物組和探針
[0076] 制備用于CML檢測的總共16組的引物組（F :正向引物，R:反向引物）和探針（顯 不為小寫字母的核苷酸為RNA)(由Integrated DNA Technologies, Inc.合成）。
[0077] CataCleave 探針是以下：5'-ggggaatggtgugaagcccaaacc-3，（SEQ ID NO:33)(加 下劃線的核苷酸為RNA)。
[0078] 用于檢測R-ABL el9a2的引物組（F :正向引物，R :反向引物）。
[0079] 表 1
[0080]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的試劑盒，所述試劑盒包含： 選自由以下組成的組中的至少一個引物組 包括含有SEQ ID N0:1的核酸的引物和含有SEQ ID N0:2的核酸的引物的第一引物 組； 包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物和含有SEQ ID N0:4的核酸的引物的第二引物 組； 包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物和含有SEQ ID N0:6的核酸的引物的第三引物 組； 包括含有SEQ ID N0:7的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的引物的第四引物 組； 包括含有SEQ ID N0:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 10的核酸的引物的第五引物 組；以及 SEQ ID NO:33的可裂解探針。
2. -種用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3或el4a3斷裂點的試劑盒， 所述試劑盒包含： 選自由以下組成的組中的至少一個引物組： 包括含有SEQ ID NO: 11的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 12的核酸的引物的第六引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 13的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 14的核酸的引物的第七引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 15的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 16的核酸的引物的第八引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 17的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 18的核酸的引物的第九引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 19的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 20的核酸的引物的第十引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 21的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 22的核酸的引物的第i^一引 物組；以及 SEQ ID NO:33的可裂解探針。
3. -種用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試劑盒，所述試劑盒包含： 選自由以下組成的組中的至少一個引物組 包括含有SEQ ID NO: 23的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 24的核酸的引物的第十二引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 25的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 26的核酸的引物的第十三引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 27的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 28的核酸的引物的第十四引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 29的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 30的核酸的引物的第十五引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 31的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 32的核酸的引物的第十六引 物組；以及 SEQ ID NO:33的可裂解探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的試劑盒，其中， 所述可裂解探針含有其中1至10個DNA核苷酸被替換為RNA核苷酸的DNA的內(nèi)部區(qū)域。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3或el4a3 斷裂點的試劑盒，其中，所述可裂解探針含有其中1至10個DNA核苷酸被替換為RNA核苷 酸的DNA的內(nèi)部區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試劑盒，其中， 所述可裂解探針含有其中1至10個DNA核苷酸被替換為RNA核苷酸的DNA的內(nèi)部區(qū)域。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測BCR-ABL融合基因的el9a2斷裂點的試劑盒，其中， 所述可裂解探針在所述探針的兩端標記有可檢測物質(zhì)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測BCR-ABL融合基因的el3a2、el4a2、el3a3或el4a3 斷裂點的試劑盒，其中，所述可裂解探針在所述探針的兩端標記有可檢測物質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測BCR-ABL融合基因的ela2斷裂點的試劑盒，其中， 所述可裂解探針在所述探針的兩端標記有可檢測物質(zhì)。
10. -種用于檢測慢性粒細胞性白血?。–ML)基因的復合試劑盒，所述復合試劑盒包 含： 選自由以下組成的組中的至少一個引物組 包括含有SEQ ID N0:1的核酸的引物和含有SEQ ID N0:2的核酸的引物的第一引物 組； 包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物和含有SEQ ID N0:4的核酸的引物的第二引物 組； 包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物和含有SEQ ID N0:6的核酸的引物的第三引物 組； 包括含有SEQ ID N0:7的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的引物的第四引物 組； 包括含有SEQ ID N0:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 10的核酸的引物的第五引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 11的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 12的核酸的引物的第六引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 13的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 14的核酸的引物的第七引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 15的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 16的核酸的引物的第八引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 17的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 18的核酸的引物的第九引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 19的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 20的核酸的引物的第十引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 21的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 22的核酸的引物的第i^一引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 23的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 24的核酸的引物的第十二引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 25的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 26的核酸的引物的第十三引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 27的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 28的核酸的引物的第十四引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 29的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 30的核酸的引物的第十五引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 31的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 32的核酸的引物的第十六引 物組；以及 SEQ ID NO:33的可裂解探針。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于檢測CML基因的復合試劑盒，其中，所述復合試劑盒進 一步包含熱穩(wěn)定聚合酶或RNA酶。
12. -種用于檢測CML基因的復合方法，所述方法包括： 從樣品獲得DNA ; 使至少一個引物組、SEQ ID NO: 33的可裂解探針和獲得的DNA樣品混合以制備混合樣 品； 使聚合酶、RNA酶和擴增緩沖液與所述混合樣品混合以擴增DNA ;和 檢測由所述探針上的標記發(fā)射的信號的增加； 其中，所述至少一個引物組選自由以下組成的組中： 包括含有SEQ ID N0:1的核酸的引物和含有SEQ ID N0:2的核酸的引物的第一引物 組； 包括含有SEQ ID N0:3的核酸的引物和含有SEQ ID N0:4的核酸的引物的第二引物 組； 包括含有SEQ ID N0:5的核酸的引物和含有SEQ ID N0:6的核酸的引物的第三引物 組； 包括含有SEQ ID N0:7的核酸的引物和含有SEQ ID N0:8的核酸的引物的第四引物 組； 包括含有SEQ ID N0:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 10的核酸的引物的第五引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 11的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 12的核酸的引物的第六引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 13的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 14的核酸的引物的第七引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 15的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 16的核酸的引物的第八引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 17的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 18的核酸的引物的第九引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 19的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 20的核酸的引物的第十引物 組； 包括含有SEQ ID NO: 21的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 22的核酸的引物的第i^一引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 23的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 24的核酸的引物的第十二引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 25的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 26的核酸的引物的第十三引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 27的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 28的核酸的引物的第十四引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 29的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 30的核酸的引物的第十五引 物組； 包括含有SEQ ID NO: 31的核酸的引物和含有SEQ ID NO: 32的核酸的引物的第十六引 物組。
【文檔編號】C12N15/11GK104160025SQ201380013038
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月9日
【發(fā)明者】金桄佑, 金鐘源, 南都鉉, 奇昌錫 申請人:社會福祉法人 三星生命公益財團