重組微生物及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生化學(xué)化合物(特別是但不限于乙醇)的方法。還描述了經(jīng)遺傳修飾的微生物，所述微生物能夠使用一氧化碳產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物(特別是但不限于乙醇)作為主要產(chǎn)物，并且能夠產(chǎn)生少量的或不產(chǎn)生2,3-丁二醇和/或其前體。
【專利說明】重組微生物及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生化學(xué)化合物，尤其是但不僅限于是己醇的方 法，W及用于該些方法的經(jīng)遺傳修飾的微生物。

【背景技術(shù)】
[0002] 已知產(chǎn)己酸的微生物可用于通過底物（包括例如一氧化碳、二氧化碳、氨氣和甲 醇）發(fā)酵來生產(chǎn)燃料（例如己醇或下醇）和其它化學(xué)物質(zhì)。很多該些微生物天然產(chǎn)生至少 兩種-如果不是更多的話-產(chǎn)物。但是，當(dāng)將微生物用于產(chǎn)生產(chǎn)物時，尤其是用在工業(yè)規(guī)模 上時，不總是需要微生物產(chǎn)生多種產(chǎn)物。例如，多種產(chǎn)物的產(chǎn)生可能是W生產(chǎn)效率和特殊價 值的產(chǎn)品的產(chǎn)率為代價，因?yàn)楦碑a(chǎn)物可能從參與產(chǎn)生主要需要產(chǎn)物的途徑中轉(zhuǎn)移出碳。另 夕F，副產(chǎn)物可能對微生物有毒，產(chǎn)生多種產(chǎn)物會使所需產(chǎn)物的回收和分離變得困難，并且難 W控制發(fā)酵條件W有利于使得一種產(chǎn)品的產(chǎn)生優(yōu)于另一種產(chǎn)品。副產(chǎn)物也可能是發(fā)酵罐中 的潛在污染源，因?yàn)樗鼈兛赡苁怯泻ι锏牡孜铩?br> [0003]在通過含一氧化碳的底物的微生物發(fā)酵來產(chǎn)生己醇時，2, 3-下二醇通常作為副產(chǎn) 物產(chǎn)生。該可能降低己醇的生產(chǎn)效率和產(chǎn)率W及造成如上所述的其它問題。
[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的一種或多種缺陷，或者至少為公眾提供有用的選 擇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及，尤其是，新的經(jīng)遺傳修飾的微生物，和親代微生物相比，所述微生物 能夠使用一氧化碳來產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物并且能夠產(chǎn)生降低量的2, 3-下二醇和/或其前 體。在一個實(shí)施方案中，和親代微生物相比，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物基本不產(chǎn)生2, 3-下 二醇和/或其前體。在一個具體實(shí)施方案中，所述微生物產(chǎn)生己醇作為主要產(chǎn)物。
[0006]在第一方面，本發(fā)明提供了一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物，所述微生物被改造為 適于在發(fā)酵含一氧化碳的底物時產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物W及降低量的或基本不產(chǎn)生2, 3-下 二醇和/或其前體，和親代微生物相比，所述微生物包括破壞了 2, 3-下二醇生物合成途徑 的一種或多種遺傳修飾。
[0007]在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物，所述微生 物被改造為適于在發(fā)酵含一氧化碳的底物時產(chǎn)生己醇作為主要產(chǎn)物W及降低量的或基本 不產(chǎn)生2, 3-下二醇和/或其前體，和親代微生物相比，所述微生物包括破壞了 2, 3-下二醇 生物合成途徑的一種或多種遺傳修飾。
[0008]在一個實(shí)施方案中，所述微生物被改造為適于進(jìn)一步產(chǎn)生甲酸、乳酸、丙麗酸、玻 巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸（fumerate)、2-麗戊二酸 (2-oxogluterate)、巧樣酸中的一種或多種。
[0009]在一個實(shí)施方案中，與親代微生物相比，所述微生物被改造為適于產(chǎn)生增加量的 己醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、 2-麗戊二酸、巧樣酸中的一種或多種。
[0010] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一 種或多種能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸的酶的表達(dá)和/或活性。
[0011] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸的酶是己醜乳酸 合酶（als巧。
[0012] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一 種或多種能將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻的酶的表達(dá)和/或活性。
[0013] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻的酶是己醜乳酸 脫駿酶（budA)。
[0014] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一 種或多種能將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的酶的表達(dá)和/或活性。
[0015] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的酶選自 2, 3-下二醇脫氨酶（2, 3b化）、己偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氨酶。
[0016] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了兩 種或多種酶的組合的表達(dá)和/或活性，所述酶能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸、將己醜乳酸轉(zhuǎn) 化成己偶姻、和/或?qū)⒓号家鲛D(zhuǎn)化成2, 3-下二醇。
[0017] 在一個實(shí)施方案中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種W下酶的表達(dá)和/或活性：
[0018] 己醜乳酸合酶（als巧；
[0019] 己醜乳酸脫駿酶炬udA);
[0020] 2, 3-下二醇脫氨酶（2, 3b化）；
[0021] 己偶姻還原酶；和
[0022] 伯醇：仲醇脫氨酶。。
[0023] 在一個實(shí)施方案中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種W下酶的表達(dá)和/或活性：
[0024] 己醜乳酸合酶（als巧；
[00巧]己醜乳酸脫駿酶炬UdA);和
[0026] 2, 3-下二醇脫氨酶（2,抓化）。
[0027] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種遺傳修飾破壞了一種或多種編碼一種或多種 上述酶的基因。在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種遺傳修飾破壞了一種或多種上述酶的 表達(dá)和/或活性所需的化合物的活性。在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種遺傳修飾增強(qiáng) 了一種或多種化合物的表達(dá)或活性，所述化合物抑制了一種或多種上述酶的表達(dá)或活性。
[0028] 在一個具體實(shí)施方案中，所述微生物選自自產(chǎn)己醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、揚(yáng)氏梭菌（Clostridiumljungdahlii)、和拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)W及相關(guān)分離株。在另一個實(shí)施方案中，所述組也包括科斯卡培梭菌 (Clostridiumcoskatii)。
[0029] 在一個具體實(shí)施方案中，所述微生物是自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693。
[0030] 在第二方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物的方法，所述 微生物被改造為適于在發(fā)酵含一氧化碳的底物時產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物W及降低量的或基 本不產(chǎn)生2, 3-下二醇和/或其前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸親代微 生物W破壞2, 3-下二醇生物合成途徑。
[0031] 在一個實(shí)施方案中，和親代微生物相比，所述方法導(dǎo)致了一種或多種產(chǎn)物的產(chǎn)生 增加。
[0032] 在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物的 方法，所述微生物被改造為適于在發(fā)酵含一氧化碳的底物時產(chǎn)生己醇作為主要產(chǎn)物W及降 低量的或基本不產(chǎn)生2, 3-下二醇和/或其前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn) 己酸親代微生物W破壞2, 3-下二醇生物合成途徑。
[0033] 本發(fā)明也提供了通過所述第二方面的方法產(chǎn)生的微生物。
[0034] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了編碼能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸的一種或多種酶的一種或多種基 因。在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸的酶是己醜乳酸合酶 (als巧。
[00巧]在一個實(shí)施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了編碼能將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻的一種或多種酶的一種或多種基因。 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻的酶是己醜乳酸脫駿酶 (budA) 〇
[0036] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了編碼能將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的一種或多種酶的一種或多種基 因。在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的酶選自2, 3-下 二醇脫氨酶化3b化）、己偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氨酶。
[0037] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了兩種或多種基因的組合，所述基因編碼能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸、 將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻、和/或?qū)⒓号家鲛D(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的酶。
[0038] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到親代微生物中， 所述遺傳修飾破壞了一種或多種基因，所述基因編碼己醜乳酸合酶（als巧、己醜乳酸脫駿 酶炬udA)和2, 3-下二醇脫氨酶化3b化）中的一種或多種。
[0039] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括引入遺傳修飾，所述遺傳修飾破壞了一種或多 種上述酶的表達(dá)或活性所需的化合物的活性。
[0040] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括引入增強(qiáng)了一種或多種化合物的表達(dá)或活性的 遺傳修飾，所述化合物抑制了一種或多種上述酶的表達(dá)或活性。
[0041] 在第H方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的方法。在一個實(shí)施方案中， 所述方法為用于產(chǎn)生己醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳 酸、蘋果酸、延胡索酸、2-麗戊二酸、巧樣酸中的一種或多種。
[0042] 在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物 (在一個實(shí)施方案中包括己醇W及一種或多種其它產(chǎn)物）的方法，所述微生物發(fā)酵包括使 用本發(fā)明第一方面的和/或通過本發(fā)明第二方面的方法產(chǎn)生的一種或多種微生物發(fā)酵含 C0的底物。在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種其他產(chǎn)物選自玻巧酸、乳酸、甲酸、額氨酸、 亮氨酸、丙麗酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、2-麗戊二酸、巧樣酸。
[0043] 本發(fā)明也提供了用于降低來自工業(yè)過程的總的大氣碳排放的方法。
[0044] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括如下步驟：
[0045] (a)將含CO的底物提供給生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器含有本發(fā)明第一方面的和 /或通過本發(fā)明第二方面的方法產(chǎn)生的一種或多種微生物的培養(yǎng)物；和
[0046] 化）在所述生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵所述培養(yǎng)物W產(chǎn)生一種或多種上述產(chǎn)物，優(yōu)選 包括己醇。
[0047] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0048] 在由工業(yè)生產(chǎn)過程產(chǎn)生的含C0的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0049] 通過培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含C0的氣體W產(chǎn)生一種或多種上述產(chǎn)物，優(yōu)選包括己 醇，所述培養(yǎng)物含有一種或多種本發(fā)明第一方面的微生物和/或通過本發(fā)明第二方面的方 法產(chǎn)生的微生物。
[0050] 在所述方法方面的具體實(shí)施方案中，將所述微生物維持在水性培養(yǎng)基中。
[0051] 在所述方法方面的具體實(shí)施方案中，對所述底物的發(fā)酵發(fā)生在生物反應(yīng)器中。
[0052] 優(yōu)選地，所述含C0的底物是含C0的氣態(tài)底物。在一個實(shí)施方案中，所述底物包含 工業(yè)廢氣。在某些實(shí)施方案中，所述氣體是鋼鐵廠廢氣或合成氣。
[0053] 在一個實(shí)施方案中，所述底物通常會含有大比例的C0,例如至少約20體積％至約 100體積％的C0、20體積％至70體積％的C0、30體積％至60體積％的C0和40體積％至 55體積％的C0。在具體實(shí)施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35 體積％、或約40體積％、或約45體積％、或約50體積％的C0、或約55體積％的C0、或約60 體積％的〇)。
[0054] 雖然所述底物不必需含有任何氨氣，但是存在應(yīng)該不會對依據(jù)本發(fā)明方法的產(chǎn) 物形成不利。在具體實(shí)施方案中，存在氨氣可獲得提高的醇產(chǎn)生的整體效率。例如，在具 體實(shí)施方案中，所述底物可包含約2:1、或1:1或1:2比例的&:0)。在一個實(shí)施方案中，所 述底物包含約30體積％或更低的&、20體積％或更低的&、約15體積％或更低的&、或者 約10體積％或更低的&。在其他實(shí)施方案中，所述底物流包含低濃度的&，例如小于5體 積％、或小于4體積％、或小于3體積％、或小于2體積％、或小于1體積％或者基本上不含 氨氣。例如，所述底物還可含有一些0)2,例如約1體積％至約80體積％的(?或1體積％ 至約30體積％的CA。
[00巧]在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括從發(fā)酵液中回收一種或多種產(chǎn)物的步驟。在 一個實(shí)施方案中，從發(fā)酵液中回收己醇。在一個實(shí)施方案中，從發(fā)酵液中回收一種或多種 產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果 酸、延胡索酸、巧樣酸和2-麗戊二酸。
[0056] 在第四方面，本發(fā)明提供了通過第H方面的方法產(chǎn)生的一種或多種產(chǎn)物。在一個 實(shí)施方案中，所述一種或多種產(chǎn)物選自己醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸和2-麗戊二酸。在一個實(shí)施方案中，所述一 種或多種產(chǎn)物至少包括己醇。
[0057] 在第五方面，本發(fā)明提供了一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物，和親代微生物相比，所 述一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物中的一種或多種非必需基因已被破壞。
[0058] 在第六方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生其中一種或多種非必需基因已被破壞的一氧化碳 營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物的方法，所述方法包括遺傳修飾親代微生物中的一種或多種非必需基 因。
[0059] 本發(fā)明也提供了通過第六方面的方法產(chǎn)生的微生物。
[0060] 在一個實(shí)施方案中，一種或多種非必需基因是編碼將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻的 酶、和/或編碼將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的酶的基因。在一個實(shí)施方案中，所述酶是如 本文所述的酶。
[0061]在某些實(shí)施方案中，所述微生物選自自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡 培梭菌、齡泥下酸桿菌炬utyribacteriumlimosum)、甲基營養(yǎng)下酸桿菌炬utyribacterium meth}dot;ro地i州m)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii)、己氏嗜堿菌 (Alkalibaculumbacchii)、Blautiaproducta、齡泥真桿菌巧ubacteriumlimosum)、熱醋 穆爾氏菌（Moorellathermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorellathermautotrophica)、 普氏產(chǎn)醋桿菌（Oxobacterpfennigii)和凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi)。
[0062] 在一些實(shí)施方案中，所述微生物選自自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌和拉氏梭菌。在另一 個實(shí)施方案中，所述組也包括科斯卡培梭菌。
[0063] 在一個具體實(shí)施方案中，所述微生物是自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693。
[0064] 在第走方面，本發(fā)明提供了用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的方法，所 述微生物發(fā)酵使用了一種或多種第五方面的微生物和/或通過第六方面的方法產(chǎn)生的微 生物。
[0065] 在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生己醇和一種或多 種其他產(chǎn)物的方法，所述微生物發(fā)酵包括使用第五方面的和/或通過第六方面的方法產(chǎn)生 的一種或多種微生物對含C0的底物發(fā)酵。
[0066] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括如下步驟：
[0067] (a)將含C0的底物提供給生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器含有第五方面的和/或通 過第六方面的方法產(chǎn)生的一種或多種微生物的培養(yǎng)物；和
[0068] 化）在所述生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵所述培養(yǎng)物W產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物。
[0069] 在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0070] (a)在由工業(yè)生產(chǎn)過程產(chǎn)生的含C0的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0071] 化）通過培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含C0的氣體W產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物，所述培養(yǎng)物含 有第五方面的和/或通過第六方面的方法產(chǎn)生的一種或多種微生物。
[0072] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種產(chǎn)物是如本文所述的產(chǎn)物。
[0073] 在一個實(shí)施方案中，所述含C0的底物是如本文所述的底物。
[0074] 廣義上說，本發(fā)明還可單獨(dú)或綜合地包括本申請說明書中提及或指出的部分、要 素和特征，包括兩個或多個所述部分、要素或特征的任意或所有組合，并且當(dāng)本文提及的具 體整數(shù)在本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域具有已知的等價物時，所述已知的等價物如同單獨(dú)被提出一 樣納入本文。

【專利附圖】

【附圖說明】
[00巧]本發(fā)明的該些方面和其他方面一應(yīng)該W其所有新的方面考慮一將通過后文 描述（僅作為示例）并參考附圖而變得清楚，其中：
[0076]圖1示出了產(chǎn)生2,3-下二醇的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸菌（例如，自產(chǎn)己酸梭菌 DSM23693)中的C0的代謝途徑。
[0077] 圖化表明了在具有向己醇的碳通量再分配的產(chǎn)生2, 3-下二醇的一氧化碳營養(yǎng)型 產(chǎn)己酸菌中敲除2, 3-下二醇生物合成途徑的影響并且顯示了來自C0的新產(chǎn)物（例如，玻 巧酸、2-麗戊二酸、甲酸、額氨酸、亮氨酸）的產(chǎn)生。
[0078] 圖2示出了自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693基因組上的budA基因和其5'和3'側(cè)翼區(qū)。 也顯示了用于PMTL85141質(zhì)粒的側(cè)翼片段的PCR擴(kuò)增和隨后的克隆的引物。
[0079] 圖3示出了用于自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693中budA基因敲除的含有位于由lacZ基 因分開的DNA片段側(cè)翼的5'和3'budA基因的示例性pMTL85141-budA-ko質(zhì)粒。
[0080] 圖4示出了用于本發(fā)明的示例性甲基化質(zhì)粒。
[00引]圖5示出了（A) ;budA基因敲除后自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693的基因組區(qū)域的圖形說 明并且也顯示了用于篩選自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693budA基因敲除的引物位置W及來自野生 型自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693和其相應(yīng)的budA基因敲除菌株的PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。炬）：自 產(chǎn)己酸梭菌DSM23693budA基因敲除的PCR篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖像。泳道1和9表示 GeneRuler?lk:bPlusDNALadder。泳道2-6顯不了使用引物0g09和Ogl化對從野生型 自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693(+ve，2. 7化）和6個潛在的自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693budA基因敲除 (1-6, 2. 2化）中分離的基因組DNA的budA祀?yún)^(qū)域進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。泳道10-16顯示了使用 對budA基因273bp的內(nèi)部區(qū)域特異的引物0g44f和0g45i對從野生型（+ve)自產(chǎn)己酸梭 菌DSM23693和6個潛在的自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693budA基因敲除中分離的基因組DNA進(jìn) 行的PCR(*)。
[0082] 圖6;使用引物0g44f/0g45i和0g42f/0g4化對自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693budA和 2, 3b化基因中RAM插入進(jìn)行的PCR確認(rèn)。
[0083] 圖7示出了自產(chǎn)己酸梭菌DSM23693和A2, 3b化ClosTron突變體在發(fā)酵過程中 將己偶姻轉(zhuǎn)化為下二醇的速率。
[0084] 序列表的簡單描沐
[0085] 該說明書附帶序列表，其中列出下面的序列：
[0086]Seq.ID1:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693budA基因的核巧酸序列。
[0087]Seq.ID2:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693budA蛋白的氨基酸序列。
[0088]Seq.ID3:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693budA基因的5'側(cè)翼區(qū)的核巧酸序列。
[0089]Seq.ID4:budA基因的3'側(cè)翼序列的核巧酸序列。
[0090] SeqID5-8和10和11:如下文表1中描述的。
[0091]Seq.ID9:大腸桿菌-梭菌穿梭載體-質(zhì)粒PMTL85141的核巧酸序列。
[0092]Seq.ID. 12:pMTL85141-budA-ko的核巧酸測序結(jié)果，其表明該質(zhì)粒上存在的側(cè)翼 DNA片段不含有突變。
[0093]SeqID13:自產(chǎn)己醇梭菌（Y18178, 01:7271109)的 16srRNA基因。
[0094]SeqID14:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化體的克隆1的16srRNA 基因：（93% )的同一性。
[0095]Seq.ID15:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化體的克隆2的16srRNA 基因；（94% )。
[0096]Seq.ID16:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化體的克隆3的16srRNA 基因：（95% )。
[0097]Seq.ID17:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化體的克隆4的16srRNA 基因：（93% )。
[0098]Seq.ID18:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化體的克隆5的16srRNA 基因：（94% )。
[0099]Seq.ID19:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化體的克隆6的16srRNA 基因：（92% )。
[0100]SeqID20.使用引物0g09f得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化 體的克隆1的PCR產(chǎn)物的核巧酸測序結(jié)果（92% )。
[0101]SeqID21.使用引物Ogl化得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化 體的克隆1的PCR產(chǎn)物的核巧酸測序結(jié)果（92% )。
[0102]SeqID22.使用引物Ogl化得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化 體的克隆3的PCR產(chǎn)物的核巧酸測序結(jié)果（92% )。
[0103]SeqID23.使用引物Ogl化得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化 體的克隆4的PCR產(chǎn)物的核巧酸測序結(jié)果（92% )。
[0104]SeqID24.使用引物Ogl化得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化 體的克隆5的PCR產(chǎn)物的核巧酸測序結(jié)果。
[0105] SeqID25.使用引物0g09f得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的潛在budA敲除轉(zhuǎn)化 體的克隆6的PCR產(chǎn)物的核巧酸測序結(jié)果。
[0106]SeqID26.使用引物Ogl化得到的克隆6的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693budA祀?yún)^(qū)域 的核巧酸測序結(jié)果。
[0107]SeqID27和28 ;在下文的表4中描述。
[0108]Seq29和30:在下文的表4中描述。
[0109]SEQID31:和誘導(dǎo)型lac啟動子融合的新的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的核巧酸序列。
[0110] SEQID32:新的甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白序列。
[01川SEQID33:質(zhì)粒PGS20的核巧酸序列。
[011引SEQ_IDNO34:自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌和拉氏梭菌的新的醇脫氨酶的氨基酸序 列。
[0113]SEQ_IDNO35:自產(chǎn)己醇梭菌的新的醇脫氨酶的核酸序列。
[0114]SEQ_IDNO36:揚(yáng)氏梭菌的新的醇脫氨酶的核酸序列。
[0115]SEQ_IDNO37:拉氏梭菌的新的醇脫氨酶的核酸序列。
[0116]Seq.ID. 38:自產(chǎn)己醇梭菌的蘋果酸酶1的核巧酸序列。
[0117]Seq.ID. 39:自產(chǎn)己醇梭菌的蘋果酸酶1的氨基酸序列。
[0118]Seq.ID. 40:自產(chǎn)己醇梭菌的蘋果酸酶2的核巧酸序列。
[0119]Seq.ID. 41:自產(chǎn)己醇梭菌的蘋果酸酶2的氨基酸序列。
[0120]Seq.ID. 42:自產(chǎn)己醇梭菌的蘋果酸脫氨酶的核巧酸序列。
[0121]Seq.ID. 43:自產(chǎn)己醇梭菌的蘋果酸脫氨酶的氨基酸序列。
[0122] Seq.ID. 44:自產(chǎn)己醇梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的核巧酸序列。
[0123]Seq.ID. 45:自產(chǎn)己醇梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的氨基酸序列。
[0124]Seq.ID. 46:自產(chǎn)己醇梭菌的丙麗酸駿化酶的核巧酸序列。
[0125]Seq.ID. 47:自產(chǎn)己醇梭菌的丙麗酸駿化酶的氨基酸序列。
[0126]Seq.ID. 48:自產(chǎn)己醇梭菌的丙麗酸駿激酶的核巧酸序列。
[0127]Seq.ID. 49:自產(chǎn)己醇梭菌的丙麗酸駿激酶的氨基酸序列。
[012引 Seq.ID. 50:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的核巧酸序列。
[0129]Seq.ID. 51:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的氨基酸序列。
[0130]Seq.ID. 52:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的核巧酸序列。
[0131]Seq.ID. 53:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的氨基酸序列。
[0132]Seq.ID. 54:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸還原酶1的核巧酸序列。
[0133]Seq.ID. 55:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸還原酶1的氨基酸序列。
[0134]Seq.ID. 56:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸還原酶2的核巧酸序列。
[0135]Seq.ID. 57:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸還原酶2的氨基酸序列。
[0136]Seq.ID. 58:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸還原酶3的核巧酸序列。
[0137]Seq.ID. 59:自產(chǎn)己醇梭菌的延胡索酸還原酶3的氨基酸序列。
[013引 Seq.ID. 60:拉氏梭菌的蘋果酸酶1的核巧酸序列。
[0139]Seq.ID. 61:拉氏梭菌的蘋果酸酶1的氨基酸序列。
[0140]Seq.ID. 62:拉氏梭菌的蘋果酸脫氨酶的核巧酸序列。
[0141]Seq.ID. 63:拉氏梭菌的蘋果酸脫氨酶的氨基酸序列。
[0142]Seq.ID. 64:拉氏梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的核巧酸序列。
[0143]Seq.ID. 65:拉氏梭菌的丙麗酸磯酸雙激酶的氨基酸序列。
[0144]Seq.ID. 66:拉氏梭菌的丙麗酸駿化酶的核巧酸序列。
[0145]Seq.ID. 67:拉氏梭菌的丙麗酸駿化酶的氨基酸序列。
[0146]Seq.ID. 68:拉氏梭菌的丙麗酸駿激酶的核巧酸序列。
[0147]Seq.ID. 69:拉氏梭菌的丙麗酸駿激酶的氨基酸序列。
[014引 Seq.ID. 70:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的核巧酸序列。
[0149]Seq.ID. 71:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基A的氨基酸序列。
[0150]Seq.ID. 72:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的核巧酸序列。
[0151]Seq.ID. 73:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亞基B的氨基酸序列。
[0152]Seq.ID. 74:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶1的核巧酸序列。
[0153]Seq.ID. 75:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶1的氨基酸序列。
[0154]Seq.ID. 76:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶2的核巧酸序列。
[0155]Seq.ID. 77:拉氏梭菌的延胡索酸還原酶2的氨基酸序列。
[0156]Seq.ID78:揚(yáng)氏梭菌budA基因的5'上游序列或同源臂。
[0157]Seq.ID79:揚(yáng)氏梭菌budA基因的3'下游序列或同源臂。
[0158]Seq.ID80:拉氏梭菌budA基因的5'上游序列或同源臂。
[0159]Seq.ID81:拉氏梭菌budA基因的3'下游序列或同源臂。
[0160]SeqID82:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693budA上ClosTron祀向區(qū)域的核巧酸序列。
[0161]SeqID83;自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化上ClosTron祀向區(qū)域的核巧酸序列。
[0162]SeqID84:用于篩選A2, 3b化ClosTron突變體的寡核巧酸0g42f。
[0163]SeqID85:用于篩選A2, 3b化ClosTron突變體的寡核巧酸0g43r。
[0164]Seq.ID86:使用引物fDl得到的從自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693A2, 3b化ClosTron 克隆2擴(kuò)增的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0165] SeqID87:使用引物rP2得到的從自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693A2,3b化ClosTron 克隆2擴(kuò)增的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0166]Seq.ID88:使用引物fDl得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693A2, 3b化ClosTron克 隆4的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0167] SeqID89:使用引物rP2得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693A2,3b化ClosTron克 隆4的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0168]Seq.ID90:使用引物fDl得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆1 的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0169]SeqID91:使用引物rP2得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆 1的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0170]Seq.ID92:使用引物fDl得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆 3的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0171]SeqIDand93:使用引物rP2 得到的自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron 克隆3的16srRNAPCR產(chǎn)物的核巧酸序列。
[0172]SeqID94 ;自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0173]SeqID95:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0174]Seq.ID96和97:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的引 物和。
[01巧]Seq.ID98和99:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的引 物。
[0176]Seq.ID100和101:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因敲除的側(cè)翼 引物。
[0177]SeqID102:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693SecA化基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0178]SeqID103:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693SecA化基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0179]Seq.ID104和105:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的 引物。
[0180]Seq.ID106和107 ;用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的 引物。
[0181]Seq.ID108和109:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693SecA化基因敲除的側(cè)翼 引物。
[0182]SeqID110:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693SecA化基因的II類內(nèi)含子祀向盒的核巧酸 序列。
[0183]Seq.ID111和112:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693SecA化基因插入失活的 側(cè)翼引物。
[0184]SeqID113:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693alsS基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0185]SeqID114:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693alsS基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0186]Seq.ID115和116:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693alsS基因的5'同源臂的引 物序列。
[0187]Seq.ID117和118:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693alsS基因的3'同源臂的引 物序列。
[0188]Seq.ID119和120:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693alsS基因敲除的側(cè)翼引 物的序列。
[0189]SeqID120:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvC基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0190]SeqID121:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvC基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0191]Seq.ID123和124:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvC基因的5'同源臂的引 物序列。
[0192]Seq.ID125和126:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvC基因的3'同源臂的引 物序列。
[0193]Seq.ID127和128:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvC基因敲除的側(cè)翼引 物的序列。
[0194]SeqID129:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvl基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0195]SeqID130:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvl基因的3'（Seq.ID130)同源臂的核 巧酸序列。
[0196]Seq.ID131和132:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvl基因的5'同源臂的引 物序列。
[0197]Seq.ID133和134:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvl基因的3'同源臂的引 物序列。
[0198]Seq.ID135和136:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvl基因敲除的側(cè)翼引 物的序列。
[0199]SeqID137:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvB基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0200]SeqID138:自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvB基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0201] Seq.ID139和140:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvB基因的5'同源臂的引 物序列。
[0202] Seq.ID141和142:用于擴(kuò)增自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvB基因的3'同源臂的引 物序列。
[020引 Seq.ID143和144:可用于確認(rèn)自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693ilvB基因敲除的側(cè)翼引 物的序列。
[0204]SeqID145:alsS的ClosTron內(nèi)含子祀向核巧酸序列的實(shí)例。
[0205]SeqID146:ilvC的ClosTron內(nèi)含子碑1向核巧酸序列的實(shí)例。
[0206]SeqID147:ilvl的ClosTron內(nèi)含子祀向核巧酸序列的實(shí)例。
[0207]SeqID148:ilvB的ClosTron內(nèi)含子祀向核巧酸序列的實(shí)例。
[020引 SeqID149和150:可用于篩選alsSClosTron突變體的寡核巧酸。
[0209]SeqID151和152:可用于篩選ilvCClosTron突變體的寡核巧酸。
[0210] SeqID153和154:可用于篩選ilvlClosTron突變體的寡核巧酸。
[0211] SeqID155和156:可用于篩選ilvBClosTron突變體的寡核巧酸。
[021引 所有的序列都使用標(biāo)準(zhǔn)的IUPAC縮寫，參見ht化://en.m.W化ipedia.org/w化i/ Nucleic_acid_notation#section_l。例女口 ：
[0213] A腺嘿嶺核巧
[0214] C胞嚼巧核巧
[0215] G鳥嘿嶺核巧
[0216]T 胸腺嚼巧
[0引7] WAorT
[0引引 SC或G
[0引引 MA或C
[0220] KG或T
[022。 RA或G
[022引 YC或T
[022引 BC、G或 T
[0224] DA、G或 T
[022引 HA、C或 T
[022引 VA、C或 G
[0227]N或-任何堿基（不是缺口）、A、C、G、T【具體實(shí)施方式】
[022引 W下是在廣義上給出的對本發(fā)明（包括其優(yōu)選的實(shí)施方案）的說明。下文在標(biāo)題 "實(shí)施例"下給出的公開內(nèi)容進(jìn)一步解釋本發(fā)明，其提供了支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、本發(fā)明 多個方面的具體實(shí)例W及實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0229] 本發(fā)明提供了能夠通過發(fā)酵含C0的底物產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的微生物。在一個 具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能夠通過發(fā)酵含C0的底物產(chǎn)生己醇，或己醇和一種或多種 其他產(chǎn)物的微生物。和親代微生物相比，所述重組微生物至少產(chǎn)生減少量的2, 3-下二醇和 /或其前體。在一種實(shí)施方案中，和親代微生物相比，所述微生物基本不產(chǎn)生2, 3-下二醇或 其前體。
[0230] 通過多種基因敲除研究，本發(fā)明人意外地鑒定出如果在一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微 生物中破壞2, 3-下二醇生物合成途徑，則與親代微生物相比，所述微生物能夠產(chǎn)生增加水 平的甲酸、乳酸、玻巧酸、2-麗戊二酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和己醇。本發(fā)明人也認(rèn)為所 述微生物產(chǎn)生了增加水平的丙麗酸和TCA循環(huán)中間體化合物己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、 巧樣酸，因?yàn)樗鼈兪遣Ｇ伤帷?-麗戊二酸和額氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生產(chǎn)的前體。該有很 多顯著的優(yōu)勢。一個主要的優(yōu)勢是己醇生產(chǎn)的效率的提高，包括產(chǎn)生的更高水平的己醇。不 希望園于任何具體理論，本發(fā)明人認(rèn)為額氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙麗酸的水平的增加 使得微生物可用更多該些化學(xué)物質(zhì)來供給己醇產(chǎn)生。另外，必須經(jīng)常用氨基酸和其他化學(xué) 物質(zhì)補(bǔ)充發(fā)酵液W確保發(fā)酵過程中微生物的生存能力和生產(chǎn)效率。通過本發(fā)明重組微生物 產(chǎn)生額氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙麗酸可W不再需要用該些化學(xué)物質(zhì)補(bǔ)充發(fā)酵液，節(jié)約 了成本。另外，本發(fā)明的微生物中降低或去除2, 3-下二醇產(chǎn)生也具有優(yōu)勢。2, 3-下二醇可 能對微生物有毒并因此可對發(fā)酵和生長產(chǎn)生負(fù)面影響。降低或去除發(fā)酵液中的2, 3-下二 醇也使得更容易從發(fā)酵液中回收己醇；通常必須一起回收己醇和2, 3-下二醇并且接著將 它們在隨后的步驟中分離。因?yàn)?, 3-下二醇是很多有害生物的底物，因此它也是發(fā)酵罐中 的潛在的微生物污染源。另外，由于玻巧酸、2-麗戊二酸、甲酸、乳酸、丙麗酸、額氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸可用于很多商業(yè)過程并且可在下游化學(xué)產(chǎn)物生產(chǎn)中用作中間體化合物，因此 它們具有獨(dú)立的經(jīng)濟(jì)價值。
[0231] 本發(fā)明人已經(jīng)首次證明了在一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物中非必需基因的破壞 或敲除。相應(yīng)地，在另一方面，本發(fā)明也提供了一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸微生物W及產(chǎn)生該些 微生物的方法和使用該些微生物的方法，其中和親代微生物相比，所述微生物的一種或多 種非必需基因已被破壞。"非必需基因"是編碼該樣一種蛋白的基因，所述蛋白不是微生物 生存所必需的，因此不補(bǔ)充該蛋白微生物也能生存。非必需基因的實(shí)例包括編碼己醜乳酸 脫駿酶和2, 3-下二醇脫氨酶的那些基因。技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（包括破 壞基因（如本文所述）的重組技術(shù)W及測試該些遺傳修飾是否對微生物的生存產(chǎn)生影響的 標(biāo)準(zhǔn)測定法）鑒定非必需基因。
[0232] 雖然下文本發(fā)明的描述將重點(diǎn)放在通過遺傳修飾對2, 3-下二醇生物合成途徑的 破壞上，應(yīng)理解如果需要的話本發(fā)明的微生物也可包括一種或多種其他的遺傳修飾（包括 破壞一種或多種與2, 3-下二醇生物合成途徑無關(guān)的非必需基因）。對于涉及破壞非必需基 因的本發(fā)明方面，應(yīng)理解包括對編碼不是2, 3-下二醇途徑中的酶的基因的遺傳修飾。
[0233] 另外，盡管下文的描述可能將重點(diǎn)放在作為主產(chǎn)物的己醇的產(chǎn)生和回收上，應(yīng)理 解本發(fā)明可用于提高一種或多種非己醇的產(chǎn)物的產(chǎn)生水平或者除了己醇之外還同時提高 一種或多種產(chǎn)物的產(chǎn)生水平。
[0234] 定父
[0235] 本文中提到的"發(fā)酵液"是包含至少一種營養(yǎng)培養(yǎng)基和細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0236] 本文中提到的穿梭微生物是其中表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶的微生物，并且其不同于目標(biāo)微 生物。
[0237] 本文中提到的目標(biāo)微生物是其中表達(dá)包括在表達(dá)構(gòu)建體/載體上的基因的微生 物，并且其不同于所述穿梭微生物。
[023引術(shù)語"主要發(fā)酵產(chǎn)物"意指W最高的濃度和/或產(chǎn)率產(chǎn)生的那種發(fā)酵產(chǎn)物。
[0239]當(dāng)用于發(fā)酵過程時，術(shù)語"提高效率"、"提高的效率"等包括但不限于提高如下中 的一個或多個：催化所述發(fā)酵的微生物的生長速率、生長和/或產(chǎn)物產(chǎn)生速率、產(chǎn)生的所需 產(chǎn)物（例如醇）的體積/消耗的底物的體積、所需產(chǎn)物的產(chǎn)生速率或產(chǎn)生水平、W及產(chǎn)生的 所需產(chǎn)物與所述發(fā)酵的其他副產(chǎn)物相比的相對比例。
[0240] 短語"含一氧化碳的底物"及類似術(shù)語應(yīng)被理解為包括任意底物，其中一氧化碳可 被一種或多種細(xì)菌菌株用于例如生長和/或發(fā)酵。
[0241] 短語"含一氧化碳的氣態(tài)底物"及類似短語和術(shù)語包括含有某一水平一氧化碳的 任意氣體。在某些實(shí)施方案中，所述底物含有至少約20體積％至約100體積％的C0、20體 積％至70體積％的C0、30體積％至60體積％的C0、和40體積％至55體積％的C0。在具 體實(shí)施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35體積％、或約40體積％、 或約45體積％、或約50體積％的C0、或約55體積％的C0、或約60體積％的C0。
[0242] 雖然所述底物不必需含有任何氨氣，但是存在&應(yīng)該不會對本發(fā)明方法的產(chǎn)物不 利。在具體實(shí)施方案中，存在氨氣可獲得提高的醇產(chǎn)生的整體效率。例如，在具體實(shí)施方案 中，所述底物可包含約2:1、或1:1或1:2比例的CO。在一個實(shí)施方案中，所述底物包含 約30體積％或更低的&、20體積％或更低的&、約15體積％或更低的&、或者約10體積％ 或更低的&。在其他實(shí)施方案中，所述底物流包含低濃度的&，例如小于5體積％、或小于4 體積％、或小于3體積％、或小于2體積％、或小于1體積％或者基本上不含氨氣。例如，所 述底物還可含有一些CA，例如約1體積％至約80體積％的0)2、或1體積％至約30體積％ 的CA。在一個實(shí)施方案中，所述底物包含小于或等于約20體積％的0)2。在具體的實(shí)施方 案中，所述底物包含小于或等于約15體積％的C〇2、小于或等于約10體積％的C〇2、小于或 等于約5體積％的(?或者基本上不含〔化。
[0243] 在W下的說明書中，從遞送和發(fā)酵"含C0的氣態(tài)底物"的方面描述本發(fā)明的實(shí)施 方案。但是，應(yīng)理解，所述氣態(tài)底物可W其他形式提供。例如，所述含C0的氣態(tài)底物可W溶 解于液體中的形式提供。實(shí)質(zhì)上，將液體用含一氧化碳的氣體飽和，然后將所述液體加入 生物反應(yīng)器中。該可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)實(shí)現(xiàn)。例如，可使用微泡分散發(fā)生器化ensirisak et.al.Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation； AppliedBiochemistryandBiotechnologyVolume101，Number3/〇ctober，2002)。又例 女口，可將所述含CO的氣態(tài)底物吸附到固態(tài)支持物上。該些替代方法被術(shù)語"含CO的底物" 等所涵蓋。
[0244] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述含C0的氣態(tài)底物是工業(yè)排氣或廢氣。"工業(yè)廢 氣或工業(yè)排氣"應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括工業(yè)過程產(chǎn)生的任何含C0的氣體，并且包括鐵金屬產(chǎn) 品生產(chǎn)、有色金屬產(chǎn)品生產(chǎn)、石油精煉過程、煤的氣化、生物質(zhì)的氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn) 和焦炭生產(chǎn)所產(chǎn)生的氣體。本文其他部分還提供了另外的實(shí)例。
[0245] 除非另有說明，否則本文所用的短語"發(fā)酵"、"發(fā)酵過程"或"發(fā)酵反應(yīng)"等意圖包 括所述過程的生長階段和產(chǎn)物生物合成階段。如下所述，在一些實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng) 器可包括第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，向發(fā)酵反應(yīng)中加入金屬或組合物應(yīng)被 理解為包括加入到該些反應(yīng)器之一或兩個中。
[0246] 術(shù)語"生物反應(yīng)器"包括由一個或多個容器和/或培或管道排布組成的發(fā)酵裝置， 其包括連續(xù)攬拌蓋反應(yīng)器（CSTR)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器（ICR)、滴流床反應(yīng)器（TBR)、鼓泡培、 氣升式發(fā)酵罐、靜態(tài)混合器或適用于氣-液接觸的其他容器或其他裝置。如下所述，在一些 實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器可包含第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，當(dāng)提到向所 述生物反應(yīng)器或發(fā)酵反應(yīng)中加入底物時，如果合適，應(yīng)該理解為加入到該些反應(yīng)器之一或 兩個中。
[0247]當(dāng)用于依據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物時，"一種或多種產(chǎn)物"等類似的短語意指包括例如 己醇、玻巧酸、丙麗酸、乳酸、額氨酸、甲酸、異亮氨酸和亮氨酸。在一個實(shí)施方案中，"一種或 多種產(chǎn)物"也可包括己醜乳酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸、和2-麗戊二酸中的一種或多種。 應(yīng)理解本發(fā)明的方法適用于意在用于己醇（單獨(dú)或與其他產(chǎn)物結(jié)合）的產(chǎn)生和回收或除了 己醇之外的產(chǎn)物的產(chǎn)生和回收的方法。
[024引所述術(shù)語"己酸鹽"包括單獨(dú)的己酸鹽，W及分子或游離己酸與己酸鹽的混合物， 例如存在于如本文可能描述的所述發(fā)酵液中的己酸鹽和游離己酸的混合物。所述發(fā)酵液中 的分子己酸與己酸鹽的比例取決于所述系統(tǒng)的抑。術(shù)語玻巧酸、丙麗酸、乳酸、甲酸、己醜乳 酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸、和2-麗戊二酸應(yīng)被相似地理解。
[0249] 除非另有說明，提到本文任何可W-種或多種異構(gòu)形式（例如，D、L、內(nèi)消旋、S、R、 順式或反式形式）的化合物，應(yīng)通常被認(rèn)為包括提到所述化合物的任何一種或多種該樣的 異構(gòu)體。例如，提到"己偶姻"應(yīng)被認(rèn)為包括提到其D和L異構(gòu)體之一或兩者。
[0250] "外源核酸"是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意適合的來 源，包括但不限于待引入它們的微生物、與待引入它們的生物不同的微生物菌株或種，或者 它們可通過人工或重組方法形成。所述外源核酸可被改造為適于整合到待引入其的微生物 的基因組中，或者保持染色體外狀態(tài)。
[0巧1] 所述"2, 3-下二醇生物合成途徑"是一種反應(yīng)途徑，所述反應(yīng)包括將丙麗酸轉(zhuǎn)化成 己醜乳酸、將己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻、和將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇。
[0巧2] 如本文使用的，"破壞所述2, 3-下二醇生物合成途徑"等類似的短語意指降低 2, 3- 了二醇的產(chǎn)生，或在一種實(shí)施方案中基本消除（eliminated) 2, 3- 了二醇的產(chǎn)生。 [0253] "2, 3- 了二醇的前體"意指涵蓋己偶姻和己醜乳酸。
[0巧4] 酶"能夠轉(zhuǎn)化"第一化合物或底物為第二化合物或產(chǎn)物，如果W其活性形式存在， 酶能夠催化其中至少一部分第一化合物被轉(zhuǎn)化為第二化合物的反應(yīng)。
[0巧5] 提到"醇脫氨酶"應(yīng)被認(rèn)為包括能夠催化麗（例如己偶姻）轉(zhuǎn)化為仲醇（例如 2, 3-下二醇）的醇脫氨酶，或者反之亦然。該樣的醇脫氨酶包括仲醇脫氨酶和伯醇脫氨酶。 "仲醇脫氨酶"是可將麗（例如己偶姻）轉(zhuǎn)化為仲醇（例如2, 3-下二醇）的醇脫氨酶，或 反之亦然。"伯醇脫氨酶"是可將酵轉(zhuǎn)化為伯醇的醇脫氨酶，或反之亦然；但是，許多伯醇脫 氨酶也能夠催化麗轉(zhuǎn)化為仲醇，或反之亦然。該些醇脫氨酶也可稱為"伯醇-仲醇脫氨酶"。 因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提到"2, 3-下二醇脫氨酶"應(yīng)被認(rèn)為包括提到可能被歸 類為伯醇、仲醇或伯醇-仲醇脫氨酶的2, 3-下二醇脫氨酶。
[0巧6]"遺傳修飾"一所述遺傳修飾破壞了 2, 3-下二醇生物合成途徑或破壞了依據(jù)本 發(fā)明的一種或多種酶的表達(dá)或活性一應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括任何該樣的遺傳修飾，所述遺 傳修飾至少降低了 2, 3-下二醇的生物合成、一種或多種酶的表達(dá)或活性或者在一些實(shí)施 方案中基本抑制了一種或多種酶的表達(dá)或活性或基本阻止了 2, 3-下二醇的產(chǎn)生。所述短 語應(yīng)被認(rèn)為包括，例如：對編碼一種或多種所述酶的基因的修飾（包括對參與基因表達(dá)的 基因調(diào)節(jié)元件的修飾）；核酸的引入，所述核酸產(chǎn)生降低或抑制了一種或多種所述酶活性 的蛋白、或者降低或阻止了一種或多種所述酶表達(dá)的蛋白；核酸的引入，所述核酸表達(dá)被改 造為適于阻斷基因表達(dá)的核酸（例如，反義RNA、siRNA(小干擾RNA)、CRISPR(成簇的規(guī)律 間隔的短回文重復(fù)序列））；通過將修飾引入到編碼蛋白的基因中來降低或抑制所述蛋白， 所述蛋白是一種或多種所述酶的表達(dá)或活性所必需。應(yīng)理解一種或多種所述酶的表達(dá)或活 性所需的蛋白可直接作用于一種基因或一種或多種酶，或可間接通過其他化合物起作用。 相似地，降低或抑制一種或多種所述酶的活性或表達(dá)的蛋白可直接作用于所述基因或所述 一種或多種酶，或可間接通過其他化合物起作用。
[0巧7]"基因修飾"應(yīng)被廣義地認(rèn)為并且意指包括，例如，將一種或多種外源核酸引入到 微生物中、將突變引入基因位點(diǎn)上、添加或從基因組中移除一種或多種核巧酸、用不同的核 巧酸置換一種或多種核巧酸、置換基因、移除基因、添加基因等等。
[0巧引"親代微生物"是用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物的微生物。在一種實(shí)施方案中，所 述親代微生物可W是天然存在的微生物（即野生型微生物）或之前曾被修飾過的微生物 (遺傳修飾的或重組微生物）。在本發(fā)明涉及產(chǎn)生降低量的或基本不產(chǎn)生2, 3-下二醇的微 生物的實(shí)施方案中，所述親代微生物是含有功能性的2, 3-下二醇途徑的微生物（包括天然 存在的微生物或之前曾被修飾過的微生物）。含有功能性的2, 3-下二醇生物合成途徑的親 代微生物的實(shí)例包括自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡培梭菌W及相關(guān)分離株。
[0巧9]"功能性"的2, 3-下二醇生物合成途徑是其中微生物能將丙麗酸轉(zhuǎn)化成2, 3-下二 醇的途徑。在一個具體實(shí)施方案中，所述途徑包括將丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸、將己醜乳酸轉(zhuǎn) 化成己偶姻、和將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇。在一個具體實(shí)施方案中，丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜 乳酸是由己醜乳酸合酶催化的、己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻是由己醜乳酸脫駿酶催化的、己偶 姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇是由2, 3-下二醇脫氨酶或己偶姻還原酶催化的。
[0260] 術(shù)語核酸"構(gòu)建體"或"載體"及類似術(shù)語應(yīng)被廣義地認(rèn)為包括適合用作載體將遺 傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的任意核酸（包括DNA和RNA)。該術(shù)語應(yīng)被認(rèn)為包括質(zhì)粒、病毒（包 括瞻菌體）、粘粒和人工染色體。構(gòu)建體或載體可包括一種或多種調(diào)節(jié)元件、復(fù)制起點(diǎn)、多克 隆位點(diǎn)和/或選擇標(biāo)記。在具體的實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體或載體被改造為適于破壞親代 微生物中天然存在的基因。在另一個實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體或載體被改造為適于使得由 所述構(gòu)建體或載體編碼的一種或多種基因表達(dá)。核酸構(gòu)建體或載體包括裸露核酸，W及用 一種或多種可幫助向細(xì)胞遞送中的試劑配制的核酸（例如脂質(zhì)體綴合的核酸、其中含有所 述核酸的有機(jī)體）。
[0261] 在說明書通篇中，提供了適用于本發(fā)明的酶的示例性序列信息（例如，己醜乳酸 合酶、己醜乳酸脫駿酶、2, 3-下二醇脫氨酶、己偶姻還原酶）。提供該信息用來鑒定適用于 本發(fā)明的示例性酶并且使得技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的具體實(shí)施方案而無需過多實(shí)驗(yàn)。應(yīng) 理解酶的核酸序列和氨基酸序列可根據(jù)微生物的不同而不同。因此，本發(fā)明不應(yīng)被理解為 僅限于該些具體的實(shí)施方案，而是應(yīng)被理解為延伸到對該樣的酶的破壞，即所述酶具有不 同的序列但是能夠催化丙麗酸轉(zhuǎn)化成己醜乳酸、己醜乳酸轉(zhuǎn)化成己偶姻和/或己偶姻轉(zhuǎn)化 成2, 3-下二醇。通常，所述酶具有和本文示例性的酶至少約75%的氨基酸序列同一性。在 具體實(shí)施方案中，所述酶具有和本文示例性的酶至少約80%、85%、90%、95%或99%的序 列同一性。在所述核酸水平上，編碼該些變體酶的基因具有和編碼本文示例性的酶的核酸 至少約75%的序列同源性。在具體實(shí)施方案中，該些核酸具有和編碼本文示例性的酶的核 酸至少約80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的序列同源性。
[0262] 也應(yīng)理解所述變體酶不需要具有和本文具體示例性的酶相同的活性水平。只 需要所述酶在催化目的轉(zhuǎn)化時具有某些活性水平。技術(shù)人員會容易理解其他該樣的酶， 尤其是考慮到本文所包含的信息。用于評估所述2, 3-下二醇途徑的酶的活性的酶測定 法包括例如由SpeckmanandCollins(SpecificityoftheWesterfeldAdaptationof theVoges-ProskauerTest, 1982,Appl.Environ.Microbiol. 44:40-43)或Dulieuand Poncelet(Spectrophotometricassayofaacetolactatedecarboxylase,1999,Enzy andMicrobiolTechnol, 25, 537-42)記載的Voges-Proskauertest測定法。
[026引微牛物
[0264] 如上文所述，本發(fā)明提供了重組微生物，所述重組微生物能夠使用一氧化碳產(chǎn)生 一種或多種產(chǎn)物（在一個具體實(shí)施方案中，己醇作為主要產(chǎn)物）并且與親代微生物相比能 夠產(chǎn)生減少量的或基本不產(chǎn)生2, 3-下二醇和/或其前體。所述微生物包含破壞了 2, 3-下 二醇生物合成途徑的一種或多種遺傳修飾（和親代微生物相比）。
[0265] 如上所述，在一個實(shí)施方案中，所述微生物產(chǎn)生己醇作為主要產(chǎn)物。在一個實(shí)施方 案中，所述微生物也產(chǎn)生甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸中的一種或 多種。在一個實(shí)施方案中，所述微生物被改造為適于產(chǎn)生與親代微生物相比的增加量的己 醇、甲酸、乳酸、丙麗酸、玻巧酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸中的一種或多種。在某些實(shí)施方 案中，所述微生物產(chǎn)生己醜乳酸、蘋果酸、巧樣酸、延胡索酸、2-麗戊二酸中的一種或多種。 在一個具體實(shí)施方案中，所述微生物被改造為適于產(chǎn)生增加量的己醜乳酸、蘋果酸、延胡索 酸、2-麗戊二酸中的一種或多種。
[0266] 所述一種或多種遺傳修飾優(yōu)選破壞能夠?qū)⒈愃徂D(zhuǎn)化成己醜乳酸、將己醜乳酸轉(zhuǎn) 化成己偶姻、將己偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-下二醇的一種或多種酶的表達(dá)和/或活性。在某些實(shí)施 方案中，所述一種或多種遺傳修飾僅破壞丙麗酸到己醜乳酸的轉(zhuǎn)化、僅破壞己醜乳酸到己 偶姻的轉(zhuǎn)化或僅破壞己偶姻到2, 3-下二醇的轉(zhuǎn)化。在其他實(shí)施方案中，所述一種或多種遺 傳修飾破壞了該些轉(zhuǎn)化中的兩種或H種。
[0267] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將丙麗酸轉(zhuǎn)化為己醜乳酸的酶是己醜乳酸 合酶（als巧。
[026引己醜乳酸合酶活性能夠?qū)⒈愃徂D(zhuǎn)化成己醜乳酸并且是支鏈氨基酸（包括額氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸）產(chǎn)生所必需的（圖1)。可在親代微生物中表達(dá)具有己醜乳酸合 酶活性的一種或多種酶?？蓮腉enBank中獲得自產(chǎn)己醇梭菌（AEI90719. 1、AEI90730. 1、 AEI90731. UAEI90713. UAEI90714. 1)、揚(yáng)氏梭菌（ADK15104. UADK15104. UADK15105. 1、 ADK15400. 1、ADK15400. 1)和拉氏梭菌（AEI90734. 1、AEI907：M. 1、AEI90735. 1、 AEI90727. 1、AEI90727. 1)的示例性氨基酸序列W及自產(chǎn)己醇梭菌（冊876013. 1、 冊876023. 1、冊876021. 1)、揚(yáng)氏梭菌（CP001666. 1-化JU_c38920、化JU_c32420、化JU_ C20420-30)和拉氏梭菌（冊876014. 1、冊876024. 1、冊876022. 1)的各自核酸序列。但是，女口 上文所述，編碼所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根據(jù)微生物的不同而變化。
[0269] 在某些實(shí)施方案中，親代微生物可包含一種W上能夠?qū)⒈愃徂D(zhuǎn)化成己醜乳酸的 酶。當(dāng)親代微生物含有一種W上能夠?qū)⒈愃徂D(zhuǎn)化成己醜乳酸的酶時，可引入一種或多種 基因修飾W使得破壞兩種或多種所述酶的表達(dá)和/或活性。當(dāng)親代微生物中存在一種W上 酶時，破壞一種W上所述酶可能產(chǎn)生W下作用：將玻巧酸、一種或多種TCA循環(huán)中間體和/ 或己醇的產(chǎn)生增加到高于僅破壞單個酶時可達(dá)到的水平?？赏ㄟ^破壞存在于所述親代微生 物中的每一個額外的酶來進(jìn)一步提高產(chǎn)生水平。雖然破壞所有所述酶的表達(dá)和/或活性可 在所需產(chǎn)物的產(chǎn)生方面提供一些優(yōu)勢，本發(fā)明人認(rèn)為不必破壞所有所述酶的表達(dá)和/或活 性即可獲得本發(fā)明的有益效果。
[0270] 在一個實(shí)施方案中，至少兩種、H種、四種或五種能夠?qū)⒈愃徂D(zhuǎn)化為己醜乳酸的 酶被破壞。
[0271] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，當(dāng)丙麗酸到己醜乳酸的轉(zhuǎn)化基本或全部被阻斷時，微生 物的生長和通過微生物的發(fā)酵可能需要補(bǔ)充一種或多種氨基酸（包括，例如，額氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸）。該可通過任何使氨基酸能夠被微生物利用的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，可將一 種或多種氨基酸加入到培養(yǎng)、生長或發(fā)酵培養(yǎng)基中、微生物的培養(yǎng)物中、和/或發(fā)酵液中。 在某些實(shí)施方案中，可將氨基酸直接加入到培養(yǎng)基或發(fā)酵液中或W提取物（例如酵母提取 物）的形式加入。
[0272] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將己醜乳酸轉(zhuǎn)化為己偶姻的酶是己醜乳酸 脫駿酶（budA)。
[0273] 己醜乳酸脫駿酶活性能夠?qū)⒓横h乳酸轉(zhuǎn)化為己偶姻（圖1)。可在親代微生物中表 達(dá)具有己醜乳酸脫駿酶活性的一種或多種酶?？蓮腉enBank中獲得自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭 菌和拉氏梭菌的己醜乳酸脫駿酶的示例性氨基酸（AEI90717. 1、ADK13906. 1、AEI90718. 1) 和核酸（冊876011. 1、CP001666. 1-化JU_c08380、冊876012. 1)序列信息。但是，如上文所 述，編碼所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根據(jù)微生物的不同而變化。
[0274] 在某些實(shí)施方案中，親代微生物可包含一種W上能夠?qū)⒓横h乳酸轉(zhuǎn)化為己偶姻的 酶。當(dāng)親代微生物含有一種W上該類酶時，可引入一種或多種基因修飾W使得破壞兩種或 多種所述酶的表達(dá)和/或活性。當(dāng)親代微生物中存在一種W上所述酶時，破壞一種W上所 述酶可能產(chǎn)生W下作用：將額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醇、乳酸、甲酸和玻巧酸、和/或一 種或多種TCA循環(huán)中間體的產(chǎn)生增加到高于僅破壞單個酶時可達(dá)到的水平。可通過破壞存 在于所述親代微生物中的每一個額外的酶來進(jìn)一步提高產(chǎn)生水平。雖然破壞所有所述酶的 表達(dá)和/或活性可在所需產(chǎn)物的產(chǎn)生方面提供一些優(yōu)勢，本發(fā)明人認(rèn)為不必破壞所有所述 酶的表達(dá)和/或活性即可獲得本發(fā)明的有益效果。
[0275] 在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種能將己偶姻轉(zhuǎn)化為2, 3-下二醇的酶選自 2, 3-下二醇脫氨酶（2, 3-b化）和己偶姻還原酶。
[0276] 2, 3-下二醇脫氨酶活性是能夠?qū)⒓号家鲛D(zhuǎn)化為2, 3-下二醇（圖1)?？蓮?GenBank中獲得自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌和拉氏梭菌的己醜乳酸脫駿酶的示例性氨基酸 (AEI90715. 1、ADK15380. 1、AEI90716. 1)和核酸（冊876009. 1、CP001666.l-CLJU_c23220、 冊876010. 1)序列信息。可在親代微生物中表達(dá)具有己醜乳酸合酶活性的一種或多種酶。 例如，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出自產(chǎn)己醇梭菌、拉氏梭菌和揚(yáng)氏梭菌含有其他能夠?qū)⒓号家鲛D(zhuǎn) 化為2,3-下二醇的伯醇；仲醇脫氨酶。569 1〇11〇334、35、36和37中提供了該酶的示例性 序列信息。但是，如上文所述，編碼所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根據(jù)微生 物的不同而變化。
[0277] 在某些實(shí)施方案中，親代微生物可包括一種W上能夠?qū)⒓号家鲛D(zhuǎn)化為2, 3-下二 醇的酶。當(dāng)親代微生物含有一種該類酶時，可引入一種或多種基因修飾W使得破壞兩種或 多種所述酶的表達(dá)和/或活性。當(dāng)親代微生物中存在一種W上該類酶時，破壞一種W上該 類酶可能具有W下作用：將額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、己醇、乳酸、甲酸和玻巧酸、和/或一 種或多種TCA循環(huán)中間體的產(chǎn)生增加到高于僅破壞單個酶時可達(dá)到的水平?？赏ㄟ^破壞存 在于所述親代微生物中的每一個額外的酶來進(jìn)一步提高產(chǎn)生水平。雖然破壞所有所述酶的 表達(dá)和/或活性可在所需產(chǎn)物的產(chǎn)生方面提供一些優(yōu)勢，本發(fā)明人認(rèn)為不必破壞所有所述 酶的表達(dá)和/或活性即可獲得本發(fā)明的有益效果。
[027引在一個實(shí)施方案中，至少兩種或H種能夠?qū)⒓号家鲛D(zhuǎn)化為2, 3-下二醇的酶被破 壞。
[0279] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物選自產(chǎn)己酸一氧化碳營養(yǎng)型生物，包括自產(chǎn)己醇 梭菌、揚(yáng)氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium化akei)、糞味梭菌（Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌（Clostridium aceti州m)、蟻酸醋酸梭菌（Clostridiumformicoaceti州m)、大梭菌（Clostridium ma即um)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii)、己氏嗜堿菌（A化aliba州lum bacchii)、熱醋穆爾氏菌（Moorellathermoacetica)、卵形鼠抱菌（Sporomusaovate)、甲 基營養(yǎng)下酸桿菌炬utyribacteriummeth}dot;ro地i州m)、Blautiaproducta、齡泥真桿菌 (Eubacteriumlimosum)、凱伍熱厭氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi)。
[0280] 該些一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸菌由它們在形成己醜-CoA、己酸鹽和其他產(chǎn)物的 厭氧條件下利用并W氣態(tài)一碳（C1)來源（例如一氧化碳（C0)和含有C0和/或氨氣 化）的二氧化碳（C〇2))作為能源而進(jìn)行化能自養(yǎng)生長的能力定義。所述一氧化碳營養(yǎng) 型產(chǎn)己酸菌具有相同的發(fā)酵模式，Wood-Uungd址1或還原性己醜-CoA途徑，并且由W 下酶組的存在定義，所述酶組包括一氧化碳脫氨酶（C0DH)、氨化酶、甲酸脫氨酶、甲醜四 氨葉酸合成酶、亞甲基四氨葉酸脫氨酶、甲醜四氨葉酸環(huán)水解酶、亞甲基四氨葉酸還原 酶和一氧化碳脫氨酶/己醜-CoA合酶（C0DH/ACS)，該組合是該類細(xì)菌特征性的和特有 的值rake,肺sel,Matthies,Wood, &Ljungd址1,2006)。與糖發(fā)酵細(xì)菌的化能自養(yǎng)生長 相比一所述糖發(fā)酵細(xì)菌能將底物轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)、次級代謝產(chǎn)物和從其形成產(chǎn)物（通過 己醜-CoA或直接形成）的丙麗酸，在產(chǎn)己酸菌中底物被直接輸送（channel)轉(zhuǎn)化為己 醜-CoA，從己醜-CoA形成產(chǎn)物、生物質(zhì)和次級代謝產(chǎn)物。
[0281] 在一個實(shí)施方案中，所述微生物選自一組一氧化碳營養(yǎng)型梭菌，所述梭菌包括 自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌、和拉氏梭菌W及相關(guān)分離株。該些包括但不限于自產(chǎn)己醇梭 菌JAI-IT值SM10061) (Abrini,化veau，&Nyns, 1994)、自產(chǎn)己醇梭菌LBS1560(DSM19630) (W0/2009/064200)、自產(chǎn)己醇梭菌LBS1561 (DSM23693)、揚(yáng)氏梭菌陽TCT值SM13528 = ATCC55383) (Tanner，Miller，&Yang, 1993)、揚(yáng)氏梭菌邸I-2(ATCC55380)(美國專利 5,593,886)、揚(yáng)氏梭菌〇01(410： 55988)(美國專利 6,368,819)、揚(yáng)氏梭菌0-52(410： 55989)(美國專利6, 368, 819)、或"拉氏梭菌PllT"(ATCCBAA-622) (W0 2008/028055)、和 相關(guān)分離株例如"科斯卡培梭菌"扣S專利2011/0229947)、W及其突變株（例如，揚(yáng)氏梭 菌 0TA-1)(Tirado-Acevedo0.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsing Clostridium1jungdahlii.PhDthesis,NorthCarolinaStateUniversity, 2010)。
[028引 該些菌株形成梭菌rRNAI群內(nèi)的亞群（Collinsetal.，1994)，盡管如DNA-DNA 再結(jié)合和DM指紋印跡實(shí)驗(yàn)所測定的，所述菌株是不同的種屬，但是它們在16SrRNA基因 水平上具有至少99%的同一性（W0 2008/028055,美國專利2011/02299470)。
[0283] 該群的菌株由共有的特征定義，它們有著類似的基因型和表型，同時它們均具有 相同的保存能量的模式和發(fā)酵代謝模式。該群菌株缺少細(xì)胞色素并通過Rnf復(fù)合體保存能 量。
[0284]該組的所有菌株的基因組大小為約4. 2MBp(K坤keetal.，2010)和GC組成 為約 32 %mol(Abrinietal. , 1994;Kiipkeetal. , 2010;Tanneretal. , 1993)(WO 2008/028055;美國專利2011/0229947)并具有保守的必要關(guān)鍵基因操縱子，所述操縱子編 碼Wood-Uungd址1途徑的酶（一氧化碳脫氨酶、甲醜-四氨葉酸合成酶、亞甲基-四氨葉酸 脫氨酶、甲醜-四氨葉酸環(huán)水解酶、亞甲基-四氨葉酸還原酶和一氧化碳脫氨酶/己醜-CoA 合酶）、氨化酶、甲酸脫氨酶、化f復(fù)合體（rnfCDGEAB)、丙麗酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶、 酵：鐵氧還蛋白氧化還原酶（K6pkeetal. , 2010, 2011)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述Wood-Ljungd址1 途徑基因（負(fù)責(zé)氣體攝?。┑慕Y(jié)構(gòu)和數(shù)目在所有種屬中都是一樣的，盡管在核酸和氨基酸 序列上不同（K6pkeetal.，2011)。
[0285] 所述菌株都有著類似的形態(tài)和大?。▽?shù)生長細(xì)胞為0.5-0. 7X3-510ym)，是 嗜溫的（最適生長溫度為30-37°C)并且為嚴(yán)格厭氧菌（Abrinietal. , 1994;Tanneret al.，1993)(WO2008/028055)。而且，它們都具有相同的主要系統(tǒng)發(fā)育特征，例如相同的pH 范圍（pH4-7. 5,最適的初始抑為5. 5-6)、依賴含CO的氣體W類似的生長速率進(jìn)行強(qiáng)的 自養(yǎng)生長、W及代謝譜一W己醇和己酸作為主要發(fā)酵終產(chǎn)物并且在某些條件下形成的少量 2, 3-了二醇和乳酸（Abrinietal., 1994;Kiipkeetal., 2010;Tanneretal., 1993) (WO2008/02805W。所有的種都發(fā)現(xiàn)有巧隙產(chǎn)生。但是，所述種在對不同糖（例如鼠李糖、 阿拉伯糖）、酸（例如葡萄糖酸、巧樣酸）、氨基酸（例如精氨酸、組氨酸）、或其它底物（例 如甜菜堿、下醇）的底物利用上是不同的。發(fā)現(xiàn)一些種是某些維生素（例如硫胺素、生物 素）的營養(yǎng)缺陷型而其它種則不是。在該些生物范圍內(nèi)已經(jīng)顯示出駿酸被還原成它們對應(yīng) 的醇（Perez,Richter,Lof1:us, &Angenent, 2012)。
[0286]因此所述特征不是一種生物（如自產(chǎn)己醇梭菌或揚(yáng)氏梭菌）所特有的，而是一氧 化碳營養(yǎng)型的且能夠合成己醇的梭菌屬的一般特征。因此，可預(yù)期本發(fā)明可用于該些菌株， 盡管表現(xiàn)上可能會有不同。
[0287] 在某些實(shí)施方案中，所述親代微生物選自自產(chǎn)己醇梭菌、揚(yáng)氏梭菌和拉氏梭菌。在 一個實(shí)施方案中，該組也包括科斯卡培梭菌。在一個具體實(shí)施方案中，所述親代微生物是自 產(chǎn)己醇梭菌DSM23693。
[028引可使用任意數(shù)量的已知的轉(zhuǎn)化和重組核酸技術(shù)修飾親代微生物W得到本發(fā)明 的微生物。該些技術(shù)記載于例如Sambrooketal, (Mole州larCloning:A1油oratory manual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY, 1989)中。又例 女口，可使用下文實(shí)施例部分描述的方法。
[0289] 一般舉例來說，在將突變引入基因、或破壞或敲除基因的情況下，可設(shè)計(jì)合適的核 酸構(gòu)建體或載體W整合到親代微生物的基因組中W破壞所述基因。該些構(gòu)建體通常包括和 待破壞的基因內(nèi)區(qū)域或側(cè)翼區(qū)域同源的核酸序列（同源臂），該樣使得能夠發(fā)生同源重組， 并且能夠發(fā)生突變的引入、該基因的一個核酸區(qū)域的切除、或用不同的核酸對一個基因區(qū) 域的置換。雖然優(yōu)選的是所述構(gòu)建體的同源臂和他們祀向的基因組上的區(qū)域具有100%的 互補(bǔ)性，但是該也不是必須的，只要序列足夠互補(bǔ)W使得能夠和目的基因區(qū)域祀向重組。通 常，如Sambrooketal1989中所定義的，同源臂具有能夠使得在嚴(yán)格條件下與祀向區(qū)域雜 交的同源性水平。
[0290] 考慮到參與2, 3-下二醇生物合成途徑的酶的可用序列信息，技術(shù)人員會了解足 W允許將外源基因祀向同源重組和整合到親代微生物基因組中的核酸序列。但是，例如，在 budA的例子中，可使用本文描述的側(cè)翼同源臂（例如，SeqID3、4和78-81)，或者在揚(yáng)氏梭 菌的例子中，可從GenBank上的核酸序列信息設(shè)計(jì)本文描述的側(cè)翼同源臂（CP000166. 1)。 又例如，可從相關(guān)微生物的基因組序列信息中確定依據(jù)本發(fā)明的待破壞的編碼酶的基因的 側(cè)翼序列。具體舉例來說，可從GenBankCP001666.1上的信息中確定揚(yáng)氏梭菌中的側(cè)翼序 列。
[0291]W其他一般實(shí)例來說，當(dāng)將核酸引入到親代微生物W用來表達(dá)抑制2, 3-下二醇 生物合成途徑的酶的表達(dá)和/活性的蛋白或核酸時、或用來表達(dá)提高抑制2, 3-下二醇生物 合成途徑的酶的表達(dá)和/活性的化合物表達(dá)的蛋白時，可設(shè)計(jì)構(gòu)建體W使得所述蛋白在微 生物中表達(dá)。通常，構(gòu)建體包括合適的調(diào)節(jié)元件（包括啟動子）?？墒褂媒M成型或誘導(dǎo)型啟 動子。
[0292] 當(dāng)本發(fā)明采用通過引入突變等對基因的直接破壞時，如上所述，用于轉(zhuǎn)化所述親 代微生物的構(gòu)建體或載體會被改造為適于整合到微生物的基因組中。在表達(dá)蛋白或核酸的 情況下一所述蛋白或核酸被改造為適于破壞2, 3-下二醇生物合成途徑的酶的表達(dá)或活 性、或者適于提高參與該途徑的酶的抑制劑的表達(dá)或活性，所述構(gòu)建體在轉(zhuǎn)化親代微生物 時可保持染色體外狀態(tài)或可被改造為適于整合到所述微生物的基因組中。因此，用于本發(fā) 明的構(gòu)建體可包括核巧酸序列，所述核巧酸序列被改造為適于幫助整合（例如可允許同源 重組并祀向整合到宿主基因組中的區(qū)域）或幫助染色體外構(gòu)建體的表達(dá)和復(fù)制（例如復(fù)制 起點(diǎn)、啟動子和其他調(diào)節(jié)元件或序列）。
[0293] 可使用任意數(shù)量的本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建用于本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。例 女口，可使用化學(xué)合成或重組技術(shù)。該類技術(shù)記載于例如，Sambrooketal(Mole州lar Cloning:Alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor,NY, 1989)。其他示例性技術(shù)記載于下文的實(shí)施例部分。實(shí)質(zhì)上，所述個體基因、調(diào)節(jié) 元件、同源臂等等將被可操作地相互連接W使得它們能夠執(zhí)行它們的所需功能。本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員會了解用于本發(fā)明的適當(dāng)載體。但是，舉例來說，下述載體可能是適合的；pMTL、 pIMP、pJIR和下文實(shí)施例部分所示例的質(zhì)粒。
[0294] 應(yīng)理解，用于產(chǎn)生本發(fā)明的微生物的核酸可W是任何適合的形式，包括DNA、RNA 或cDNA(包括雙鏈和單鏈核酸）。
[0295] 可將所述一種或多種外源核酸W裸露核酸形式遞送到親代微生物或可將其用一 種或多種可促進(jìn)轉(zhuǎn)化過程的試劑配制（例如脂質(zhì)體綴合的核酸、其中含有所述核酸的有機(jī) 體）。合適時，所述一種或多種核酸可W是DNA、RNA或其組合。
[0296] 可使用任意數(shù)量的本領(lǐng)域中已知用于產(chǎn)生重組微生物的技術(shù)由親代微生物和一 種或多種外源核酸制備本發(fā)明的微生物。僅舉例來說，轉(zhuǎn)化（包括轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染）可通過電 穿孔、接合（con化gation)、原瞻菌體誘導(dǎo)、或化學(xué)感受態(tài)或天然感受態(tài)來實(shí)現(xiàn)。適合的轉(zhuǎn)化 技術(shù)記載于例女口SambrookJ,FritschEF,ManiatisT:Mole州larCloning:Alaboratory Manual,ColdSpringHarbourLabrotaryPress,ColdSpringHarbour, 1989。
[0297]又例如，可使用記載于Ko邱keetal. 2010,Poc.Nat.Acad.Sci. U.S.A. 107:13087-92 ；PCT/NZ2011/000203 ；W02012/053905；Straetzetal.,1994,Appl. Environ.Microbiol. 60:1033-37;Mermelsteinetal.，1992,Biotechnology, 10, 190-1 95 ;Jenne:rtetal.，2000,Microbiology, 146:3071-3080;Tyurinetal.，2004,Appl. Environ.Microbiol. 70:883-890中的電穿化技術(shù)。又例如，可使用記載于化asanna TamarapuParthasarathy, 2010,DevelopmentofaGeneticModificationSystemin ClostridiumscatologenesATCC25775forGenerationofMutants,MastersProject WesternKen化ckyUniversity中的原瞻菌體誘導(dǎo)技術(shù)。又例如，可使用記載于Herbert etal.,2003,FEMSMicrobiol.Lett. 229:103-110 或Williamsetal.,1990,J.Gen.Microbiol. 136:819-826 中的接合方法。
[029引在某些實(shí)施方案中，由于在要轉(zhuǎn)化的微生物中具有活性的限制性系統(tǒng)，必須將要 引入所述微生物的核酸甲基化。該可使用多種技術(shù)進(jìn)行，所述技術(shù)包括下文描述的那些，其 在下文實(shí)施例部分進(jìn)一步示例說明。
[0299] 舉例來說，在一個實(shí)施方案中，通過包括如下步驟的方法產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生 物：
[0300] 將（i)本文描述的待引入到親代微生物的構(gòu)建體/載體和（ii)包含甲基轉(zhuǎn)移酶 基因的甲基化構(gòu)建體/載體引入穿梭微生物；
[0301] 表達(dá)所述甲基轉(zhuǎn)移酶基因；
[0302] 從所述穿梭微生物分離一種或多種構(gòu)建體/載體；和，
[0303] 將所述一種或多種表達(dá)構(gòu)建體/載體引入目標(biāo)微生物。
[0304] 在一個實(shí)施方案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因是組成型表達(dá)的。在另一個實(shí)施方 案中，步驟B的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)是誘導(dǎo)的。
[0305] 所述穿梭微生物是可促進(jìn)組成所述表達(dá)構(gòu)建體/載體的核酸序列的甲基化的微 生物，優(yōu)選限制性酶陰性（restrictionnegative)的微生物。在具體實(shí)施方案中，所述 穿梭微生物是限制性酶陰性的大腸桿菌、枯草桿菌炬acillussubtillis)或乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)。
[0306] 所述甲基化構(gòu)建體/載體包含編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。
[0307] -旦所述表達(dá)構(gòu)建體/載體和甲基化構(gòu)建體/載體被引入所述穿梭微生物，存 在于所述甲基化構(gòu)建體/載體上的甲基轉(zhuǎn)移酶基因就被誘導(dǎo)?？赏ㄟ^任意適合的啟動子 系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，但在本發(fā)明一個具體的實(shí)施方案中，所述甲基化構(gòu)建體/載體包含誘導(dǎo)型 lac啟動子（例如，在SEQ_IDNO31中）并且可通過加入乳糖或其類似物，更優(yōu)選異丙 基-目-D-硫代-半乳糖巧（IPTG)來誘導(dǎo)。其他適合的啟動子包括ara、tet或T7系統(tǒng)。 在本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，所述甲基化構(gòu)建體/載體啟動子是組成型啟動子。
[030引在一個具體的實(shí)施方案中，所述甲基化構(gòu)建體/載體具有對所述穿梭微生物的種 類特異性的復(fù)制起點(diǎn)，W使存在于所述甲基化構(gòu)建體/載體上的任意基因均可在所述穿梭 微生物中表達(dá)。優(yōu)選地，所述待引入到親代微生物的構(gòu)建體/載體具有對所述目標(biāo)微生物 的種類特異性的復(fù)制起點(diǎn)。
[0309] 所述甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)可導(dǎo)致存在于所述待引入到親代微生物的構(gòu)建體/載體 上的基因的甲基化。然后，可根據(jù)許多已知方法中的任一種將所述構(gòu)建體/載體從所述穿 梭微生物中分離。僅舉例來說，可使用下文實(shí)施例部分描述的方法分離所述構(gòu)建體/載體。
[0310] 在一個具體的實(shí)施方案中，兩種構(gòu)建體/載體被共分離。
[0311] 可使用任意數(shù)量的已知方法，將所述祀向（destined化r)親代微生物的構(gòu)建體/ 載體引入所述微生物。但是，舉例來說，可使用下文實(shí)施例部分描述的方法。
[0312] 可W想到，可將甲基轉(zhuǎn)移酶基因引入穿梭微生物并過表達(dá)。因此在一個實(shí)施方案 中，可W使用已知方法收集所得的甲基轉(zhuǎn)移酶并在體外用于甲基化所述待引入親代微生物 中的構(gòu)建體。然后，可將所述構(gòu)建體/載體引入所述目標(biāo)（親代）微生物。在另一個實(shí)施方 案中，將甲基轉(zhuǎn)移酶基因引入所述穿梭微生物的基因組，然后將所述祀向（destined化r) 親代微生物的構(gòu)建體/載體引入所述穿梭微生物，從所述穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu) 建體/載體，然后將所述構(gòu)建體/載體引入目標(biāo)（親代）微生物。
[0313] 可W想到，可將如上文所定義的祀向（destined化r)親代微生物的構(gòu)建體/載體 和甲基化構(gòu)建體/載體結(jié)合W提供一種目標(biāo)組合物。該種組合物在繞過限制性屏障機(jī)制W 產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物方面特別有用。
[0314] 在一個具體實(shí)施方案中，上文所述的構(gòu)建體/載體是質(zhì)粒。
[0315] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會了解用于產(chǎn)生本發(fā)明的微生物的許多適合的甲基轉(zhuǎn)移酶。 但是，可W使用例如枯草桿菌瞻菌體OT1甲基轉(zhuǎn)移酶和下文實(shí)施例中描述的甲基轉(zhuǎn)移酶。 考慮到所需甲基轉(zhuǎn)移酶的序列和遺傳密碼，應(yīng)容易地了解編碼適合的甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸。 在一個實(shí)施方案中，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸如下文實(shí)施例所述（例如SEQ_IDN031的核 酸）。
[0316] 可W使用任意數(shù)量的被改造為適于使甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的構(gòu)建體/載體來產(chǎn) 生所述甲基化構(gòu)建體/載體。但是，舉例來說，可使用下文實(shí)施例部分描述的質(zhì)粒。
[0317] 根據(jù)本文包含的信息，會理解可改造（tailor)親代微生物的遺傳修飾W利于使 得一種或多種產(chǎn)物的產(chǎn)生優(yōu)于一種或多種其他產(chǎn)物。例如，破環(huán)丙麗酸到己醜乳酸的轉(zhuǎn)化 有利于使得乳酸、甲酸、蘋果酸、延胡索酸、巧樣酸、玻巧酸和2-麗戊二酸的產(chǎn)生優(yōu)于額氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸的產(chǎn)生。 。31引產(chǎn)牛方法
[0319] 本發(fā)明提供了一種用于通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的方法，所述方法包 括使用本發(fā)明的微生物發(fā)酵含C0的底物。在一種具體的實(shí)施方案中，所述方法用于通過微 生物發(fā)酵產(chǎn)生己醇或一種或多種其他產(chǎn)物，其包括使用本發(fā)明的微生物發(fā)酵含C0的底物。 本發(fā)明的方法可用于減少來自工業(yè)過程的總的大氣碳排放。
[0320] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵包括使用本發(fā)明的重組微生物在生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵底物W 產(chǎn)生所述一種或多種產(chǎn)物（在一種具體的實(shí)施方案中，己醇、或己醇和一種或多種其他產(chǎn) 物）的步驟。
[0321] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括如下步驟：
[0322] (a)將含C0的底物提供給生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器含有本發(fā)明第一方面的一 種或多種微生物的培養(yǎng)物；和
[0323] 化）在所述生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵所述培養(yǎng)物W產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物（在一個實(shí) 施方案中包括己醇）。
[0324] 在一個實(shí)施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0325] i.在由工業(yè)生產(chǎn)過程產(chǎn)生的含C0的氣體釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲；
[0326] ii.通過培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵含C0的氣體W產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物（在一個實(shí)施方案中 包括己醇），所述培養(yǎng)物含有本發(fā)明第一方面的一種或多種微生物。
[0327] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，被所述微生物發(fā)酵的氣態(tài)底物是含C0的氣態(tài)底物。 所述氣態(tài)底物可W是作為工業(yè)過程副產(chǎn)物或者從某些其他來源（例如汽車廢氣）獲得的含 C0的廢氣。在某些實(shí)施方案中，所述工業(yè)過程選自鐵金屬產(chǎn)品生產(chǎn)例如鋼鐵廠、有色金屬產(chǎn) 品生產(chǎn)、石油精煉過程、煤的氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、天然氣精煉、甲醇生產(chǎn)和焦 炭生產(chǎn)。在該些實(shí)施方案中，可在所述含C0的氣體被排放到大氣中之前使用任意方便的方 法從所述工業(yè)過程中將其捕獲。所述CO可w是合成氣（含一氧化碳和氨氣的氣體）的組 分。從工業(yè)過程產(chǎn)生的C0通常被燃燒掉來產(chǎn)生c〇2,因此本發(fā)明在減少c〇2溫室氣體排放 和產(chǎn)生用作生物燃料的下醇方面尤其有用。根據(jù)所述含C0的氣態(tài)底物的組成，還可能需要 對其進(jìn)行處理，W在將其引入所述發(fā)酵之前除去任何不需要的雜質(zhì)例如塵粒。例如，可使用 已知的方法過濾或洗涂所述氣態(tài)底物。
[032引應(yīng)理解，為使所述細(xì)菌生長并發(fā)生C0到己醇（和/或其他產(chǎn)物）的轉(zhuǎn)化，除所述 含C0的底物氣體外，需要將適合的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)料至所述生物反應(yīng)器。所述底物和培 養(yǎng)基可連續(xù)、分批或分批補(bǔ)料方式進(jìn)料至所述生物反應(yīng)器。營養(yǎng)培養(yǎng)基會含有足W允 許所使用的微生物生長的維生素和礦物質(zhì)。適合用于使用C0進(jìn)行發(fā)酵W產(chǎn)生己醇（和任 選的一種或多種其他產(chǎn)物）的厭氧培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的。例如，Biebel(Journalof IndustrialMicrobiology&Biotechnology(2001) 27, 18-26)記載了適合的培養(yǎng)基。所述 底物和培養(yǎng)基可WW連續(xù)、分批或分批補(bǔ)料方式進(jìn)料至所述生物反應(yīng)器。在本發(fā)明的一個 實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基如下文實(shí)施例部分所述。
[0329] 合乎需要地，所述發(fā)酵應(yīng)在用于發(fā)生C0到己醇（和/或其他產(chǎn)物）的發(fā)酵的合適 條件下進(jìn)行。應(yīng)考慮的反應(yīng)條件包括；壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養(yǎng)基抑、培養(yǎng)基 氧化還原電勢、攬拌速率（如果使用連續(xù)攬拌蓋反應(yīng)器的話）、接種物水平、確保所述液相 中的C0不成為限制的最大氣體底物濃度W及避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。
[0330] 此外，通常需要增加底物流中的C0濃度（或氣態(tài)底物中的C0分壓），從而提高 C0作為底物時發(fā)酵反應(yīng)的效率。在增加的壓力下操作可顯著增加C0從氣相轉(zhuǎn)移到液相的 速率，在液相中C0可被所述微生物作為碳源攝取用于產(chǎn)生所述己醇（和/或其他產(chǎn)物）。 該進(jìn)而意味著，當(dāng)生物反應(yīng)器保持在升高的壓力而非大氣壓力下時，可減少保留時間（定 義為生物反應(yīng)器中的液體體積除W輸入氣體流速）。最佳反應(yīng)條件將部分地取決于本發(fā) 明所使用的具體微生物。但是，一般來說，優(yōu)選的是所述發(fā)酵在高于環(huán)境壓力的壓力下進(jìn) 行。并且，因?yàn)榻o定的C0到己醇（和/或其他產(chǎn)物）的轉(zhuǎn)化率部分地是所述底物保留時間 的函數(shù)，并且實(shí)現(xiàn)所需保留時間進(jìn)而限定了生物反應(yīng)器的所需體積，所W使用增壓系統(tǒng)可 大大地減少所需的生物反應(yīng)器的體積，從而減少所述發(fā)酵設(shè)備的資金成本。依據(jù)美國專利 no. 5, 593,886中給出的實(shí)例，反應(yīng)器體積的減少與反應(yīng)器操作壓力的增加成線性比例，即 在10個大氣壓下操作的生物反應(yīng)器僅需要是在1個大氣壓下操作的生物反應(yīng)器體積的十 分之一。
[033。 已經(jīng)在別處描述了在升高的壓力下進(jìn)行氣體到己醇發(fā)酵的益處。例如，W0 02/08438描述了在30psig和75psig壓力下進(jìn)行的氣體到己醇的發(fā)酵，獲得的己醇產(chǎn)率分 別為150g/l/天和369g/l/天。但是，發(fā)現(xiàn)在大氣壓下使用相似的培養(yǎng)基和輸入氣體組成 進(jìn)行的示例性發(fā)酵產(chǎn)生1/20到1/10的己醇/升/天。
[0332] 還合乎需要的是，含C0的氣態(tài)底物的引入速率是該樣的，即確保液相中的C0濃度 不成為限制。該是因?yàn)镃0受限的條件的結(jié)果可能是己醇產(chǎn)物被所述培養(yǎng)物消耗。
[0333] 用于進(jìn)料至發(fā)酵反應(yīng)的氣流組成可對所述反應(yīng)的效率和/或成本有顯著影響。例 女口，化可降低厭氧發(fā)酵過程的效率。在發(fā)酵之前或之后的發(fā)酵過程各階段中，對不需要或不 必要的氣體的處理會增加該些階段的負(fù)擔(dān)（例如，當(dāng)在氣體流進(jìn)入生物反應(yīng)器之前將氣體 流壓縮時，不必要的能量可能被用于壓縮發(fā)酵中不需要的氣體）。因此，可能需要處理底物 流（尤其是來自工業(yè)來源的底物流）w除去不需要的組分并增加需要的組分的濃度。
[0334] 在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)菌培養(yǎng)物維持在水性培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，所述水 性培養(yǎng)基是基本厭氧微生物生長培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的，記載于例如美 國專利no. 5, 173, 429和5, 593,886和W0 02/08438,并且如下文實(shí)施例部分所述的。
[0335] 可通過本領(lǐng)域中已知的方法從發(fā)酵液中回收本發(fā)明方法產(chǎn)生的一種或多種產(chǎn)物 (在一個實(shí)施方案中，產(chǎn)生己醇、或含有己醇和/或一種或多種其他產(chǎn)物的混合醇流），所述 方法例如分觸或蒸發(fā)、滲透蒸發(fā)、W及萃取發(fā)酵（包括例如液-液萃?。?。也可通過本領(lǐng)域 中已知的方法從發(fā)酵液中回收副產(chǎn)物，例如酸（包括己酸鹽）。例如，可使用含有活性炭過 濾器的吸附系統(tǒng)或電滲析。或者，也可使用連續(xù)氣提。
[0336] 在本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過W下方式從所述發(fā)酵液中回收己醇和/或 一種或多種其他產(chǎn)物：從所述生物反應(yīng)器連續(xù)移出部分發(fā)酵液，從所述發(fā)酵液中分離微生 物細(xì)胞（方便地通過過濾），并從所述發(fā)酵液中回收一種或多種產(chǎn)物。醇可通過例如蒸觸方 便地回收，酸可通過例如吸附到活性炭上來回收。優(yōu)選地將分離的微生物細(xì)胞返回至所述 發(fā)酵生物反應(yīng)器。優(yōu)選地將已除去任何的醇和酸后剩余的無細(xì)胞滲透物返回至所述發(fā)酵生 物反應(yīng)器。可將另外的營養(yǎng)物（例如B族維生素）加入到所述無細(xì)胞滲透物中W在將其返 回至所述生物反應(yīng)器之前補(bǔ)充所述營養(yǎng)培養(yǎng)基。
[0337] 同樣地，如果如上所述調(diào)整所述發(fā)酵液的抑W增強(qiáng)己酸到活性炭的吸附，那么應(yīng) 在將其返回至所述生物反應(yīng)器之前將抑重新調(diào)整到與所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中發(fā)酵液類似 的抑。
[033引可使用W下很多技術(shù)從發(fā)酵液中回收玻巧酸，例如，酸化、與離子交換層析結(jié)合的 電滲析（SongandLee, 2006,EnzymeMicrobTechnol39, 352-361)、Ca(0H)沉淀與過濾和 添加硫酸（Leeetal2008,ApplMicrobiolBiotechnol79, 11-22)、或使用基于胺的萃取 劑（例如H正辛胺）的化學(xué)萃?。℉uhetal，2006,ProcBiochem41,1461-1465)。對于所 有的方法，具有游離酸形式而非鹽形式是至關(guān)重要的。但是大多數(shù)玻巧酸的生物技術(shù)產(chǎn)生 過程都在P冊-7的中性或微酸范圍內(nèi)操作?？紤]到玻巧酸的pKa(pKa= 4. 16和5. 61)，在 該些情況下，大部分玻巧酸都W鹽而非游離酸的形式存在。但是已知自產(chǎn)己醇梭菌和一氧 化碳營養(yǎng)型產(chǎn)己酸菌在所需要的抑4-6的低抑范圍下耐受和生長。
[0339] 可相對容易地通過W下方法從發(fā)酵液中回收支鏈氨基酸額氨酸、亮氨酸和異亮 氨酸；濃縮（例如反滲透）、生物質(zhì)的結(jié)晶或去除（例如超濾或離也）和離子交換層析 (Ikeda,A. , 2003,AminoAcidProductionProcesses,inR.FaurieandJ.Thommel(eds.) MicrobialproductionofL-aminacids, 1-35)。
[0340] 可通過任何已知的方法從發(fā)酵液中回收乳酸、甲酸、2-麗戊二酸和其他產(chǎn)物。但 是，例如，在乳酸的情況下，傳統(tǒng)的發(fā)酵過程產(chǎn)生可被收集和再酸化的乳酸巧沉淀?；蛘?，可 使用膜技術(shù)（例如電滲析）來分離乳酸。可通過在選擇性離子滲透膜上應(yīng)用適合的電勢從 發(fā)酵液中分離低濃度的乳酸。其他適合的技術(shù)包括納米過濾，其中單價離子可在壓力下選 擇性地穿過膜。
[0341] 應(yīng)理解，在一些情況下，可使用所述方法產(chǎn)生和回收除了己醇之外的產(chǎn)物（例如， 包括額氨酸、亮氨酸、玻巧酸、丙麗酸、乳酸和甲酸的一種或多種產(chǎn)物）。因此，本發(fā)明應(yīng)被理 解為包括用于產(chǎn)生該些產(chǎn)物中的一種或多種的方法。 陽34引連施例:
[0343] 現(xiàn)將參照如下非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。 陽344]連施例1:
[0345] 通過同源重組刪除自產(chǎn)己醇梭菌budA基因
[0346] 使用包含自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的budA基因的5'和3'同源臂的質(zhì)粒進(jìn)行遺傳 修飾（圖1-2)。使用新的甲基轉(zhuǎn)移酶將所述質(zhì)粒在體內(nèi)甲基化，接著將其轉(zhuǎn)化到自產(chǎn)己醇 梭菌DSM23693(DSMZ，德國）中。已經(jīng)通過PCR和通過抑制自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693AbudA 菌株中的2, 3-下二醇的產(chǎn)生表明了所述budA基因的敲除。
[0347] 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0348] 本發(fā)明使用了標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)，該些技術(shù)由Sambrooketal, 1989 和Ausubeletal，1987記載。從NCBI中獲得了自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的5'上游側(cè)翼同 源臂（Seq.ID3)和3'下游側(cè)翼同源臂（Seq.ID4)的DNA序列。
[034引 根據(jù)制造商的說明書，使用Invitrogen的化relinkGenomicDNAminikit分離 來自自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693的基因組DM。
[0巧0] W自產(chǎn)己醇梭菌DSM23693基因組DNA作模板、iProof高保真DNA聚合酶炬io-Rad Ubratories)和表1中的寡核巧酸通過PCR擴(kuò)增所述5' (Seq.ID3)和3'側(cè)翼同源臂（Seq.ID4)，并且PCR所用程序如下；98°C初始變性30s，然后25個循環(huán)的變性（98C，10s)、退火 (60。15s)和延伸（72。30s)，然后是最后延伸步驟（72。7min)。
[0巧1] 塞1;用于克隆的寡核巧酸
[0巧2]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸微生物，所述微生物被改造為適于在發(fā)酵含一氧 化碳的底物時產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物以及降低量的或基本不產(chǎn)生2, 3- 丁二醇和/或其前體， 所述微生物與親代微生物相比包含破壞了 2, 3- 丁二醇生物合成途徑的一種或多種遺傳修 飾。
2. -種重組的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸微生物，所述微生物被改造為適于在發(fā)酵含一氧 化碳的底物時產(chǎn)生乙醇作為主要產(chǎn)物以及降低量的或基本不產(chǎn)生2, 3- 丁二醇和/或其前 體，所述微生物與親代微生物相比包含破壞了 2, 3- 丁二醇生物合成途徑的一種或多種遺 傳修飾。
3. 權(quán)利要求2的重組微生物，其中所述微生物被改造為適于進(jìn)一步產(chǎn)生甲酸、乳酸、丙 酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳酸、蘋果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、檸檬酸 中的一種或多種。
4. 權(quán)利要求2或3的重組微生物，其中與親代微生物相比，所述微生物被改造為適于產(chǎn) 生的增加量的乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳酸、蘋果 酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、檸檬酸中的一種或多種。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述微生物包括至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了一種或多種能將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰乳酸的酶的表達(dá)和/或活性。
6. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述微生物包含至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了一種或多種能將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的酶的表達(dá)和/或活性。
7. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述微生物包含至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了一種或多種能將乙偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3- 丁二醇的酶的表達(dá)和/或活性。
8. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述微生物包含至少一種遺傳修飾，所 述遺傳修飾破壞了兩種或多種能將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰乳酸、將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻和將 乙偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3- 丁二醇的酶的組合的表達(dá)和/或活性。
9. 權(quán)利要求5或8的重組微生物，其中所述一種或多種能將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰乳酸的 酶是乙酰乳酸合酶（alsS)。
10. 權(quán)利要求6或8的重組微生物，其中所述一種或多種能將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的 酶是乙酰乳酸脫羧酶（budA)。
11. 權(quán)利要求7或8的重組微生物，其中所述一種或多種能將乙偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3- 丁二 醇的酶為選自以下的酶：2, 3- 丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)、乙偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氫酶。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的重組微生物，其中所述一種或多種遺傳修飾破壞 了乙酰乳酸合酶（alsS)、乙酰乳酸脫羧酶（BudA)、2, 3-丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)、乙偶姻還 原酶、伯醇：仲醇脫氫酶中的一種或多種的表達(dá)和/或活性。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的重組微生物，其中所述親代微生物選自自產(chǎn)乙醇梭 菌（Clostridium autoethanogenum)、揚(yáng)氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、拉氏梭菌 (Clostridium ragsdalei)和科斯卡塔梭菌（Clostridium coskatii)。
14. 權(quán)利要求12的重組微生物，其中所述親代微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693。
15. -種產(chǎn)生重組的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸微生物的方法，所述微生物能夠在發(fā)酵含 一氧化碳的底物時產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物以及降低量的或基本不產(chǎn)生2, 3- 丁二醇和/或其 前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸親代微生物以破壞2, 3- 丁二醇生物 合成途徑。
16. -種產(chǎn)生重組的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸微生物的方法，所述微生物能夠在發(fā)酵含 一氧化碳的底物時產(chǎn)生乙醇作為主要產(chǎn)物以及降低量的或基本不產(chǎn)生2, 3- 丁二醇和/或 其前體，所述方法包括遺傳修飾一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸親代微生物以破壞2, 3- 丁二醇生 物合成途徑。
17. 權(quán)利要求15或16的方法，其中所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到所述親 代微生物中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種基因，所述基因編碼能將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰 乳酸、將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻和/或?qū)⒁遗家鲛D(zhuǎn)化成2, 3- 丁二醇的一種或多種酶。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入到所述親代微 生物中，所述遺傳修飾破壞了兩種或多種基因的組合，所述基因編碼能將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙 酰乳酸、將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻和/或?qū)⒁遗家鲛D(zhuǎn)化成2, 3- 丁二醇的酶。
19. 權(quán)利要求17或18的方法，其中所述一種或多種能將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰乳酸的酶 是乙酰乳酸合酶（alsS)，所述一種或多種能將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脫 羧酶（budA)和/或所述一種或多種能將乙偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3-丁二醇的酶為選自以下的酶： 2, 3-丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)、乙偶姻還原酶、伯醇：仲醇脫氫酶。
20. 權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括將一種或多種遺傳修飾引入 到所述親代微生物中，所述遺傳修飾破壞了一種或多種基因，所述基因編碼乙酰乳酸合酶 (alsS)、乙酰乳酸脫羧酶（BudA)和2, 3- 丁二醇脫氫酶（2, 3bdh)中的一種或多種。
21. 通過權(quán)利要求15-20的任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的重組微生物。
22. -種用于產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的方法，所述方法包括使用如權(quán)利要求1-14和21中 任一項(xiàng)的微生物發(fā)酵含CO的底物。
23. -種用于產(chǎn)生乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳 酸、蘋果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、檸檬酸中的一種或多種的方法，所述方法包括使用如權(quán) 利要求1-14和21中任一項(xiàng)的微生物發(fā)酵含CO的底物。
24. 權(quán)利要求22或23的方法，所述方法包括如下步驟： (a) 將含CO的底物提供給生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器含有一種或多種權(quán)利要求1-13 和19中任一項(xiàng)的微生物的培養(yǎng)物；和 (b) 在所述生物反應(yīng)器中厭氧發(fā)酵所述培養(yǎng)物以產(chǎn)生所述一種或多種產(chǎn)物，優(yōu)選包括 乙醇。
25. 權(quán)利要求22或23的方法，所述方法包括如下步驟： (a) 在由工業(yè)生產(chǎn)過程產(chǎn)生的含CO的氣體被釋放到大氣中之前，將所述氣體捕獲； (b) 通過培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含CO的氣體以產(chǎn)生所述一種或多種產(chǎn)物，優(yōu)選包括乙 醇，所述培養(yǎng)物含有一種或多種權(quán)利要求1-13和19中任一項(xiàng)的微生物。
26. 權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述底物含有至少約20體積％至約100體 積％的CO。
27. 權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括從所述發(fā)酵液中回收所述 一種或多種產(chǎn)物的步驟。
28. 通過權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的一種或多種產(chǎn)物。
29. 權(quán)利要求28的一種或多種產(chǎn)物，其中所述一種或多種產(chǎn)物選自乙醇、甲酸、乳酸、 丙酮酸、琥珀酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乳酸、蘋果酸、延胡索酸、檸檬酸和2-酮戊 二酸。
【文檔編號】C12N15/53GK104395455SQ201380018640
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】M·科普克, S·那加拉祖, 陳銥婷 申請人:新西蘭郎澤科技公司