角質(zhì)酶變體以及對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及角質(zhì)酶變體。本發(fā)明還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞；以及使用這些變體的方法。
【專利說(shuō)明】角質(zhì)酶變體以及對(duì)其進(jìn)行編碼的多核苷酸
[0001 ] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)含有一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將該序列表通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及角質(zhì)酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產(chǎn)生這些變體的方法以及使 用這些變體的方法。
[0005] 相關(guān)技術(shù)說(shuō)明
[0006] 角質(zhì)酶是能夠水解底物角質(zhì)的脂肪分解酶。已知角質(zhì)酶來(lái)自各種真菌（P.E.科 拉圖庫(kù)蒂（Kolattukudy)于"脂酶（Lipases) "，編輯B?柏格斯卓姆（B〇rgStr6m )和 H.L.布羅克曼（Brockman),愛思唯爾（Elsevier) 1984, 471-504)，例如來(lái)自豌豆根腐鐮孢 (Fusarium solani pisi) (S?隆吉（Longhi)等人，分子生物學(xué)雜志（Journal of Molecular Biology)，268 (4) ,779-799(1997))和特異腐質(zhì)霉（US 5827719)的角質(zhì)酶。來(lái)自特異腐質(zhì) 霉的角質(zhì)酶的變體從例如W0 00/34450中已知。
[0007] 角質(zhì)酶可被用于丙烯酸酯的聚合中。丙烯酸酯是工業(yè)上重要的具有廣泛商業(yè)應(yīng)用 的化合物。在這些分子中存在的a-雙鍵可被用于聚合以產(chǎn)生終產(chǎn)品，如油漆、塑料和粘合 齊U。傳統(tǒng)上，丙烯酸和甲基丙烯酸的酯類是在高溫下用聚合抑制劑和用硫酸作為催化劑來(lái) 化學(xué)地制備的。丙烯酸酯的酶轉(zhuǎn)?；饔檬莻鹘y(tǒng)化學(xué)的一個(gè)"綠色"選擇并且可以提供從 葡萄糖和乳酸等可再生能源起始到丙烯酸酯的可持續(xù)路線。
[0008] 本發(fā)明提供了與其親本相比具有改進(jìn)的特性的一種親本角質(zhì)酶的變體，特別是具 有增加的轉(zhuǎn)?；钚缘淖凅w。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明涉及一種親本角質(zhì)酶的分離的變體，該變體包括在與SEQ ID N0:2的成熟 多肽的氨基酸殘基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的 取代，該取代選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y ,V ； I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；G45A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；N52E ；F70A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, ff, Y, V ；G120S ；G143A, R, N, D, C, Q, E，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V ;L167A ;以及L174N，Q，并且該變體具有角質(zhì)酶活性。
[0011] 本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建 體、載體和宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些變體的方法。
[0012] 本發(fā)明還涉及修飾表面、將植物生物質(zhì)中的膠質(zhì)轉(zhuǎn)化為化學(xué)原料以及再循環(huán)聚酯 的方法。
[0013] 定義
[0014] 角質(zhì)酶：術(shù)語(yǔ)"角質(zhì)酶"意指具有角質(zhì)酶活性（EC3. 1. 1. 74)的一種脂肪分解酶， 該酶催化以下反應(yīng)：角質(zhì)+ H20 #角質(zhì)單體。根據(jù)http: //www. chem. q麗. ac. uk/iubmb/enzyme處可獲得的酶命名法，能夠水解底物角質(zhì)的脂肪分解酶被歸類為 EC3. 1.1.74。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)實(shí)例中所述的程序確定角質(zhì)酶活性。在一個(gè)方面， 本發(fā)明的變體具有SEQ ID N0:2的成熟多肽的角質(zhì)酶活性的至少20%、例如至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0015] 等位基因變體：術(shù)語(yǔ)"等位基因變體"意指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個(gè) 或更多個(gè)替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊模ㄔ谒幋a的多肽中沒(méi)有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0016] cDNA :術(shù)語(yǔ)"cDNA"是指可以通過(guò)得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對(duì)應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先 的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟 進(jìn)行加工，包括剪接。
[0017] 編碼序列：術(shù)語(yǔ)"編碼序列"意指一種多核苷酸，該多核苷酸直接規(guī)定了一種變體 的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由一個(gè)開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個(gè)起 始密碼子（如ATG、GTG或TTG)開始并且以一個(gè)終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編 碼序列可以是一種基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0018] 控制序列：術(shù)語(yǔ)"控制序列"意指為編碼本發(fā)明的一種變體的一種多核苷酸的表達(dá) 所需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該變體的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是原生（native)的 (即，來(lái)自相同基因）或外源的（即，來(lái)自不同基因），或相對(duì)于彼此是原生的或外源的。此 類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn) 錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些 控制序列與編碼一種變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控 制序列可以提供有多個(gè)接頭。
[0019] 表達(dá)：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括涉及一種變體的產(chǎn)生的任何步驟，包括（但不限于）轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
[0020] 表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指一種直鏈或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼一種 變體的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。
[0021] 片段：術(shù)語(yǔ)"片段"意指在一種成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一個(gè)或多個(gè) (例如若干個(gè)）氨基酸的一種多肽；其中該片段具有角質(zhì)酶活性。在一個(gè)方面，該片段的氨 基酸數(shù)目是該成熟多肽的氨基酸數(shù)目的至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少 70%、至少75%、至少85%、至少90%、或至少95%。
[0022] 宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指易于用包括本發(fā)明的一種多核苷酸的一種核酸構(gòu) 建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制 期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0023] 改進(jìn)的特性：術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的特性"意指與變體相關(guān)的與親本相比得到改進(jìn)的特征。 這類改進(jìn)的特性包括但不限于催化效率、催化速率、比活性、底物結(jié)合、底物裂解、底物特異 性。
[0024] 分離的：術(shù)語(yǔ)"分離的"意指在自然界中不存在的一種形式或環(huán)境中的一種物質(zhì)。 分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括（1)任何非天然存在的物質(zhì)；（2)至少部分地從與其在自 然界中相關(guān)聯(lián)的一種或多種或全部天然存在的組分中除去的任何物質(zhì)，包括但不局限于任 何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)相對(duì)于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)通過(guò)人工手動(dòng) 修飾的任何物質(zhì)；或者（4)通過(guò)相對(duì)于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分增加該物質(zhì)的量而修飾 的任何物質(zhì)（例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的 啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用）。一種分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0025] 成熟多肽：術(shù)語(yǔ)"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾（例如N-端加工、C-端 截短、糖基化、磷酸化等）之后處于其最終形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID N0:2 的氨基酸1至194。本領(lǐng)域中已知的是，一個(gè)宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達(dá)的兩種 或更多種不同成熟多肽（即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0026] 成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有角質(zhì)酶活性的一種 成熟多肽的一種多核苷酸。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸109至 690。
[0027] 突變體：術(shù)語(yǔ)"突變體"意指編碼一種變體的多核苷酸。
[0028] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在的 基因，或其被修飾成以本來(lái)在自然界中不存在的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其包 含一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0029] 可操作地連接：術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指一種配置，其中一個(gè)控制序列相對(duì)于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個(gè)適當(dāng)位置處，以使得控制序列指引編碼序列的表達(dá)。
[0030] 親本或親本角質(zhì)酶：術(shù)語(yǔ)"親本"或"親本角質(zhì)酶"意指一種角質(zhì)酶，對(duì)該角質(zhì)酶進(jìn) 行一個(gè)改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體。親本可以是天然存在的（野生型）多肽或其變體或片 段。
[0031] 序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列 一致性"描述。
[0032] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人，2000,遺傳 學(xué)趨勢(shì)（Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實(shí) 施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德爾曼和翁施，1970,分子生物學(xué)雜志 (J. Mol. Biol.) 48:443-453)來(lái)測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的這些參數(shù) 是空位開放罰分10、空位延伸罰分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致 性，并且如下計(jì)算：
[0033] (一致的殘基X 100V (比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0034] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套 件，賴斯等人，2000,同上）（優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實(shí)施的尼德爾 曼-翁施算法（尼德爾曼和翁施，1970,同上）來(lái)測(cè)定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序 列一致性。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化 選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0035] (一致的脫氧核糖核苷酸x 100V(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0036] 子序列：術(shù)語(yǔ)"子序列"意指使一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）核苷酸從成熟多肽編 碼序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中該子序列編碼具有角質(zhì)酶活性的一個(gè)片 段。在一個(gè)方面，一個(gè)子序列含有編碼成熟多肽的核苷酸的數(shù)目的至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少85%、至少90%、或至少95%。
[0037] 變體：術(shù)語(yǔ)"變體"意指在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處包括一個(gè)取代的具 有角質(zhì)酶活性的一種多肽。一個(gè)取代意指用一個(gè)不同氨基酸置換占用一個(gè)位置的氨基酸。 本發(fā)明的變體具有SEQ ID N0:2的成熟多肽的角質(zhì)酶活性的至少20%、例如至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0038] 野生型角質(zhì)酶：術(shù)語(yǔ)"野生型"角質(zhì)酶意指由見于自然界中的一種天然存在的微生 物（如一種細(xì)菌、酵母或絲狀真菌）表達(dá)的一種角質(zhì)酶。
[0039] 變體命名慣例
[0040] 出于本發(fā)明的目的，將SEQ ID N0:2中披露的成熟多肽用以確定另一種角質(zhì)酶中 的對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種角質(zhì)酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:2中披露的成熟多肽進(jìn) 行比對(duì)，并且基于該比對(duì)，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴 斯等人，2000,遺傳學(xué)趨勢(shì)16:276-277)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所實(shí) 施的尼德爾曼-翁施算法（尼德爾曼和翁施，1970,分子生物學(xué)雜志48:443-453)來(lái)確定與 SEQ ID N0:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置編號(hào)。使用的 這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分〇. 5,以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩陣。
[0041] 可以通過(guò)使用若干計(jì)算機(jī)程序、使用其對(duì)應(yīng)默認(rèn)參數(shù)比對(duì)多個(gè)多肽序列來(lái)確定 在另一種角質(zhì)酶中的相應(yīng)氨基酸殘基的鑒別，所述計(jì)算機(jī)程序包括但不限于MUSCLE(通 過(guò)對(duì)數(shù)預(yù)期的多種序列比較；版本3. 5或更新版本；埃德加（Edgar)，2004,核酸研究 (Nucleic Acids Research) 32:1792_1797)、MAFFT (版本 6. 857 或更新版本；加藤（Katoh) 和庫(kù)馬（Kuma)，2002,核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005,核酸研究33:511-518 ; 加藤和都（Toh)，2007,生物信息學(xué)（Bioinformatics) 23:372-374 :加藤等人，2009,分子 牛物學(xué)方法（Methods in Molecular Biologv) 537:39-64:加藤和都，2010,牛物信息學(xué) 26:1899-1900)、以及采用ClustalW(l. 83或更新版本；湯姆斯（Thompson)等人，1994,核酸 研究 22:4673-4680)的 EMBOSS EMMA。
[0042] 當(dāng)其他酶與SEQ ID N0:2的成熟多肽相背離使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不 能檢測(cè)其相互關(guān)系時(shí)（林達(dá)爾（Lindahl)和埃洛弗松（Elofsson)，2000,分子生物學(xué)雜 志）295 :613-615)，可應(yīng)用其他成對(duì)序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可 以使用搜索程序來(lái)獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示（特征曲線）來(lái)搜索數(shù)據(jù) 庫(kù)。例如，PSI-BLAST程序通過(guò)迭代數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程來(lái)產(chǎn)生多個(gè)譜，并且能夠檢測(cè)遠(yuǎn)距離 同源物（阿特休爾（Atschul)等人，1997,核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或 超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中具有一個(gè)或多個(gè)代表，則可以實(shí)現(xiàn)甚至更大的靈敏度。程序如 GenTHREADER(瓊斯（Jones)，1999,分子生物學(xué)雜志 287:797-815 ;麥古芬（McGuffin)和瓊 斯，2003,生物信息學(xué)19:874-881)利用來(lái)自不同來(lái)源（PSI-BLAST、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)比 對(duì)譜、以及溶劑化勢(shì)）的信息作為預(yù)測(cè)查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，高 夫（Gough)等人，2000,分子生物學(xué)雜志313:903-919的方法可以用于比對(duì)未知結(jié)構(gòu)的序列 與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫(kù)中的超家族模型。這些比對(duì)進(jìn)而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并 且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評(píng)定這類模型的準(zhǔn)確度。
[0043] 對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白，若干工具和資源可用于檢索并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如， 蛋白的SC0P超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行比對(duì)，并且那些比對(duì)是可訪問(wèn)的并且可下載的。 可以使用多種算法如距離比對(duì)矩陣（奧爾姆（Holm)和桑德（Sander)，1998,蛋白質(zhì) (Proteins) 33:88-96)或者組合延伸（Shindyalov 和伯恩（Bourne)，1998,蛋白質(zhì)工程 11:739-747)比對(duì)兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實(shí)施可以另外用于查詢具 有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物（例如，奧爾姆和帕克（Park)， 2000,生物信息學(xué) 16:566-567)。
[0044] 在描述本發(fā)明的變體中，以下所述的命名法適于方便參考。使用公認(rèn)的IUPAC單 字母或三字母氨基酸縮寫。
[0045] 取代。對(duì)于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此， 在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為"Thr226Ala"或者"T226A"。多個(gè)突變由加號(hào) (" + "）分開，例如"Gly205Arg+Ser411Phe"或"G205R+S411F"代表分別在位置205和位置 411處甘氨酸（G)被精氨酸（R)取代，并且絲氨酸（S)被苯丙氨酸（F)取代。
[0046] 多個(gè)取代。何含多個(gè)取代的奪體由加號(hào)(" + "）分開，例如"Argl70Tyr+Glyl95Glu" 或"R170Y+G195E"代表在位置170和位置195處的精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸 取代。
[0047] 不同的取代。在可以在一個(gè)位置處引入不同取代的情況下，這@不同取代由 逗號(hào)分開，例如"Argl70Tyr，Glu"代表在位置170處的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取 代。因此，"Tyrl67Gly, Ala+Argl70Gly, Ala" 表示以下變體："Tyrl67Gly+Argl70Gly"、 "Tyrl67Gly+Argl70Ala"、"Tyrl67Ala+Argl70Gly" 以及 "Tyrl67Ala+Argl70Ala"。
[0048] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0049] 本發(fā)明涉及分離的角質(zhì)酶變體，這些變體包含在與SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨 基酸殘基36、45、52、70、120、174相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處的取代，其中 該變體具有角質(zhì)酶活性。
[0050] 變體
[0051] 本發(fā)明涉及一種親本角質(zhì)酶的分離的變體，其包括在與SEQ ID N0:2的成熟多肽 的氨基酸殘基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的取 代，該取代選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y， V ； I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；G45A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T ,ff, Y, V ；N52E ；F70A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, ff, Y, V ；G120S ；G143A, R, N, D, C, Q, E ，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V ;L167A ;以及L174N，Q，并且該變體具有角質(zhì)酶活性。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施例中，該變體與該親本角質(zhì)酶的氨基酸序列具有至少60%、例如至少 65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的 序列一致性。
[0053] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該變體與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少70%，例如至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95 %、例如至少96 %、至少97 %、至少98 %、或者至少99 %、但小于100 %的序列一致性。
[0054] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的變體中的取代的數(shù)目是1-20個(gè)，例如1-10個(gè)和1-5個(gè)，如1 個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、 17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、或20個(gè)取代。
[0055] 在另一方面，變體包含在與位置 P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V ; I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；G45A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W ,Y, V ；N52E ；F70A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, ff, Y, V ；G120S ；G143A, R, N, D, C, Q, E, H ，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V ;L167A ;以及L174N，Q相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置 處的取代。優(yōu)選地，該變體包括在與位置P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V ; I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；G45A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W ,Y, V ；N52E ；F70A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, ff, Y, V ；G120S ；G143A, R, N, D, C, Q, E, H ，I，L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V ;L167A ;以及L174N, Q中任一個(gè)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、 五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、或九個(gè)位置處的取代。
[0056] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置31的位置處的取代或由其組成。在另一個(gè) 方面，對(duì)應(yīng)于位置31的一個(gè)位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、 Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 取代。在另一個(gè)方面中，該變體包括 SEQ ID N0:2 的成熟多肽的取代 P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W，Y，V 或由其組成。
[0057] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置36的位置處的取代或由其組成。在另一個(gè) 方面，對(duì)應(yīng)于位置36的一個(gè)位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、 Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 取代。在另一個(gè)方面中，該變體包括 SEQ ID N0:2 的成熟多肽的取代 I36A，R，N，D，C，Q，E，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V 或由其組成。
[0058] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置45的位置處的取代或由其組成。在另一個(gè) 方面，對(duì)應(yīng)于位置45的一個(gè)位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、lie、 Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 取代。在另一個(gè)方面中，該變體包括 SEQ ID N0:2 的成熟多肽的取代 G45A，R，N，D，C，Q，E，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V 或由其組成。
[0059] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置52的位置處的取代或由其組成。在另一方 面，與位置52相對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、 Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，優(yōu)選被Glu取代。在另一個(gè)方面中，該 變體包括SEQ ID N0:2的成熟多肽的取代N52E或由其組成。
[0060] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置70的位置處的取代或由其組成。在另一個(gè) 方面，對(duì)應(yīng)于位置70的一個(gè)位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、 Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 取代。在另一個(gè)方面中，該變體包括 SEQ ID N0:2 的成熟多肽的取代 F70A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V 或由其組成。
[0061] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置120的位置處的取代或由其組成。在另一 方面，在對(duì)應(yīng)于位置120的位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、His、lie、 Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或 Val,優(yōu)選被 Ser 取代。在另一個(gè)方面中，該 變體包括SEQ ID N0:2的成熟多肽的取代G120S或由其組成。
[0062] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置143的位置處的取代或由其組成。在另一 個(gè)方面，對(duì)應(yīng)于位置143的一個(gè)位置處的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、His、 lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val 取代。在另一個(gè)方面中，該變體包 括 SEQ ID N0:2 的成熟多肽的取代 G143A，R，N，D，C，Q，E，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V 或由其 組成。
[0063] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置167的位置處的取代或由其組成。在另一 方面，對(duì)應(yīng)于位置167的位置處的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、 lie、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或 Val 取代，優(yōu)選被 Ala 取代。在另一個(gè)方面 中，該變體包括SEQ ID N0:2的成熟多肽的取代L167A或由其組成。
[0064] 在另一個(gè)方面，變體包括在對(duì)應(yīng)于位置174的位置處的取代或由其組成。在另一 方面，對(duì)應(yīng)于位置174的位置處的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、 lie、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或 Val 取代，優(yōu)選被 Asn 或 Gin 取代。在另一 個(gè)方面中，該變體包括SEQ ID N0:2的成熟多肽的取代L174N，Q或由其組成。
[0065] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括選自以下的突變/突變的組合中的至少一種或 由其組成的變體：（a)E30Q ;(b)P31V ;(c)I36N ;(d)I36Q ;(e)I36S ;(f)G45N ;(g)R51P ;(h) N52E ； (i)F70A ； (j)F70S ； (k)G120S ； (1)G143R ； (m)L167A ； (n)L174N ； (o)L174Q ； (p)A14P/ I169A ; (q)A14P+N52E+I169A ;或（r)G8D+A14P+R51P+E179Q。
[0066] 變體可以進(jìn)一步包括在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）其他位置處的一個(gè)或多個(gè)另外 的取代。
[0067] 這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會(huì)顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活 性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個(gè)氨基酸的較小缺失；較小的氨基-或羧基-末 端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多達(dá)20-25個(gè)殘基的較小接頭肽；或便于通過(guò)改變凈 電荷或另一種功能來(lái)純化的較小延伸，如聚組氨酸段（tract)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 [0068] 保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、異亮氨酸及纈氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取代是本 領(lǐng)域已知的并且例如由札諾伊拉特（他1^ &也）和1?丄.希爾（把11)，1979在蛋白質(zhì)〇116 Proteins),學(xué)術(shù)出版社（Academic Press),紐約中描述。常見取代是Ala/Ser、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0069] 可替代地，氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基 酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH，等等。
[0070] 該變體還可包括在與SEQ ID N0:2的成熟多肽的位置：G8D、A14P、E30Q、E47R、 E47K、R51P、I169A、il69V、或E179Q相對(duì)應(yīng)的一個(gè)位置處的取代。
[0071] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變（坎寧漢 (Cunningham)和威爾斯（Wells)，1989,科學(xué)（Science) 244:1081-1085)來(lái)鑒定多膚中的必 需氨基酸。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在該分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且對(duì)所得 突變體分子的角質(zhì)酶活性進(jìn)行測(cè)試以鑒別對(duì)于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還 參見，希爾頓（Hilton)等人，1996,生物化學(xué)雜志271:4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點(diǎn) 氨基酸的突變，如通過(guò)以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn)行確定， 對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參見，例如，德弗 斯（de Vos)等人，1992,科學(xué)255:306-312;史密斯（Smith)等人，1992,分子生物學(xué)雜志 224:899-904 ;烏樂(lè)達(dá)維爾（Wlodaver)等人，1992,歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)309:59-64。還 可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)來(lái)推斷鑒別必需氨基酸。
[0072] 這些變體可以由100至194個(gè)、150至194個(gè)、100至150個(gè)、或150至194個(gè)氨基 酸組成。
[0073] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種變體，其中相對(duì)于親本的角質(zhì)酶活性，該變體的 角質(zhì)酶活性更高。
[0074] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種變體，其中角質(zhì)酶活性是在短鏈烷基酯底物上 測(cè)量的，優(yōu)選地其中該底物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：異丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、 丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施例中，與親本酶相比，該變體具有改進(jìn)的催化效率。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施例中，與親本酶相比，該變體具有改進(jìn)的催化速率。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施例中，與親本酶相比，該變體具有改進(jìn)的比活性。
[0078] 在一個(gè)實(shí)施例中，與親本酶相比，該變體具有改進(jìn)的底物結(jié)合。
[0079] 在一個(gè)實(shí)施例中，與親本酶相比，該變體具有改進(jìn)的底物裂解。
[0080] 在一個(gè)實(shí)施例中，與親本酶相比，該變體具有改進(jìn)的底物特異性。
[0081] 親本角質(zhì)酶
[0082] 該親本角質(zhì)酶可以是（a) -種與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少70%序列一致 性的多肽；(b) -種由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽編 碼序列具有至少70 %序列一致性。
[0083] 在一方面，該親本與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或者100%的序列一致性，這一成熟多肽具有角質(zhì)酶 活性。在一個(gè)方面，該親本的氨基酸序列與SEQ ID N0:2的成熟多肽相差不超過(guò)20個(gè)，例 如1-10個(gè)，1-5個(gè)，或例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12 個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、或20個(gè)氨基酸。
[0084] 在另一個(gè)方面，該親本包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列或由其組成。在另一個(gè)方 面，該親本包括SEQ ID N0:2的成熟多肽或由其組成。在另一個(gè)方面中，該親本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至194或由其組成。
[0085] 在另一方面，該親本是SEQ ID N0:2的成熟多肽的、包含至少194個(gè)氨基酸殘基、 例如至少150個(gè)氨基酸殘基以及至少100個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)片段。
[0086] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該親本是SEQ ID N0:2的成熟多肽的一個(gè)等位變體。
[0087] 在另一方面，該親本由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、低 嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度 條件下與（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列、或（ii) (i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交（薩拉布 魯克（Sambrook)等人，1989,分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，紐約）。
[0088] 可以使用SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列、連同SEQ ID NO:2的多肽或其片 段來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)鑒別并克隆對(duì)來(lái)自不同屬或種的菌株的親 本進(jìn)行編碼的DNA。具體而言，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，使用這類探針與感興趣的細(xì)胞 的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒別和分離其中的對(duì)應(yīng)基因。這類探針可以明顯短于完整 序列，但是長(zhǎng)度應(yīng)為至少15,例如至少25、至少35、或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，該核酸探 針的長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至少400 個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核苷酸、 或至少900個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記（例如，用 32P、3H、 35S、生物素、或抗生物素蛋白），以檢測(cè)相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針。
[0089] 可以針對(duì)與上文所述的探針雜交并編碼一個(gè)親本的DNA，來(lái)篩選由這類其他菌株 制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)。來(lái)自這類其他菌株的基因組DNA或其他DNA可以通過(guò)瓊 脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來(lái)分離。來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn) 移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒別與SEQ ID NO: 1或其子序列 雜交的克隆或DNA，將載體材料用于DNA印跡中。
[0090] 出于本發(fā)明的目的，雜交表明多核苷酸在非常低到非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與一種被 標(biāo)記的核酸探針雜交，該探針對(duì)應(yīng)于（i)SEQ ID N0:1 ;(ii)SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序 列；（iii)其全長(zhǎng)互補(bǔ)體；或（iv)其子序列?？梢允褂美鏧-射線膠片或本領(lǐng)域已知的任 何其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)在這些條件下該核酸探針?biāo)s交的分子。
[0091] 在一個(gè)方面，該核酸探針是SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)方面，該 核酸探針是對(duì)SEQ ID N0:2的多肽；其成熟多肽；或其片段進(jìn)行編碼的多核苷酸。在另一個(gè) 方面，該核酸探針是SEQ ID N0:1。
[0092] 在另一個(gè)實(shí)施例中，該親本是由一種多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1 的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99 %或者100%的序列一致性。
[0093] 該多肽可以是一種雜合多肽，其中一種多肽的一個(gè)區(qū)域在另一種多肽的一個(gè)區(qū)域 的N-末端或C-末端處融合。
[0094] 親本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的 N-末端或C-末端處融合。通過(guò)將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而 產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼 序列，這樣使得它們?cè)诳騼?nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和終止 子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)蛋白技術(shù)來(lái)構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生（庫(kù)珀 (Cooper)等人，1993,歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志12:2575-2583 ;道森（Dawson)等人，1994， 科學(xué) 266:776-779)。
[0095] 融合多肽可以在兩個(gè)多肽之間進(jìn)一步包括一個(gè)切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌 之時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放出這兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不局限于在以 下文獻(xiàn)中披露的位點(diǎn)：馬?。∕artin)等人，2003,工程微生物和生物技術(shù)雜志（J. Ind. Microbiol. Biotechnol.) 3:568-576 ;斯瓦蒂娜（Svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志 (J.Biotechnol.) 76:245-251 ;拉斯馬森-威爾遜（Rasmussen-Wilson)等人，1997， 應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)（Appl. Environ. Microbiol. )，63:3488-3493 ;沃德（Ward)等 人，1995，生物技術(shù)（Biotechnology) 13:498-503 ;以及孔特雷拉斯（Contreras)等 人，1991，生物技術(shù)（Biotechnology) 9:378-381 ;伊頓（Eaton)等人，1986，生物化學(xué) (Biochemistry) 25:505-512 ;柯林斯-瑞思（Collins-Racie)等人，1995，生物技術(shù) 13:982-987 ;卡特（Carter)等人，1989,蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)（Proteins:Struc ture，F(xiàn)unction，and Genetics) 6:240-248 ;以及史蒂文斯（Stevens)，2003,世界藥物發(fā)現(xiàn) (Drug Discovery World)4:35~48〇
[0096] 該親本可以從任何屬的微生物中獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結(jié)合一種給定 的來(lái)源使用的術(shù)語(yǔ)"從...中獲得"應(yīng)意指由多核苷酸編碼的親本是由該來(lái)源或者由其中 已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的一種菌株產(chǎn)生的。在一個(gè)方面，該親本是胞外分泌的。 [0097] 該親本可以是一種細(xì)菌角質(zhì)酶。例如，該親本可以是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽， 如芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、腸球菌屬（Enterococcus)、土芽孢桿菌 屬（Geobacillus)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬 (Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、或鏈霉菌 屬（Streptomyces)角質(zhì)酶；或一種革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬（Campylobacter)、 大腸桿菌（E.coli)、黃桿菌屬（Flavobacterium)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、螺桿菌 屬（Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬（Neisseria)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、沙門菌屬（Salmonella)或脈原體屬（Ureaplasma)角質(zhì)酶。
[0098]在一方面，該親本是嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿 菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌（Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、堅(jiān)硬芽抱桿菌（Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus)、遲 緩芽抱桿菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 桿菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、或蘇云金芽抱桿 菌（Bacillus thuringiensis)角質(zhì)酶。
[0099]在另一個(gè)方面，該親本是一種類馬鏈球菌（Streptococcus equisimilis)、化膿鏈 球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)角 質(zhì)酶。
[0100] 在另一方面，該親本是不產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces achromogenes)、阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)或變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans)角質(zhì)酶。
[0101] 該親本可以是一種細(xì)菌角質(zhì)酶。例如，該親本可以是一種酵母角質(zhì)酶，如假絲 酵母屬（Candida)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia)角 質(zhì)酶；或一種絲狀真菌角質(zhì)酶，如枝頂孢霉屬（Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格孢 屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、Botryospaeria、 擬錯(cuò)菌屬（〇61'1。〇1'；[(^818)、毛_殼屬（Chaetomidium)、金抱子菌屬（Chrysosporium)、 麥角菌屬（Claviceps)、旋孢腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘屬（Coprinopsis)、乳白蟻 屬（Coptotermes)、棒囊殼屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬（Cryphonectria)、隱球菌屬 (Cryptococcus)、色二孢屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、 鐮刀菌屬（Fusarium)、赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲屬（Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉 屬（Humicola)、耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、小腔球菌屬（Leptospaeria)、 梨抱菌屬（Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀 絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、 擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、 瘤胃壺菌屬（Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲屬 (Pseudotrichonympha)、根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、柱頂 孢屬（Scytalidium)、踝節(jié)菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢 殼霉屬（Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌 屬（1'1'；[(311(^1^63)、輪枝孢屬（￥61^；[(3；[11；[11111)、小包腳燕屬（￥01￥31^6113)或炭角菌屬 (Xylaria)角質(zhì)酶。
[0102]在另一方面，該親本是卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏 酵母（Saccharomyces douglasii)、克魯弗酵母（Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母 (Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母（Saccharomyces oviformis)角質(zhì)酶。
[0103]在另一方面，該親本是解纖維枝頂孢霉（Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、構(gòu) 巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、盧克諾文思金孢子菌（Chrysosporium lucknowense)、莫達(dá)瑞姆金孢 子菌（Chrysosporium merdarium)、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士蘭金 抱子菌（Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、 帶紋金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、桿抱狀嫌抱（Fusarium bactridioides)、 谷類嫌抱（Fusarium cerealis)、庫(kù)威嫌抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌 抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱(Fusarium graminearum)、禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、異抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、合歡木嫌抱（Fusarium negundi)、尖 嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、粉紅嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、膚色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、擬 分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色嫌抱（Fusarium sulphureum)、圓嫌抱 (Fusarium torulosum)、擬絲抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉（Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)、疏棉狀腐 質(zhì)霉（Humicola lanuginosa)、白奉巴齒菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、 嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖鏈抱菌（Neurospora crassa)、繩狀青 霉菌（Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉菌（Penicillium purpurogenum)、黃抱原 毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、無(wú)色梭抱殼霉（Thielavia achromatica)、 阿波梭抱殼菌（Thielavia albomyces)、白毛梭抱殼霉（Thielavia albopilosa)、澳洲 梭孢殼霉（Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢殼菌（Thielavia fimeti)、小孢梭孢 殼霉（Thielavia microspora)、卵抱梭抱殼霉（Thielavia ovispora)、秘魯梭抱殼霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱殼霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼霉（Thielavia spededonium)、耐熱梭抱殼（Thielavia subthermophila)、土生梭抱殼霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii)、長(zhǎng) 枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或綠色木霉 (Trichoderma viride)角質(zhì)酶。
[0104] 在另一方面，該親本是一種特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶，例如SEQ ID NO: 2的角質(zhì)酶或其成 熟多肽。
[0105] 將理解的是，對(duì)于以上提到的物種而言，本發(fā)明涵蓋完全狀態(tài)和不完全狀態(tài) (perfect and imperfect states)二者、以及其他分類學(xué)等效物，例如無(wú)性型，而不管它們 已知的物種名稱是什么。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地識(shí)別適當(dāng)?shù)刃锏纳矸荨?br> [0106] 這些物種的株系可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)、德國(guó)微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北方地區(qū)研究中心 (NRRL)。
[0107] 可以使用以上提到的探針從其他來(lái)源，包括從自然界（例如，土壤、堆肥、水等等） 分離的微生物或直接從自然材料（例如，土壤、堆肥、水等等）獲得的DNA樣品鑒定和獲得 該親本。用于從自然生活環(huán)境中直接分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可 通過(guò)在另一種微生物或混合DNA樣本的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中類似地進(jìn)行篩選來(lái)獲得 編碼親本的多核苷酸。一旦用一種或多種探針檢測(cè)到編碼親本的多核苷酸，就可以通過(guò)使 用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸（參見，例如，薩姆布魯克等人， 1989,見上文）。
[0108] 變體的制備
[0109] 本發(fā)明還涉及用于獲得一種具有角質(zhì)酶活性的多肽的方法，該方法包括：(a)向 親本角質(zhì)酶中與SEQ ID N0:2的成熟多肽的位置P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S，T，W ,Y, V ；I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；G45A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；N52E ；F70A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S, T, ff, Y, V ；G120S ；G143A, R, N, D, C, Q，E，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V ;L167A ;以及L174N，Q相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)） 位置處引入取代，其中該變體具有角質(zhì)酶活性；并且（b)回收該變體。
[0110] 可以使用本領(lǐng)域已知的任何誘變程序來(lái)制備這些變體，例如定點(diǎn)誘變、合成基因 構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機(jī)誘變、改組等。
[0111] 定點(diǎn)誘變是在編碼該親本的多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)限定位點(diǎn)處引入一個(gè)或多 個(gè)（例如，若干個(gè)）突變的技術(shù)。
[0112] 通過(guò)使用涉及含有所希望的突變的寡核苷酸引物的PCR可以體外實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變。 也可以通過(guò)盒式誘變進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，所述盒式誘變涉及由限制性酶在包含編碼親本的 多核苷酸的質(zhì)粒中的位點(diǎn)處切割并且隨后將含有突變的寡核苷酸連接在多核苷酸中。通 常，消化該質(zhì)粒與該寡核苷酸的限制性內(nèi)切酶是相同的，以允許該質(zhì)粒的粘性末端以及插 入片段彼此連接。參見，例如，謝勒（Scherer)和戴維斯（Davis)，1979,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院 院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 76:4949-4955;以及巴頓（Barton)等人，1990,核酸研究 18:7349-4966。
[0113] 還可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變。參見，例如，US2004/0171154 ; 斯道瑞希（Storici)等人，2001，自然生物技術(shù)（Nature Biotechnol.) 19:773-776;卡倫 (Kren)等人，1998,自然醫(yī)學(xué)（Nat. Med. )4:285-290 ;以及凱利薩諾（Calissano)和馬奇諾 (Macino)，1996,真菌遺傳學(xué)簡(jiǎn)訊（Fungal Genet. Newslett.) 43:15-16。
[0114] 在本發(fā)明中可以使用任何定點(diǎn)誘變程序。存在可用于制備變體的很多可商購(gòu)的試 劑盒。
[0115] 合成基因構(gòu)建需要體外合成一種設(shè)計(jì)的多核苷酸分子以編碼一種所感興趣的多 肽?；蚝铣煽梢岳枚喾N技術(shù)來(lái)進(jìn)行，如由田（Tian)等人（2004,自然432:1050-1054) 所描述的基于多路微芯片的技術(shù)、以及其中在光可編程的微流芯片上合成并組裝寡核苷酸 的類似技術(shù)。
[0116] 可以做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組 的已知方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森（Reidhaar-Olson) 和薩奧爾（Sauer)，1988,科學(xué)（Science) 241:53-57 ;博維（Bowie)和薩奧爾，1989,美國(guó)國(guó) 家科學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci.USA)86:2152-2156;W0 95/17413;或 W0 95/22625 披露的那些。其他可以使用的方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示（例如洛曼（Lowman)等人， 1991，生物化學(xué)30:10832-10837 ;US 5223409 ;TO 92/06204)以及區(qū)域定向誘變（德比什 爾（Derbyshire)等人，1986,基因 46:145;內(nèi)爾（Ner)等人，1988, DNA 7:127)。
[0117] 可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動(dòng)化篩選方法來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克 隆的、誘變的多肽的活性（內(nèi)斯等人，1999,自然生物技術(shù)17:893-896)。編碼活性多肽的誘 變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行迅速測(cè)序。這些 方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
[0118] 通過(guò)組合合成基因構(gòu)建、和/或定點(diǎn)誘變、和/或隨機(jī)誘變、和/或改組的多個(gè)方 面來(lái)實(shí)現(xiàn)半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一個(gè)過(guò)程結(jié) 合PCR技術(shù)。因此，基因的限定區(qū)域可以從頭合成，而其他區(qū)域可以使用位點(diǎn)特異性誘變引 物來(lái)擴(kuò)增，而還有其他區(qū)域可以經(jīng)受易錯(cuò)PCR或非易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。然后可以對(duì)多核苷酸子 序列進(jìn)行改組。
[0119] 多核苷酸
[0120] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的變體的分離的多核苷酸。
[0121] 核酸構(gòu)建體
[0122] 本發(fā)明還涉及包括編碼本發(fā)明的一種變體的、可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序 列上的一種多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該一個(gè)或多個(gè)控制序列在與控制序列相容的條件下指 導(dǎo)編碼序列在一種適合的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0123] 可以按多種方式來(lái)操縱該多核苷酸以提供一種變體的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在 其插入載體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷 酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0124] 控制序列可以是一個(gè)啟動(dòng)子，即由一個(gè)宿主細(xì)胞識(shí)別用于表達(dá)該多核苷酸的一種 多核苷酸。啟動(dòng)子包含介導(dǎo)該變體的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。該啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中 顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟動(dòng)子，并且可以是由編碼 與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。
[0125] 用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例 是從以下基因中獲得的啟動(dòng)子：解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿菌 a-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因（penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀 粉酶基因（amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基 因、蘇云金芽孢桿菌crylllA基因（阿蓋塞（Agaisse)和勒爾克呂（Lereclus)，1994,分子 微生物學(xué)（Molecular Microbiology) 13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟 動(dòng)子（埃貢（Egon)等人，1988,基因69:301-315)、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂水解酶基因（dagA)、 以及原核內(nèi)酰胺酶基因（維拉-卡馬洛夫（Villa-Kamaroff)等人，1978,美國(guó)國(guó)家 科學(xué)院院刊75:3727-3731)、以及tac啟動(dòng)子（德波爾（DeBoer)等人，1983,美國(guó)國(guó)家科 學(xué)院院刊80:21-25)。其他啟動(dòng)子描述在吉爾伯特（Gilbert)等人，1980,科學(xué)美國(guó)人 (Scientific American)242:74_94 的"來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)（Useful proteins from recombinant bacteria)";以及在薩姆布魯克等人，1989 (見上文）中。串聯(lián)啟動(dòng)子的實(shí)例 披露于W0 99/43835中。
[0126] 用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí) 例是從以下各項(xiàng)的基因獲得的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲 霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米 曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶（W0 96/00787)、鑲 片鐮孢淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、鑲片鐮孢Daria (W0 00/56900)、鑲片鐮孢Quinn (TO 00/56900)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏 木霉3 -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi) 切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚 糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子（一種修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自曲霉屬中性a-淀粉酶基 因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代；非限 制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自黑曲霉中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序 列由構(gòu)巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代）；以及其突變型啟 動(dòng)子、截短型啟動(dòng)子、以及雜合型啟動(dòng)子。
[0127] 在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從以下的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶（EN0-1)、釀酒 酵母半乳糖激酶（GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADHUADH2/GAP)、釀 酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶（TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白（CUP1)、以及和釀酒酵母3-磷酸甘油 酸激酶。羅馬諾斯（Romanos)等人，1992,酵母（Yeast)8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的 其他有用的啟動(dòng)子。
[0128] 控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的一種轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子序列 被可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的3'-端。可以使用在宿主細(xì)胞中具有功能的任 何終止子。
[0129] 用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶（aprH)、地衣芽 孢桿菌a-淀粉酶（amyL)、以及大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)的基因獲得。
[0130] 絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢鐮刀 菌胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0131] 用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從以下基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì) 胞色素C (CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終 止子由羅馬努斯等人，1992,見上文描述。
[0132] 控制序列還可以是啟動(dòng)子下游和基因的編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)，其增加 該基因的表達(dá)。
[0133] 適用的mRNA穩(wěn)定子區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的：蘇云金芽孢桿菌crylllA基因 (W0 94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因（化（Hue)等人，1995,細(xì)菌學(xué)雜志（Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
[0134] 該控制序列還可以是一個(gè)前導(dǎo)子，一種對(duì)宿主細(xì)胞翻譯很重要的非翻譯mRNA區(qū) 域。前導(dǎo)子序列可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的5'-端?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中 具有功能的任何前導(dǎo)子。
[0135] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷 酸異構(gòu)酶的基因獲得。
[0136] 適用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)子從以下各項(xiàng)的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶 (EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子、以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油 醛-3-磷酸脫氫酶（ADH2/GAP)。
[0137] 該控制序列還可以是一種多腺苷酸化序列，即被可操作地連接至該變體編碼序列 的3' -末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別成將多腺苷酸殘基添加到所轉(zhuǎn)錄的mRNA上的一 個(gè)信號(hào)的一種序列。在宿主細(xì)胞中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以使用。
[0138] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得：構(gòu)巢曲 霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及 尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0139]有用于酵母宿主細(xì)胞的多腺苷酸化序列在郭（Guo)和謝爾曼（Sherman)，1995,分 子細(xì)胞生物學(xué)（Mol. Cellular Biol.) 15:5983-5990中有過(guò)描述。
[0140] 該控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，編碼與變體的N-端連接的信號(hào)肽，并且引導(dǎo) 該變體進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路。多核苷酸的編碼序列的5' -末端可以固有地包含信號(hào)肽編 碼序列，該信號(hào)肽編碼序列在翻譯閱讀框中與編碼該變體的編碼序列的區(qū)段天然地連接在 一起?？商娲兀幋a序列的5' -末端可以包含對(duì)該編碼序列是外源的信號(hào)肽編碼序列。 在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號(hào)肽編碼序列。可替 代地，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地置換天然信號(hào)肽編碼序列，以便增加變體的分泌。然 而，可以使用指導(dǎo)表達(dá)的變體進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。
[0141] 用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得的信號(hào)肽編 碼序列：芽孢桿菌屬NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽 孢桿菌0 -內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a -淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT、 nprS、nprM)、以及枯草芽孢桿菌prsA。西蒙納（Simonen)和帕爾瓦（Palva)，1993,微生物 學(xué)評(píng)論（Microbiological Reviews) 57:109-137 描述了另外的信號(hào)膚。
[0142] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是獲得自以下項(xiàng)的基因的信 號(hào)肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì) 霉（Humicola insolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉（Humicola lanuginosa)脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0143] 對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽獲得自以下項(xiàng)的基因：釀酒酵母a-因子和釀酒 酵母轉(zhuǎn)化酶。上文的羅馬諾斯等人（1992)描述了其他有用的信號(hào)肽編碼序列。
[0144] 該控制序列還可以是編碼位于變體的N-末端處的前肽的一個(gè)前肽編碼序 列。生成的多肽被稱為前體酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情況下被稱為酶原 (zymogen))。多肽原通常是無(wú)活性的并且可以通過(guò)從該多肽原上催化切割或自動(dòng)催化切割 前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌 堿性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶（W0 95/33836)、曼 赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母a因子。
[0145] 在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰該變體的 N-末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的N-末端。
[0146] 還令人希望的可以是添加相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)該變體的表達(dá)的調(diào)節(jié)序 列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的那些，包括 調(diào)控化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。在酵母 中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、 米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子、以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是允 許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉 酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該變體的多核苷 酸將與該調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
[0147] 表達(dá)載體
[0148] 本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止 信號(hào)的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生一個(gè)重組表達(dá)載 體，這一重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入 或取代編碼該變體的多核苷酸?？商娲兀摱嗪塑账峥梢酝ㄟ^(guò)將該多核苷酸或包括該多 核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生表達(dá)載體時(shí)，編碼序列是 位于該載體中，以使得該編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0149] 重組表達(dá)載體可以是任何載體（例如，質(zhì)?；虿《荆淠軌蚍奖愕剡M(jìn)行重組DNA 程序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載 體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0150] 載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色 體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自 我復(fù)制的任何裝置。可替代地，該載體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)， 被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用 單一載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒（這些載體或質(zhì)粒共同包含有待引入到宿主 細(xì)胞的基因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。
[0151] 該載體優(yōu)選包含允許容易選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或類似細(xì)胞的一個(gè) 或多個(gè)選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗 性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型、等。
[0152] 細(xì)菌性選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗 生素抗性（例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性）的標(biāo) 記。用于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、 以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包含但不限于amdS(乙酰胺 酶）、argB (鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶）、bar (草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移 酶）、niaD (硝酸還原酶）、pyrG (乳清苷-5' -磷酸脫羧酶）、sC (硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶）、以 及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶）、連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米 曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
[0153] 載體優(yōu)選含有允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因 組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。
[0154] 對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該變體的多核苷酸序列或 者用于通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲兀?載體可以包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中 的一個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置處整合的可能性，這些 整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10, 〇〇〇個(gè)堿基對(duì)、400至10, 000個(gè)堿基對(duì)、 以及800至10, 000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同 源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。 此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過(guò)非 同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0155] 對(duì)于自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù) 制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ) "復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"意指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0156] 細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及pAMM的復(fù)制起點(diǎn)。
[0157] 用于在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)ARS1、ARS4、 ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。
[0158] 有用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANS1(格姆斯（Gems)等 人，1991，基因（Gene)98:61_67;卡倫（Cullen)等人，1987，核酸研究（Nucleic Acids Res.) 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。根據(jù)W000/24883中披露的方法可以實(shí)現(xiàn)AMA1基因的 分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建。
[0159] 可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到一個(gè)宿主細(xì)胞中以增加變體 的產(chǎn)生。通過(guò)將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包含一個(gè)與 該多核苷酸的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得增加的多核苷酸拷貝數(shù)目，其中通過(guò)在適 當(dāng)選擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以 及由此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0160] 用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員熟知的（參見，例如，薩姆布魯克等人，1989,同上文）。
[0161] 宿主細(xì)胞
[0162] 本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包含編碼本發(fā)明的變體的、可操 作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列的一種多核苷酸，該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的變 體的產(chǎn)生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體 被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì) 胞"涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選 擇在很大程度上將取決于編碼該變體的基因及其來(lái)源。
[0163] 宿主細(xì)胞可以是在重組產(chǎn)生一個(gè)變體中有用的任何細(xì)胞，例如一個(gè)原核細(xì)胞或一 個(gè)真核細(xì)胞。
[0164] 原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但 不限于：芽孢桿菌、梭菌、腸球菌、土芽孢桿菌、乳桿菌、乳球菌、海洋芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈 球菌、以及鏈霉菌。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于：彎曲桿菌、大腸桿、黃桿菌、梭桿菌、螺桿 菌、泥桿菌、奈瑟氏菌、假單胞菌、沙門菌、以及脲原體屬。
[0165] 細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉 芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦 爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿 菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
[0166] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌細(xì)胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球 菌、乳房鏈球菌、以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。
[0167] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌細(xì)胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉 菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。
[0168] 可以通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見，例如常（Chang)和科恩（Cohen)，1979,分子 遺傳學(xué)和基因組（Mol. Gen. Genet.) 168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（參見，例如，楊 (Young)和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志（J.Bacteriol.)81:823-829、或 者杜布（Dubnau)和大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森（Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志 56:2〇9_221)、電穿孔（參見，例如，茂川（Shigekawa)和道爾（Dower)，I 988,生物技術(shù) (Biotechniques) 6:742-751)、或共軛（參見，例如，凱勒（Koehler)和索恩（Thorne)，1987， 細(xì)菌學(xué)雜志169:5271-5278)實(shí)現(xiàn)DNA到芽孢桿菌細(xì)胞中的引入?？梢酝ㄟ^(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 (參見，例如，哈那汗（Hanahan)，1983,分子生物學(xué)雜志166:557-580)或者電穿孔（參見， 例如，道爾（Dower)等人，1988,核酸研究16:6127-6145)實(shí)現(xiàn)DNA到大腸桿菌細(xì)胞中的引 入?？梢酝ㄟ^(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔（參見，例如，貢（Gong)等人，2004,葉線形微生物學(xué) (Folia Microbiol. (Praha))49:399-405)、共輒（例如，馬佐迪耶（Mazodier)等人，1989， 細(xì)菌學(xué)雜志171:3583-3585)、或者轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見，例如，伯克（Burke)等人，2001，美國(guó)國(guó)家 科學(xué)院院刊98:6289-6294)實(shí)現(xiàn)DNA到鏈霉菌細(xì)胞中的引入?？梢酝ㄟ^(guò)電穿孔（參見，例 如，蔡（Choi)等人，2006,微生物學(xué)方法雜志（J. Microbiol. Methods) 64:391-397)、或者 共軛（例如，皮內(nèi)多（Pinedo)和斯梅茨（Smets)，2005,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)71:51-57) 實(shí)現(xiàn)DNA到假單孢菌細(xì)胞中的引入。可以通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)將DNA引入鏈球菌細(xì)胞 中：天然感受態(tài)（例如，佩里（Perry)和藏滿（Kuramitsu)，1981，傳染與免疫（Infect. Immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（例如，卡特（Catt)和約里克（Jollick)，1991，微生 物（Microbios)68:189-207)、電穿孔（參見，例如，布克萊（Buckley)等人，1999,應(yīng)用與環(huán) 境微生物學(xué)65:3800-3804)、或接合（參見，例如，克萊懷爾（Clewell)，1981，微生物學(xué)綜述 (Microbiol. Rev. )45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細(xì)胞中 的任何方法。
[0169] 宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。
[0170]宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌門（Ascomycota)、 擔(dān)子菌門（Basidiomycota)、壺菌門（Chytridiomycota)、以及接合菌門（Zygomycota)、連 同卵菌門（Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌（如由霍克斯沃思（Hawksworth)等人在安 斯沃思和拜斯比真菌詞典（Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi)，第 8 版， 1995,國(guó)際應(yīng)用生物科學(xué)中心（CAB International),大學(xué)出版社（University Press),英 國(guó)劍橋（Cambridge, UK)中進(jìn)行定義的）。
[0171] 該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此使用，"酵母"包括產(chǎn)子囊酵母（內(nèi)孢霉 目）、產(chǎn)擔(dān)子酵母以及屬于半知菌類（芽生菌）的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，因 此出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如酵母的生物學(xué)和活性（Biology and Activities of Yeast) (斯金納（Skinner)、帕斯莫爾（Passmore)、以及達(dá)文波特（Davenport)編輯，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué) 會(huì)討論會(huì)系列號(hào) 9 (Soc.App.Bacteriol. Symposium Series No. 9)，1980)中所描述來(lái)定義。
[0172] 酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬（Hansenula)、克魯維酵母屬、畢 赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、 或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)細(xì)胞。
[0173] 真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門（Eumycota)和卵菌 門的亞門（如由霍克斯沃思等人，1995,見上文所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌通常 的特征在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體 壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母（如釀酒酵母）的 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽（budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。
[0174] 絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬 (Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬（Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌 科（Filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌 屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬（Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬（Pleurotus)、 裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬（Trametes)、或木霉屬細(xì) 胞。
[0175] 例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲 霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌（Bjerkandera adusta)、干擬賭菌（Ceriporiopsis aneirina)、卡內(nèi)基擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬錯(cuò)孑L菌（Ceriporiopsis gilvescens)、潘諾希塔擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsis rivulosa)、微紅擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、拉克悼金孢 子菌（Chrysosporium lucknowense)、奠狀金抱子菌（Chrysosporium merdarium)、租金 孢子菌、女王杜香金孢子菌（Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢 子菌（Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘（Coprinus cinereus)、毛革蓋菌（Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、 合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮 孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、 粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、射脈菌（Phlebia radiata)、刺拜:側(cè)耳（Pleurotus eryngii)、土生梭抱霉、長(zhǎng)域毛栓菌（Trametes villosa)、 變色栓菌（Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉 細(xì)胞。
[0176] 可以將真菌細(xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生的方 法以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序在EP 238023 和約爾頓（Yelton)等人，1984,美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森 (Christensen)等人，1988,生物 / 技術(shù)（Bio/Technology)6:1419_1422 中描述。用于轉(zhuǎn)化 鐮孢屬物種的適合方法由馬拉迪爾（Malardier)等人，1989,基因（Gene) 78:147-156、以及 W0 96/00787描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I(xiàn)描述的程序轉(zhuǎn)化酵母：貝克爾（Becker)和瓜倫 特（Guarente)，在阿貝爾森（Abelson), J.N.和西蒙（Simon), M. I?編，酵母遺傳學(xué)與分子 生物學(xué)指南，酶學(xué)方法（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology)，第 194卷，第 182-187 頁(yè)，學(xué)術(shù)出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，紐 約；伊藤（Ito)等人，1983,細(xì)菌學(xué)雜志153:163 ;以及伊嫩（Hinnen)等人，1978,美國(guó)科學(xué) 院院刊75:1920。
[0177] 產(chǎn)生方法
[0178] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生一種變體的方法，這些方法包括：(a)在適合于該變體的表達(dá) 的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的一種宿主細(xì)胞；并且（b)回收該變體。
[0179] 使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生該變體的一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些宿主 細(xì)胞。例如，可以通過(guò)搖瓶培養(yǎng)，或者在一種適合的培養(yǎng)基中并在允許該變體表達(dá)和/或 分離的條件下在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā) 酵、分批給料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵）來(lái)培養(yǎng)該細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種 適合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳和氮來(lái)源及無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng) 商獲得或可以根據(jù)公開的組成（例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）制備。如果 該變體被分泌到該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，則該變體可直接從該培養(yǎng)基中回收。如果該變體沒(méi)有分 泌，則它可從細(xì)胞裂解液中回收。
[0180] 可以使用本領(lǐng)域已知的對(duì)角質(zhì)酶特異的方法來(lái)檢測(cè)該變體。這些檢測(cè)方法包括但 不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一種酶測(cè)定來(lái) 確定該變體的活性。在一些實(shí)施例中，本申請(qǐng)中所述的方法可適用于此目的。
[0181] 可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收該變體。例如，可以通過(guò)多種常規(guī)程序從該營(yíng) 養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該變體，這些常規(guī)程序包括但不局限于收集、離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、 蒸發(fā)、或沉淀?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中已知的多種程序來(lái)純化變體以獲得基本上純的變體，這 些程序包括但不限于：色譜法（例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、 以及尺寸排阻色譜）、電泳程序（例如，制備型等電點(diǎn)聚焦）、差別溶解度（例如，硫酸銨沉 淀）、SDS-PAGE、或萃?。▍⒁姡?，《蛋白質(zhì)純化（Protein Purification),詹森（Janson) 和賴登（Ryden)編輯，VCH 出版社（VCH Publishers)，紐約，1989)。
[0182] 在一個(gè)替代方面，沒(méi)有回收該變體，而是將表達(dá)該變體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作 該變體的一個(gè)來(lái)源。
[0183] 組合物以及形式
[0184] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包括這些變體的組合物。該組合物可以是液體、膠 體、粉末、顆?；蚱淙我饨M合。
[0185] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及以下變體，這些變體已在一個(gè)載體上通過(guò)截留在 天然或合成基質(zhì)如溶膠-凝膠、褐藻膠和角叉菜膠中，通過(guò)交聯(lián)方法如在交聯(lián)的酶晶體 (CLEC)和交聯(lián)的酶聚集體（CLEA)中，或通過(guò)在鹽晶體如蛋白涂覆的微晶（PCMC)上沉淀而 被固定化。適合的載體可以是一種選自下組的親水載體，該組包含：由氧化鋁、二氧化硅和 硅酸鹽構(gòu)成的多孔無(wú)機(jī)粒子，如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤(rùn)土、蛭石、水滑石；以及由碳水 化合物聚合物如瓊脂糖或纖維素構(gòu)成的多孔有機(jī)粒子。
[0186] 方法和用途
[0187] 由于在聚對(duì)苯二甲酸乙二酯（PET)、尼龍6, 6,聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈等上催化 許多重要的聚合物生物轉(zhuǎn)化，角質(zhì)酶可被用于合成的聚合物修飾。因此，增加對(duì)所選擇的聚 酯底物的角質(zhì)酶活性可在各種應(yīng)用中利用，例如像：(a)對(duì)工業(yè)上重要的材料進(jìn)行表面修 飾來(lái)調(diào)整其物理化學(xué)特性，這對(duì)于增強(qiáng)生物相容性、耐化學(xué)性、疏水性、附著性和濕潤(rùn)度可 以是理想的；(b)改進(jìn)將植物生物質(zhì)中角質(zhì)轉(zhuǎn)化為化學(xué)原料的效率；以及（c)開發(fā)再循環(huán)聚 酯如聚羥基脂肪酸）或合成聚酯（如PET)的酶途徑。
[0188] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及修飾表面的方法，該方法包括：(a)將該變體添加到表 面；并且（b)檢測(cè)至少一個(gè)物理化學(xué)特性上的變化，優(yōu)選地其中該至少一個(gè)物理化學(xué)特性 是生物相容性、耐化學(xué)性、增強(qiáng)疏水性、表面的附著性和/或濕潤(rùn)度。
[0189] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種將植物生物質(zhì)中的角質(zhì)轉(zhuǎn)化為化學(xué)原料的方法，該 方法包括：(a)在有益于轉(zhuǎn)化的條件下，將該變體添加到含角質(zhì)的植物生物質(zhì)中用于轉(zhuǎn)化。
[0190] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及再循環(huán)聚酯的方法，該方法包括：(a)將該變體添加到有 待再循環(huán)的聚酯中，優(yōu)選地其中該聚酯是一種聚羥基脂肪酸）或一種合成聚酯。
[0191] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及該變體用于修飾表面的用途，從而至少一個(gè)物理化學(xué) 特性被改變，優(yōu)選地其中該至少一個(gè)物理化學(xué)特性是生物相容性、耐化學(xué)性、增強(qiáng)疏水性、 表面的附著性和/或濕潤(rùn)度中的任一個(gè)。
[0192] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及該變體用于改進(jìn)將植物生物質(zhì)中的角質(zhì)轉(zhuǎn)化為化學(xué)原 料的效率的用途。
[0193] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及該變體用于再循環(huán)聚酯的用途，優(yōu)選地其中該聚酯是 一種聚（《-羥基脂肪酸）或一種合成聚酯。
[0194] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于獲得一種角質(zhì)酶變體的方法，該方法包括：(a) 在與SEQ ID N0:2的成熟多肽的位置31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相對(duì)應(yīng)的一 個(gè)或多個(gè)位置處引入一個(gè)親本角質(zhì)酶取代，該變體選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：P31A，R ,N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, S, T, ff, Y, V ； I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；G 45A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；N52E ；F70A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, P, S ，T, W, Y, V ;G120S ;G143A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V ;L167A ;以及 L174N, Q， 其中該變體具有角質(zhì)酶活性；并且（b)回收該變體。
[0195] 植物
[0196] 本發(fā)明還涉及植物，例如轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包括本發(fā)明的多核 苷酸，以便以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生該變體。該變體可以從植物或植物部分回收?？商娲?地，可以按原樣將含有該變體的植物或植物部分用于改善食品或飼料的質(zhì)量，例如，改善營(yíng) 養(yǎng)價(jià)值、可口性、以及流變性質(zhì)，或用以破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0197] 轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的（雙子葉植物）或單子葉的（單子葉植物）。單子 葉植物的實(shí)例是草，如草甸草（藍(lán)草，早熟禾屬）；飼草，如羊茅屬（Festuca)、黑麥草屬 (Lolium);溫帶草，如翦股穎屬（Agrostis);以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高 粱、以及玉蜀黍（玉米）。
[0198]雙子葉植物的實(shí)例是煙草、豆類（如羽扇豆、馬鈴薯、糖甜菜（sugar beet)、豌豆、 豆和大豆）、以及十字花科植物（十字花科（family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以 及緊密相關(guān)的模式生物擬南芥）。
[0199] 植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、以及塊莖、以及包括這些部分 的獨(dú)立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織（parenchyme)、維管組織、分生組織。特定植物細(xì)胞 區(qū)室，如葉綠體、質(zhì)外體（apoplast)、線粒體、液泡、過(guò)氧化物酶體以及細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植 物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論是何種組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部 分，如分離以有助于本發(fā)明的利用的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚、胚乳、 糊粉和種皮。
[0200] 同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的是這類植物、植物部分以及植物細(xì)胞的子代。
[0201] 表達(dá)變體的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)構(gòu)建。簡(jiǎn)而言 之，通過(guò)如下方法構(gòu)建該植物或植物細(xì)胞：將編碼變體的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體并入到植 物宿主基因組或葉綠體基因組中，并且使所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或 植物細(xì)胞。
[0202] 表達(dá)構(gòu)建體宜為包括編碼變體的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該多核苷酸與在選擇的 植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。而且，表達(dá)構(gòu)建 體可包含用于鑒別整合了此表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記，和將此構(gòu)建體引入所討 論的植物所必需的DNA序列（后者取決于所用的引入DNA的方法）。
[0203] 例如，基于希望在何時(shí)、何處、以及如何表達(dá)該變體來(lái)確定對(duì)調(diào)控序列如啟動(dòng)子和 終止子序列和任選的信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇。例如，編碼變體的基因的表達(dá)可以是組成型 的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且可以使基因產(chǎn)物靶向特定組織 或植物部分，如種子或葉。調(diào)控序列由例如塔格（Tague)等人，1988,植物生理學(xué)（Plant Physiology)86:506 描述。
[0204] 對(duì)于組成型表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子 (弗蘭克（Franck)等人，1980,細(xì)胞（Cell)21:285-294 ;克里斯滕森等人，1992,植物 分子生物學(xué)（Plant Mol. Biol.) 18:675-689;張（Zhang)等人，1991，植物細(xì)胞（Plant Cell)3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如：來(lái)自藏庫(kù)組織（storage sink tissue)(如種子、馬鈴薯塊莖、以及果實(shí)）（愛德華茲（Edwards)和科魯茲（Coruzzi)， 1990,遺傳學(xué)年度綜述（Ann. Rev. Genet.) 24:275-303)、或代謝庫(kù)組織（metabolic sink tissue)(如分生組織）的啟動(dòng)子（伊托（Ito)等人，1994,植物分子生物學(xué)24:863-878); 種子特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自稻的谷蛋白、醇溶蛋白（prolamin)、球蛋白（globulin)、或白蛋 白啟動(dòng)子（吳（Wu)等人，1998,植物細(xì)胞生理學(xué)（Plant Cell Physiol.)39:885-889);來(lái) 自豆球蛋白B4和來(lái)自蠶豆的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子（康拉德（Conrad)等人， 1998,植物生理學(xué)雜志（J.Plant Physiol.) 152:708-711);來(lái)自種子油體蛋白的啟動(dòng)子 (陳（Chen)等人，1998,植物細(xì)胞生理學(xué)39:935-941);來(lái)自歐洲油菜（Brassica napus) 的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子、或本【技術(shù)領(lǐng)域】已知的任何其他種子特異性啟動(dòng)子，例如，如在TO 91/14772中所描述。此外，啟動(dòng)子可以是葉特異性啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番茄的rbcs啟動(dòng) 子（京冢（Kyozuka)等人，1993,植物生理學(xué)（Plant Physiol.) 102:991-1000)、小球藻病 毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子（麥卓（Mitra)和希金斯（Higgins)，1994,植物分子生物 學(xué)26:85-93)、來(lái)自稻的aldP基因啟動(dòng)子（加賀屋（Kagaya)等人，1995,分子遺傳學(xué)與基 因組學(xué)（Mol. Gen. Genet.) 248:668-674)、或傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子） (許（Xu)等人，1993,植物分子生物學(xué)22: 573-588)。同樣地，該啟動(dòng)子可以通過(guò)非生物處 理來(lái)誘導(dǎo)，如溫度、干旱、或鹽度變化，或通過(guò)外源施加的激活該啟動(dòng)子的物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)，例如 乙醇、雌激素、植物激素（如乙烯、脫落酸和赤霉酸）、以及重金屬。
[0205] 啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)變體在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng) 子元件可以是置于啟動(dòng)子與編碼變體的多核苷酸之間的內(nèi)含子。例如，許等人，1993,見上 文，披露了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。
[0206] 該選擇性標(biāo)記基因及該表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以選自本領(lǐng)域中可用的那 些。
[0207] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體結(jié)合到植物基因組中，這些常規(guī) 技術(shù)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化、以及電 穿孔（Gasser (加塞爾）等人，1990，Science (科學(xué)）244:1293 ;Potrykus (波特里庫(kù)斯）， 1990，Bio/Technology (生物 / 技術(shù)）8:535 ;Shimamoto (島本）等人，1989，Nature (自 然）338:274)。
[0208] 目前根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物（關(guān)于綜述， 請(qǐng)參見霍伊卡01〇〇71?18)和施爾伯魯特（3(*11?61'〇〇竹），1992，植物分子生物學(xué)19 :15-38) 并且用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，但對(duì)于這些植物還常常使用其他的轉(zhuǎn)化方法。用于產(chǎn)生 轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是粒子（涂覆有轉(zhuǎn)化DNA的微觀金或鎢粒子）轟擊胚愈傷組織 或發(fā)育中的胚（克里斯托（Christou)，1992,植物雜志（Plant J.) 2:275-281 ;島本，1994， 生物技術(shù)當(dāng)前述評(píng)（Curr.Opin.Biotechnol.) 5:158-162;瓦西爾（Vasil)等人，1992,生物 /技術(shù)10:667-674)。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的替代方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由奧米儒 勒（Omirulleh)等人，1993,植物分子生物學(xué)21:415-428所描述。另外的轉(zhuǎn)化方法包括US 6395966和US 7151204 (兩者都通過(guò)引用以其全文結(jié)合于此）中所描述的那些。
[0209] 在轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選出已并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并使其再 生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化程序用于通過(guò)如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性 消除選擇基因：例如，使用帶有兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或利用特異性重組酶位 點(diǎn)特異性地切除選擇基因。
[0210] 除用本發(fā)明的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化特定植物基因型外，還可以通過(guò)使具有該構(gòu)建體的 植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物進(jìn)行雜交來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過(guò)雜交將編碼 變體的構(gòu)建體引入特定植物品種中，無(wú)需總是直接地轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā) 明不僅涵蓋了從根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，而且還涵蓋了這類植物的后 代。如在此使用的，后代可以是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何代的后代。此類后代 可以包括根據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交導(dǎo)致通過(guò)供體植物系與起始系交叉授粉，將 轉(zhuǎn)基因引入植物系。此類步驟的非限制性實(shí)例描述于US 7151204中。
[0211] 植物可以通過(guò)回交轉(zhuǎn)化方法生成。例如，植物包含被稱為回交轉(zhuǎn)化的基因型、種 系、近交體、或雜交體的植物。
[0212] 可以使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景滲入到另 一個(gè)。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對(duì)于常規(guī)育種的優(yōu)勢(shì)，在于其可以用于避免由表型變異導(dǎo) 致的錯(cuò)誤。另外，遺傳標(biāo)記可以在具體雜交的個(gè)別后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對(duì)程度的數(shù) 據(jù)。例如，當(dāng)具有所希望性狀并且另外具有非農(nóng)藝學(xué)所希望的遺傳背景的植物與良種親本 雜交時(shí)，可以使用遺傳標(biāo)記來(lái)選擇不僅具有感興趣的性狀，還具有相對(duì)較大比例所希望種 質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得以最小化。
[0213] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的變體的方法，這些方法包括：(a)在有益于產(chǎn)生該變 體的條件下培養(yǎng)包括編碼該變體的多核苷酸的一種轉(zhuǎn)基因植物或一種植物細(xì)胞；并且（b) 回收該變體。
[0214] 通過(guò)以下實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0215] 實(shí)例
[0216] 實(shí)例 1 :
[0217] 固定：將這些酶在盧泰特（Lewatit)VP 0C 1600基質(zhì)上以20毫克酶/克基質(zhì)的比 率進(jìn)行固定。通過(guò)用98%乙醇隨后用水洗滌來(lái)制備該基質(zhì)。將該酶溶液添加到該洗滌的基 質(zhì)中并在4°C伴隨搖動(dòng)孵育18小時(shí)。在孵育之后，在SDS-PAGE上解析上清液以查明固定程 度。將固定前收集的酶等分試樣用作對(duì)照。將固定的酶在真空下的干燥器中干燥以去除所 有水分。將該干燥的固定的酶用于轉(zhuǎn)?；磻?yīng)。在相同條件下不添加固定的酶進(jìn)行對(duì)照反 應(yīng)。
[0218] 轉(zhuǎn)?；磻?yīng)：在微量離心管（2ml)中進(jìn)行該反應(yīng)。將固定的酶（20mg)添加到二異 丙基醚中的?；w（100mM)和酰基受體（1-丙醇，100mM)中。將十二烷（5mM)用作內(nèi)標(biāo)。 將該反應(yīng)混合物在30°C下以750rpm孵育24小時(shí)。在完成孵育之后，將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮 的微量離心管中并用二異丙基醚稀釋10倍用于GC分析。
[0219] 氣相層析：在適配有DB-5柱和火焰電離檢測(cè)器的安捷倫氣相層析儀（型號(hào)7890) 上進(jìn)行氣相層析。將樣品（lul，分流比1:10)用注射器注入，溫度維持在250°C并且該檢測(cè) 器溫度在280°C。在運(yùn)行過(guò)程中，初始柱溫度設(shè)置為50°C持續(xù)1分鐘并且以5°C /min增加 至IJ 150°C，并且以10°C /min增量從150°C增加到250°C，使用氫作為載氣。
[0220] 所有反應(yīng)是以個(gè)體基質(zhì)進(jìn)行的并且轉(zhuǎn)化百分比被計(jì)算為相對(duì)于內(nèi)標(biāo)歸一化的起 始（對(duì)照）和最終（反應(yīng)）基質(zhì)濃度的差異。
[0221] 實(shí)例 2:
[0222] 如實(shí)例1中所述的用該親本角質(zhì)酶以及這些變體進(jìn)行反應(yīng)，使用了四種不同的基 質(zhì)（?；w）：異丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯。
[0223] 表1.變體對(duì)異丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯的 活性顯示為與該親本角質(zhì)酶（WT)的活性相比的相對(duì)數(shù)目。
[0224]
【權(quán)利要求】
1. 一種親本角質(zhì)酶的分離的變體，該變體包括在與SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸 殘基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處的取代，該取代 選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成： P31A, R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, M, F, S, T, ff, Y, V ； I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ； G45A, R, N, D, C, Q, Ε, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；N52E ； F70A, R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, Μ, Ρ, S, Τ, ff, Υ, V ；G120S ； G143A, R, Ν, D, C, Q, Ε, Η, I，L, Κ, Μ, F, Ρ, S, Τ, W, Υ, V ;L167A ;以及 L174N, Q，并且該變體具 有角質(zhì)酶活性。
2. 如權(quán)利要求1所述的變體，其中相對(duì)于該親本的角質(zhì)酶活性，該變體的角質(zhì)酶活性 更高。
3. 如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的變體，其中該角質(zhì)酶活性是在短鏈烷基酯底物上測(cè) 量的，優(yōu)選地其中該底物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：異丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁 烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的變體，該變體是選自下組的一種親本角質(zhì)酶的一 種變體，該組由以下各項(xiàng)組成： a. -種與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少70%序列一致性的多肽； b. -種由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列 具有至少70 % -致性；以及 c. SEQ ID NO:2的成熟多肽的一個(gè)片段，該片段具有角質(zhì)酶活性。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的變體，其中該親本角質(zhì)酶包括SEQ ID NO:2的成熟 多肽或由其組成。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的變體，其中該親本角質(zhì)酶是SEQ ID NO:2的成熟多 肽的一個(gè)片段，其中該片段具有角質(zhì)酶活性。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的變體，該變體與該親本角質(zhì)酶的氨基酸序列具有至 少70 %，例如至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % -致性，至少96 %、至少 97%、至少98%、或至少99%但小于100%的序列一致性。
8. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的變體，該變體與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少 70%，例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的變體，其中該變體由100至194個(gè)、150至194個(gè)、 100至150個(gè)、或150至194個(gè)氨基酸組成。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的變體，其中取代的數(shù)目是1-20個(gè)，例如1-10個(gè)和 1-5個(gè)，如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、 15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、或20個(gè)取代。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括在與SEQ ID N0:2的成熟多肽 的氨基酸殘基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174中的任一個(gè)相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)、三個(gè)、四 個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)或九個(gè)位置處的取代，該取代選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成： P31A, R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, M, F, S, T, ff, Y, V ； I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ； G45A, R, N, D, C, Q, E, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；N52E ； F70A, R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, Μ, P, S, T, ff, Y, V ；G120S ； G143A, R, N, D, C, Q, E, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V ;L167A ;以及 L174N, Q。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括選自以下的突變/突變的組合 中的至少一個(gè)或由其組成： a. E30Q ； b. P31V ； c. I36N ； d. I36Q ； e. I36S ； f. G45N ； g. R51P ； h. N52E ； i. F70A ； j. F70S ； k. G120S ； l. G143R ； m. L167A ； n. L174N ； o. L174Q ； p. A14P/I169A ； q. A14P+N52E+I169A ;或 r. G8D+A14P+R51P+E179Q。
13. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的變體，該變體進(jìn)一步包括在與SEQ ID NO:2的成 熟多肽的位置：G8D、A14P、E30Q、E47R、E47K、R51P、I169A、il69V、或E179Q相對(duì)應(yīng)的一個(gè)位 置處的至少一個(gè)取代。
14. 如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的變體，該變體相對(duì)于該親本具有改進(jìn)的特性，其 中該改進(jìn)的特性選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：催化效率、催化速率、比活性、底物結(jié)合、 底物裂解、底物特異性。
15. -種對(duì)如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的變體進(jìn)行編碼的分離的多核苷酸。
16. -種包括如權(quán)利要求15所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
17. -種包括如權(quán)利要求15所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
18. -種包括如權(quán)利要求15所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
19. 一種產(chǎn)生角質(zhì)酶變體的方法，該方法包括：(a)在適合于該變體的表達(dá)的條件下培 養(yǎng)如權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞；并且（b)回收該變體。
20. 用如權(quán)利要求15所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化的一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
21. -種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的變體的方法，該方法包括：(a)在有益于 產(chǎn)生該變體的條件下培養(yǎng)包括編碼該變體的多核苷酸的一種轉(zhuǎn)基因植物或一種植物細(xì)胞； 并且（b)回收該變體。
22. -種用于獲得角質(zhì)酶變體的方法，該方法包括：（a)在與SEQ ID NO:2的成熟多肽 的位置31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位置處引入一個(gè)親本 角質(zhì)酶取代，該取代選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：P31A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，S ,T, ff, Y, V ； I36A, R, N, D, C, Q, E, G, H, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ； G45A, R, N, D, C, Q, Ε, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V ；N52E ； F70A, R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, Μ, Ρ, S, Τ, ff, Υ, V ；G120S ； G143A, R, Ν, D, C, Q, Ε, Η, I，L, Κ, Μ, F, Ρ, S, Τ, W, Υ, V ;L167A ;以及 L174N, Q，其中該變體具 有角質(zhì)酶活性；并且（b)回收該變體。
23. -種修飾表面的方法，該方法包括：(a)將如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的變體添 加到一個(gè)表面；并且（b)檢測(cè)至少一個(gè)物理化學(xué)特性上的變化，優(yōu)選地其中該至少一個(gè)物 理化學(xué)特性是生物相容性、耐化學(xué)性、增強(qiáng)疏水性、表面的附著性和/或濕潤(rùn)度。
24. -種將植物生物質(zhì)中的角質(zhì)轉(zhuǎn)化為化學(xué)原料的方法，該方法包括：(a)在有益于轉(zhuǎn) 化的條件下，將如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的變體添加到含角質(zhì)的植物生物質(zhì)中。
25. -種再循環(huán)聚酯的方法，該方法包括：(a)將如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的變體 添加到有待再循環(huán)的聚酯中，優(yōu)選地其中該聚酯是一種聚（ω-羥基脂肪酸）或一種合成聚 酯。
【文檔編號(hào)】C12N9/18GK104271737SQ201380023398
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月14日
【發(fā)明者】A.巴蘇, S.奈克, S.梅帕達(dá)姆瓦蘇, P.普里蒂什, R.賽基亞, A.斯文德森 申請(qǐng)人:諾維信公司