用于調(diào)控表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列及使用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了編碼甘露醇脫氫酶的CBSU花藥消減文庫(kù)(CAS1)基因的植物啟動(dòng)子及其功能片段，以及其在植物中以誘導(dǎo)性方式促進(jìn)一種或多種異源核酸片段表達(dá)中的用途。這些啟動(dòng)子片段還可用于創(chuàng)建重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至此類(lèi)啟動(dòng)子片段的編碼所需基因產(chǎn)物的核酸序列，所述重組DNA構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物，并在外部化學(xué)品和/或熱控制下實(shí)現(xiàn)在單子葉植物和雙子葉植物中的基因產(chǎn)物表達(dá)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于調(diào)控表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列及使用方法
[0001] 本專(zhuān)利申請(qǐng)要求于2012年5月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/648758的利益，所 述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及植物啟動(dòng)子及其片段，以及其以誘導(dǎo)性方式改變植物中的至少一種異 源核酸序列表達(dá)的用途。這些啟動(dòng)子片段還可用于創(chuàng)建重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu) 建體包含可操作地連接至此類(lèi)啟動(dòng)子片段的編碼所需基因產(chǎn)物的核酸序列，所述重組DNA 構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物，并在外部化學(xué)品和/或脅迫控制下實(shí)現(xiàn)在單子葉植物和雙子葉植 物中的基因產(chǎn)物表達(dá)。

【背景技術(shù)】
[0003] 植物基因工程中的近期進(jìn)展已打開(kāi)了改造植物以具有改善的特征或性狀的新大 門(mén)，所述改善的特征或性狀例如植物疾病抗性、昆蟲(chóng)抗性、除草劑抗性、產(chǎn)量改善、植物可食 用部分的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的改善、以及得自植物的最終消費(fèi)品的穩(wěn)定性或儲(chǔ)存壽命增強(qiáng)。因此，具 有賦予不同或改善的特征或性質(zhì)的分子功能的所需一種或多種基因，可適當(dāng)摻入植物的基 因組內(nèi)。新整合的一種或多種基因編碼序列隨后可在植物細(xì)胞中表達(dá)，以顯示出所需新性 狀或特征。重要的是適當(dāng)?shù)恼{(diào)控信號(hào)必須以適當(dāng)構(gòu)型存在，以便獲得新插入的基因編碼序 列在植物細(xì)胞中的表達(dá)。這些調(diào)控信號(hào)通常包括啟動(dòng)子區(qū)、5'非翻譯前導(dǎo)序列和3'翻譯 終止/多聚腺苷酸化序列。
[0004] 啟動(dòng)子是非編碼基因組DNA序列，通常在相關(guān)編碼序列上游（5'），RNA聚合酶在 起始轉(zhuǎn)錄前與所述啟動(dòng)子結(jié)合。該結(jié)合對(duì)齊RNA聚合酶，使得轉(zhuǎn)錄在特定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處 起始。啟動(dòng)子的核苷酸序列決定與之附著的酶和其他相關(guān)蛋白質(zhì)因子的性質(zhì)以及RNA合成 速率。將RNA加工以產(chǎn)生信使RNA (mRNA)，所述信使RNA充當(dāng)RNA序列翻譯成所編碼多肽的 氨基酸序列的模板。5'非翻譯前導(dǎo)序列是編碼區(qū)的mRNA上游區(qū)域，它可以在mRNA起始和 翻譯中起作用。3'轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸化信號(hào)是位于編碼區(qū)下游的非翻譯區(qū)，其在植物 細(xì)胞中起作用，以導(dǎo)致RNA合成的終止和多聚腺苷酸核苷酸對(duì)Y端的添加。
[0005] 已顯示某些啟動(dòng)子能夠以比其他啟動(dòng)子更高的速率指導(dǎo)RNA合成。這些被稱(chēng)為 "強(qiáng)啟動(dòng)子"。某些其他啟動(dòng)子已顯示僅在特定類(lèi)型的細(xì)胞或組織中以更高水平指導(dǎo)RNA合 成，并且如果啟動(dòng)子在某些組織中優(yōu)選指導(dǎo)RNA合成，但在其他組織在也以減少水平指導(dǎo) RNA合成，則通常被稱(chēng)為"組織特異性啟動(dòng)子"或"組織優(yōu)選的啟動(dòng)子"。某些啟動(dòng)子能夠跨 越所有植物組織以相對(duì)相似的水平指導(dǎo)RNA合成。這些被稱(chēng)為"組成型啟動(dòng)子"或"組織不 依賴(lài)性"啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子可根據(jù)其指導(dǎo)RNA合成的有效性而分成強(qiáng)、中等和弱的。在 一些情況下，當(dāng)啟動(dòng)子通過(guò)外部刺激例如化學(xué)品、脅迫或生物刺激進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，它們能夠指 導(dǎo)RNA合成。這些被稱(chēng)為"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"。
[0006] 外部控制所選基因和由此其基因產(chǎn)物在植物細(xì)胞和/或田間生長(zhǎng)植物中表達(dá)的 能力可提供重要的農(nóng)業(yè)和糧食益處。該控制對(duì)于基因調(diào)控是期望的，所述基因可置于轉(zhuǎn)基 因植物內(nèi)并具有許多應(yīng)用，包括但不限于（1)延長(zhǎng)或延伸期望的營(yíng)養(yǎng)食物儲(chǔ)量在種子、根 中的累積，（2)在發(fā)育周期的限定時(shí)間在植物組織中產(chǎn)生并累積產(chǎn)物，使得這些產(chǎn)物對(duì)于收 獲和/或分離是方便的，和（3)在病原體攻擊部位處起始害蟲(chóng)特異性毒素的表達(dá)。在新型 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的分離中存在持續(xù)關(guān)注，當(dāng)暴露于外部刺激時(shí)，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠控制 一種或多種嵌合基因在植物細(xì)胞中以某些水平的表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及編碼甘露醇脫氫酶的￡BSU花藥消減文庫(kù)（￡BSU-Anther_Subtracti 〇n library) (CASl)基因的植物啟動(dòng)子及其功能片段，以及其在植物中以誘導(dǎo)性方式促進(jìn)一種 或多種異源核酸片段表達(dá)中的用途。這些啟動(dòng)子片段還可用于創(chuàng)建重組DNA構(gòu)建體，所述 重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至此類(lèi)啟動(dòng)子片段的編碼所需基因產(chǎn)物的核酸序列，所 述重組DNA構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物，并在外部化學(xué)品和/或熱控制下實(shí)現(xiàn)在單子葉植物和 雙子葉植物中的基因產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及包含誘導(dǎo)型ZmCASl啟動(dòng)子的分 離的核酸片段，其中所述啟動(dòng)子基本上由SEQ ID NO :9或10中所示的核苷酸序列組成，或 所述啟動(dòng)子基本上由基本上類(lèi)似于并在功能上等價(jià)于SEQ ID NO :9或10中所示的核苷酸 序列的片段組成。ZmCASl啟動(dòng)子可通過(guò)化學(xué)品或脅迫處理進(jìn)行誘導(dǎo)?；瘜W(xué)品可以是安全劑 例如但不限于N-(氨基羰基）-2-氯苯磺酰胺（2-CBSU)。脅迫處理可以是處理，例如但不限 于溫度超過(guò)26 °C的熱休克處理。
[0008] 本發(fā)明還涉及重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含與本發(fā)明的啟動(dòng)子可操 作地連接的至少一種異源核酸片段。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含本公開(kāi)的重組表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞、植物或種 子。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用重組表達(dá)構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，所述重組表 達(dá)構(gòu)建體包含植物啟動(dòng)子和可操作地連接至所述啟動(dòng)子的異源核酸片段，其中所述啟動(dòng)子 是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子且能夠控制所述異源核酸片段在植物細(xì)胞中的表達(dá)，并且進(jìn)一步地，其中 所述啟動(dòng)子包含SEQ ID NO :9或10的片段。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼序列或功能RNA的方法， 所述方法包括：a)將本公開(kāi)的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)，其中至少一種異源序列包 含編碼序列或功能RNA，b)使步驟a)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)；c)通過(guò)對(duì)b)的植物細(xì)胞的化學(xué)品 或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及，d)選擇展示重組DNA構(gòu)建體的編碼序列或功能 RNA表達(dá)的植物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在花藥、愈傷組織、葉或根細(xì)胞中表達(dá) 通過(guò)本發(fā)明的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼序列或功能RNA的方法。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】 [0012] 和序列表
[0013] 根據(jù)形成本申請(qǐng)的一部分的下列詳細(xì)描述以及附圖和序列表，可更全面地理解本 發(fā)明。
[0014] 圖1 :由ZmCASIcDNA (SEQ ID NO : 5)編碼的氨基酸序列與玉米甘露醇脫氫酶（GI : 226528549 ;SEQ ID NO :6)的比對(duì)（A)和百分比同一性（B)。
[0015] 圖2 :野生型能繁殖的（F)和不育（S)玉米對(duì)照植物（_)以及玉米CBSU處理的植 物（+)的玉米花藥RNA的RNA印跡。玉米花藥RNA用對(duì)于ZmCASl、IN2-2、5126、MS45、ACTIN 和UBI基因表達(dá)特異性的探針進(jìn)行分析。
[0016] 圖3 :來(lái)自野生型玉米組織和CBSU處理⑴的組織的玉米愈傷組織（C)、葉（L)和 花藥（A)RNA的RNA印跡。玉米R(shí)NA用對(duì)于IN2-2和ZmCASl特異性的探針進(jìn)行分析。
[0017] 圖4顯示了 A)對(duì)于三個(gè)不同事件（1、2、3)，用包含I. 7kb ZmCASl啟動(dòng)子的 PHP16975轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織，C =對(duì)照維持培養(yǎng)基；10 = 10mg/l CBSU，100 = 100mg/l CBSU ;B)用包含截短的I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子的PHP16974轉(zhuǎn)化，并用CBSU或熱（37°C )誘 導(dǎo)的玉米愈傷組織；26C =在26°C下的對(duì)照愈傷組織；26C+CBSU =在26°C下的CBSU處理的 愈傷組織；37C=通過(guò)37°C的熱處理誘導(dǎo)的愈傷組織。顯示了來(lái)自七個(gè)事件（1-7)的結(jié)果。
[0018] 圖5顯示了來(lái)自用PHP16975轉(zhuǎn)化并用CBSU誘導(dǎo)的三個(gè)（1、2、3)玉米植物的玉米 葉穿孔。在澆水前（C)和澆水后（S)收集來(lái)自由3個(gè)雙丙氨磷（bialaphos)抗性事件再生 的植物的葉穿孔。
[0019] 圖6顯示了來(lái)自用PHP16972轉(zhuǎn)化并用（+)或不用（-)CBSU處理的五個(gè)（1、2、3、4 和5)事件的玉米愈傷組織RNA的RNA印跡。
[0020] 圖7顯示了使用針對(duì)玉米MS45蛋白質(zhì)的抗體，來(lái)自用PHP16973轉(zhuǎn)化的ms45/ms45 玉米植物的葉的蛋白質(zhì)分析。C =來(lái)自未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照植物的葉，+=來(lái)自CBSU誘導(dǎo)的植 物的葉。來(lái)自野生型MS45植物的全細(xì)胞花藥提取物顯示于泳道1中，并且用于鑒定如通過(guò) 箭頭指不的免疫反應(yīng)性MS45蛋白質(zhì)的移動(dòng)性。
[0021] 圖8顯示了使用針對(duì)玉米MS45蛋白質(zhì)的抗體，來(lái)自用PHP16973轉(zhuǎn)化的ms45/ms45 玉米植物的花藥的蛋白質(zhì)分析。C =來(lái)自未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照植物的葉，+=來(lái)自CBSU誘導(dǎo)的 植物的葉。
[0022] 圖9 :用PHP16974轉(zhuǎn)化的稻事件顯示了當(dāng)通過(guò)I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并通過(guò) CBSU誘導(dǎo)時(shí)的⑶S表達(dá)。
[0023] 圖10 :用PHP16974轉(zhuǎn)化的稻幼苗顯示了當(dāng)通過(guò)I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并通過(guò) CBSU誘導(dǎo)時(shí)的⑶S表達(dá)。
[0024] 專(zhuān)利申請(qǐng)或?qū)＠暾?qǐng)文件含有至少一個(gè)彩色附圖。具有彩色附圖的該專(zhuān)利申請(qǐng)或 專(zhuān)利申請(qǐng)公布的復(fù)印件應(yīng)請(qǐng)求并在支付必要費(fèi)用后由專(zhuān)利局提供。
[0025] 序列描述概括了與之附著的序列表。該序列表含有用于核苷酸序列字符的 單字母代碼以及用于氨基酸的單字母和三字母代碼，如Nucleic Acids Research 13: 3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2) :345-373(1984)中描述的 IUPAC-IUB標(biāo) 準(zhǔn)中限定的。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循37C.F.R. § 1.822所示的規(guī) 定。
[0026] SEQ ID NO :1 包含 ZmCASlc-IcDNA 的 DNA 插入片段。
[0027] SEQ ID NO :2 包含 ZmCASlc-2cDNA 的 DNA 插入片段。
[0028] SEQ ID NO :3 包含玉米 ZmCASl 全長(zhǎng) cDNA 的 1354bp (堿基對(duì)）SalI-NotI DNA 插 入片段。
[0029] SEQ ID NO :41338bp 玉米 ZmCASl 全長(zhǎng) cDNA。
[0030] SEQ ID NO :5由SEQ ID NO :4編碼的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO :6 玉米甘露醇脫氫酶（GI 編號(hào) 226528549, NP_001147757. 1)的氨基酸 序列。
[0032] SEQ ID NO :7 包含玉米 B73ZmCASl 啟動(dòng)子的 4069bp DNA 片段。
[0033] SEQ ID NO :8是用于誘變以導(dǎo)入RCAI DNA限制位點(diǎn)的寡核苷酸的DNA序列。
[0034] SEQ ID NO :9 是 1049bp 截短形式的玉米 ZmCASl 啟動(dòng)子（SEQ ID NO :9 的 bp 698-1746)，也稱(chēng)為 I. Okb ZmCASl 啟動(dòng)子。
[0035] SEQ ID NO : 10 是 1746bp 玉米 ZmCASl 啟動(dòng)子，也稱(chēng)為 I. 7kb ZmCASl 啟動(dòng)子。
[0036] SEQ ID NO : 11是包含I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子的PHP16974的核苷酸序列。
[0037] SEQ ID NO :12是包含I. 7kb ZmCASl啟動(dòng)子的PHP16975的核苷酸序列。
[0038] SEQ ID NO : 13是包含I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子的PHP16972的核苷酸序列。
[0039] SEQ ID NO :14是包含I. 7kb ZmCASl啟動(dòng)子的PHP16973的核苷酸序列。
[0040] SEQ ID NO : 15 是包含 SEQ ID NO :9 的 L Okb ZmCASl 啟動(dòng)子的 HindIII-Rcal 片 段（ZMCAS1HINDIIIPR0)。
[0041] SEQ ID NO : 16 是包含 SEQ ID NO : 10 的 I. 7kb ZmCASl 啟動(dòng)子的 BamHl-Rcal 片段 (ZMCAS1BAMPR0) 〇
[0042] SEQ ID N0:17是來(lái)自稻（水稻（Oryza sativa))的甘露醇脫氫酶（AAP52597)的 氨基酸序列。
[0043] SEQ ID NO: 18是來(lái)自稻（水稻）的甘露醇脫氫酶基因區(qū)（DP000086)的核苷酸序 列。
[0044] SEQ ID NO : 19是來(lái)自稻（水稻）的甘露醇脫氫酶基因（DP000086)的假定 5' UTR-啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。
[0045] SEQ ID N0:20是來(lái)自高粱的甘露醇脫氫酶（XP-002436634)的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID N0:21是來(lái)自高粱的甘露醇脫氫酶基因區(qū)（NC-012879)的核苷酸序列。
[0047] SEQ ID N0:22是來(lái)自高粱的甘露醇脫氫酶基因（NC-012879)的假定5'UTR-啟動(dòng) 子區(qū)的核苷酸序列。

【具體實(shí)施方式】
[0048] 本文所引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物的公開(kāi)內(nèi)容均全文以引用的方式并 入。
[0049] 除非另行定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員通常理解的一樣。除非另有說(shuō)明，否則本文采用或考慮的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)例僅是舉例說(shuō)明性的而不是限制性的。
[0050] 如本文所用的并在所附的權(quán)利要求書(shū)中的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述"包 括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，提及"植物"包括多株此類(lèi)植物， 提及"細(xì)胞"包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等等。
[0051] 在本公開(kāi)的上下文中將用到許多術(shù)語(yǔ)。
[0052] 如本文所用，"ZmCASl啟動(dòng)子"指一類(lèi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。天然ZmCASl啟動(dòng)子是從 CBSU-花藥消減文庫(kù)中分離的玉米基因的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與在多種作物物種包括玉米 中鑒定的甘露醇脫氫酶基因具有顯著同源性，所述甘露醇脫氫酶基因在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù) 信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中保藏。如本文所用，"ZmCASl啟動(dòng)子"還指保留顯著啟動(dòng)子活性 的全長(zhǎng)天然啟動(dòng)子的片段。例如，ZmCASl啟動(dòng)子長(zhǎng)度可以是1.7kb(SEQ ID NO :10)或其啟 動(dòng)子功能片段，所述功能片段尤其包括SEQ ID NO :9的多核苷酸。ZmCASl啟動(dòng)子還包括這 樣的變體，所述變體基本上類(lèi)似于并在功能上等價(jià)于核苷酸序列的任何部分，以一個(gè)堿基 對(duì)的增量，在I. 〇kb(SQE ID NO :9)和I. 7kb(SEQ ID NO : 10)片段和序列之間。
[0053] 術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"指能夠調(diào)控編碼序列或功能RNA表達(dá)的核苷酸序列。功能RNA包 括但不限于轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)。啟動(dòng)子序列由近側(cè)和較遠(yuǎn)端上游元件組 成，后者經(jīng)常指增強(qiáng)子。啟動(dòng)子通常包含能夠指導(dǎo)RNA聚合酶II在對(duì)于特定編碼序列適當(dāng) 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處起始RNA合成的TATA盒。啟動(dòng)子可另外包含一般位于TATA盒上游或5' 的其他識(shí)別序列，稱(chēng)為上游啟動(dòng)子元件，其影響轉(zhuǎn)錄起始速率。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到已鑒定本文公開(kāi) 的啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，分離并鑒定來(lái)自本文鑒定的特定啟動(dòng)子區(qū)的TATA盒上游的區(qū) 域中的進(jìn)一步調(diào)控元件在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。因此，"增強(qiáng)子"是可刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列， 并且可以是啟動(dòng)子的固有元件，或插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子水平或組織特異性的異源元件。啟動(dòng) 子可整個(gè)源于天然基因，或由源于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或甚至包含合 成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可在不同的組織或細(xì)胞類(lèi)型中，或 在不同的發(fā)育階段，或響應(yīng)不同的環(huán)境條件或無(wú)生命條件而指導(dǎo)基因的表達(dá)。
[0054] 允許所需組織中的誘導(dǎo)性表達(dá)的啟動(dòng)子元件可得到鑒定，分離并與其他核心啟動(dòng) 子一起使用，以證實(shí)誘導(dǎo)性表達(dá)。核心啟動(dòng)子意指起始轉(zhuǎn)錄所需的最低限度序列，例如稱(chēng)為 TATA盒的序列，所述TATA盒是編碼蛋白質(zhì)的基因中的啟動(dòng)子共有的。因此，ZmCASl啟動(dòng)子 可任選與來(lái)自其他來(lái)源的其自身啟動(dòng)子或核心啟動(dòng)子結(jié)合使用。啟動(dòng)子對(duì)于它在其中發(fā)現(xiàn) 的細(xì)胞可以是天然的或非天然的。
[0055] 在大多數(shù)時(shí)間引起基因在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱(chēng)為"組成型啟動(dòng) 子"。目前不斷發(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞中的不同類(lèi)型的新啟動(dòng)子；在通過(guò)Okamuro和Goldberg 的匯編（Biochemistry of Plants 15:1-82(1989))中可找到大量例子。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到因?yàn)?在大多數(shù)情況下還不能完全確定調(diào)控序列的確切范圍，一些變型的DNA片段可能具有相同 的啟動(dòng)子活性。
[0056] 雖然候選基因當(dāng)通過(guò)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)可預(yù)測(cè)其效應(yīng)，但候選基因在35S 或UBI啟動(dòng)子控制下的高水平、組成型表達(dá)可具有多重效應(yīng)。使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或脅迫特 異性啟動(dòng)子可消除不需要的效應(yīng)但保留增強(qiáng)耐旱性的能力。在擬南芥屬（Arabidopsis)中 已觀(guān)察到該效應(yīng)（Kasuga 等人（1999)Nature Biotechnol. 17 :287-91) 〇
[0057] 術(shù)語(yǔ)"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"指響應(yīng)內(nèi)源或外源刺激的存在例如通過(guò)化學(xué)化合物（化學(xué) 誘導(dǎo)劑），或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)和/或發(fā)育信號(hào)，選擇性表達(dá)編碼序列或功能RNA的啟動(dòng) 子。誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子包括例如通過(guò)光、熱、脅迫、水淹或干旱、鹽脅迫、滲透脅迫、植物 激素、傷口或化學(xué)品例如乙醇、脫落酸（ABA)、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑誘導(dǎo)或調(diào)控的啟 動(dòng)子。
[0058] 脅迫誘導(dǎo)性的例子是 RD29A 啟動(dòng)子（Kasuga 等人（1999)Nature Biotechnol. 17 : 287-91)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉模擬干旱條件以及對(duì)已經(jīng)受了模擬的或天然存在的 干旱條件的植物的耐旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方案。例如，技術(shù)人員可通過(guò)向植物提供比正常需求 較少的水或在一定時(shí)期內(nèi)不提供水來(lái)模擬干旱條件，并且技術(shù)人員可通過(guò)尋找在生理和/ 或物理?xiàng)l件上的差異來(lái)評(píng)價(jià)耐旱性，包括但不限于活力、生長(zhǎng)、大小、或根長(zhǎng)、或具體地講葉 片顏色或葉片面積大小。用于評(píng)價(jià)耐旱性的其他技術(shù)包括測(cè)量葉綠素?zé)晒?、光合作用速?和換氣速率。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉用于模擬脅迫條件例如滲透脅迫、鹽脅迫和溫 度脅迫的方案，以及用于評(píng)估已實(shí)施模擬或天然存在的脅迫條件的植物的脅迫耐受性的方 案。
[0059] 本發(fā)明的序列可從任何植物中分離，包括但不限于玉米（玉蜀黍（Zea mays))、低 芥酸菜子（甘藍(lán)型油菜（Brassica napus))、大白菜（Brassica rapa ssp)·)、苜蓿（紫花 苜蓿（Medicago sativa))、稻（水稻）、黑麥（黑麥（Secale cereale))、高粱（二色高粱 (Sorghum bicolor)、高粱（Sorghum vulgare))、向日葵（向日葵（Helianthus annuus))、 小麥（小麥（Triticum aestivum))、大豆（大豆（Glycine max))、煙草（煙草（Nicotiana tabacum))、粟（泰屬（Panicum spp·))、馬鈴薯（馬鈴薯（Solanum tuberosum))、花生（落 花生（Arachis hypogaea))、棉花（陸地棉（Gossypium hirsutum))、甘薯（甘薯（Ipomoea batatus))、木薯（木薯（Manihot esculenta))、咖啡（咖啡屬（Cafea spp·))、椰子（椰子 (Cocos nucifera))、菠蘿（鳳梨（Ananas comosus))、柑橘樹(shù)（柑橘屬（Citrus spp·))、 可可（可可樹(shù)（Theobroma cacao))、茶（茶樹(shù)（Camellia sinensis))、香焦（香焦屬 (Musa spp·))、鱷梨（鱷梨（Persea americana))、無(wú)花果（無(wú)花果（Ficus casica))、番 石植（番石植（Psidium guajava))、芒果（芒果（Mangifera indica))、橄欖（橄欖（Olea europaea))、燕麥（燕麥（Avena sativa))、大麥（大麥（Hordeum vulgare))、蔬菜、觀(guān)賞植 物和球果植物。優(yōu)選地，植物包括玉米、大_&、紅花、向日葵、低芥酸菜子、小麥、大麥、黑麥、 苜蓿、稻、棉花和高粱。
[0060] 本發(fā)明涉及包含誘導(dǎo)型ZmCASl啟動(dòng)子的分離的核酸片段。本發(fā)明還涉及包含啟 動(dòng)子的分離的核酸片段，其中所述啟動(dòng)子基本上由SEQ ID NO :9中所示的核苷酸序列組成， 或所述啟動(dòng)子基本上由基本上類(lèi)似于并在功能上等價(jià)于SEQ ID NO :10中所示的核苷酸序 列的片段組成。在功能上等價(jià)于本發(fā)明的ZmCASl啟動(dòng)子的核酸片段是任何核酸片段，其能 夠以與ZmCASl啟動(dòng)子類(lèi)似的方式控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)。ZmCASl基因及其啟動(dòng) 子的表達(dá)模式在實(shí)例1-3中闡述。
[0061] ZmCASl啟動(dòng)子編碼序列上游的玉米基因座DNA片段SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10的啟動(dòng)子活性通過(guò)下列進(jìn)行評(píng)價(jià)：將該片段與GUS基因或MS45基因連接，將啟動(dòng)子： GUS (或MS45)表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到玉米內(nèi)，并且在轉(zhuǎn)基因植物的多種細(xì)胞類(lèi)型中分析GUS (或 MS45)表達(dá)（實(shí)例1-3)。這些結(jié)果指示核酸片段包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明是包含下列、或基本上由下列組成或由下列組成的分離 的多核苷酸：
[0063] a)包含SEQ ID NO :9中所示的序列的核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；
[0064] b)包含SEQ ID NO : 10中所示的片段的核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)序列
[0065] c)包含基于BLASTN比對(duì)方法，在與（a)或（b)的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少 90%序列同一性的序列的核苷酸序列；
[0066] d)包含甘露醇脫氫酶的I. 7kb 5 '非編碼序列的全部或片段的核苷酸序列；或，
[0067] e)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、添加和/或缺失而獲得的（a)、(b)或（c)中指 示的核苷酸序列之一的衍生物；并且，
[0068] 其中所述核苷酸序列是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0069] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，ZmCASl啟動(dòng)子通過(guò)N-(氨基羰基）-2_氯苯磺酰胺 (2-CBSU)的安全劑處理進(jìn)行誘導(dǎo)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，ZmCASl啟動(dòng)子通過(guò)大于 26°C并且直到且包括37°C的溫度的熱處理進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0070] 術(shù)語(yǔ)"N-(氨基羰基）-2-氯苯磺酰胺"、2-CBSU"和"CBSU"在本文中可互換使用。
[0071] 本文公開(kāi)的啟動(dòng)子核苷酸序列和方法可用于調(diào)控任何異源核苷酸序列在宿主植 物中的誘導(dǎo)性表達(dá)，以便改變植物的表型。
[0072] 表型中的多種變化是所關(guān)注的，包括但不限于修飾植物中的脂肪酸組成、改變植 物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御機(jī)制等等。這些結(jié)果可通過(guò)提供在植物中異源產(chǎn) 物的表達(dá)或內(nèi)源產(chǎn)物的提高表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。作為另外一種選擇，結(jié)果可通過(guò)提供植物中一種 或多種內(nèi)源產(chǎn)物特別是酶或輔因子的表達(dá)減少而實(shí)現(xiàn)。這些變化導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的植物的表型變 化。
[0073] 所關(guān)注基因是涉及作物發(fā)育的基因的商業(yè)市場(chǎng)和關(guān)注的反映。作物和市場(chǎng)關(guān)注改 變，并且隨著發(fā)展中國(guó)家打開(kāi)國(guó)際市場(chǎng)，新作物和技術(shù)也將出現(xiàn)。此外，隨著我們的農(nóng)業(yè)特 征和性狀例如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢(shì)的理解提高，用于轉(zhuǎn)化的基因選擇相應(yīng)地改變。所關(guān)注基因 的一般分類(lèi)包括但不限于涉及信息的那些基因例如鋅指，涉及通信的基因例如激酶，和涉 及看家的基因例如熱休克蛋白。其他所關(guān)注基因是允許位點(diǎn)特異性基因整合和基因堆疊的 基因，包括但不限于雙鏈斷裂誘導(dǎo)基因和重組酶基因。更具體的轉(zhuǎn)基因分類(lèi)例如包括但不 限于編碼農(nóng)業(yè)重要性狀、昆蟲(chóng)抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育、谷?；蚍N子特征和商業(yè)產(chǎn) 品的基因。所關(guān)注基因一般包括涉及油、淀粉、碳水化合物或營(yíng)養(yǎng)素代謝的基因，以及影響 種子大小、植物發(fā)育、植物生長(zhǎng)調(diào)控和產(chǎn)量改善的基因。植物發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)控還指植物的各 個(gè)部分例如花、種子、根、葉和芽的發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)控。
[0074] 其他商業(yè)期望性狀是賦予寒冷、熱、鹽和干旱抗性的基因和蛋白質(zhì)。
[0075] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及重組DNA，所述重組DNA包含與至少一種異源核酸序列 可操作地連接的本發(fā)明的分離的多核苷酸，其中所述異源核酸序列編碼選自下列的基因： 雙鏈斷裂誘導(dǎo)基因、重組酶基因、報(bào)道基因、選擇標(biāo)記、疾病抗性賦予基因、除草劑抗性賦予 基因、昆蟲(chóng)抗性賦予基因；涉及碳水化合物代謝的基因、涉及脂肪酸代謝的基因、涉及氨基 酸代謝的基因、涉及植物發(fā)育的基因、涉及植物生長(zhǎng)調(diào)控的基因、涉及產(chǎn)量改善的基因、涉 及干旱抗性的基因、涉及寒冷抗性的基因、涉及植物中的熱和鹽抗性的基因。
[0076] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例涉及重組DNA，所述重組DNA包含可操作地連接至少一種 異源核酸序列的本發(fā)明的分離的多核苷酸，其中所述異源核酸序列編碼選自下列的蛋白 質(zhì)：雙鏈斷裂誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、重組酶蛋白質(zhì)、報(bào)道蛋白質(zhì)、選擇標(biāo)記、賦予疾病抗性的蛋白質(zhì)、 賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)、賦予昆蟲(chóng)抗性的蛋白質(zhì)；涉及碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)、涉及脂 肪酸代謝的蛋白質(zhì)、涉及氨基酸代謝的蛋白質(zhì)、涉及植物發(fā)育的蛋白質(zhì)、涉及植物生長(zhǎng)調(diào)控 的蛋白質(zhì)、涉及產(chǎn)量改善的蛋白質(zhì)、涉及干旱抗性的蛋白質(zhì)、涉及寒冷抗性的蛋白質(zhì)、涉及 植物中的熱抗性和鹽抗性的蛋白質(zhì)。
[0077] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例包括在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物（例如玉米或 大豆植物），所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至本發(fā)明的啟動(dòng)子片段的多核苷酸，其 中所述啟動(dòng)子片段基于Clustal V比對(duì)方法，在與SEQ ID NO :9或10進(jìn)行比較時(shí)包含至 少 40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、 63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %, 78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性，并且在與不包含所述重組 DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)，所述植物顯示出至少一種農(nóng)業(yè)特征的改變。
[0078] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例包括在其基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物（例如玉米 或大豆植物），所述抑制DNA構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子片段，其中基于Clustal V比對(duì)方 法，所述啟動(dòng)子片段在與SEQ ID NO:9或10進(jìn)行比較時(shí)包含至少40%、45%、50%、51%、 52 %,53 %,54 %,55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %, 67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %, 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97 %、98%、99 %或100 %序列同一性，并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn) 行比較時(shí)，所述植物顯示出至少一種農(nóng)業(yè)特征的改變。
[0079] 在前述實(shí)施例中的任一個(gè)或本發(fā)明的任何其他實(shí)施例中，至少一種農(nóng)業(yè)特征可選 自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植 物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨 基酸含量、種子游離氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白 質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒 伏、植物高度、穗高、穗長(zhǎng)、早期幼苗活力和在低溫脅迫下的出苗。例如，至少一種農(nóng)學(xué)特性 的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物量的提高。
[0080] 疾病和/或昆蟲(chóng)抗性基因可編碼對(duì)害蟲(chóng)的抗性，所述害蟲(chóng)具有極大的產(chǎn)量阻力例 如炭疽病、大豆花葉病毒、大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)、根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)、褐斑病、霜霉病、紫斑病、種子腐爛和幼 苗疾病，通常通過(guò)真菌-腐霉菌屬物種（Pythium sp.)、疫霉屬物種（Phytophthora sp.)、 絲核菌屬物種（Rhizoctonia sp.)、間座殼屬物種（Diaporthe sp.)引起。白葉枯病通過(guò)細(xì) 菌丁香假單胞菌大豆致病變種（Pseudomonas syringae pv. Glycinea)引起。賦予昆蟲(chóng)抗 性的基因包括例如蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)毒性蛋白質(zhì)基因（美國(guó)專(zhuān) 利 5, 366, 892 ;5, 747, 450 ;5, 737, 514 ;5, 723, 756 ;5, 593, 881 ;和 Geiser 等人（1986)Gene 48:109);凝集素 （Van Damme 等人（1994)Plant Mol. Biol. 24:825);等等。
[0081] 除草劑抗性性狀可包括編碼對(duì)除草劑的抗性的基因，所述除草劑作用于抑制乙酰 乳酸合酶（ALS)的作用，特別是磺酰脲型除草劑（例如含有導(dǎo)致此類(lèi)抗性的突變特別是S4 和/或HRA突變的乙酰乳酸合酶ALS基因）。ALS-基因突變體編碼對(duì)除草劑氯磺隆的抗性。 草甘膦乙?；D(zhuǎn)移酶（GAT)是來(lái)自地衣芽孢桿菌（Bacillus Iicheniformis)的N-乙酰轉(zhuǎn) 移酶，其通過(guò)基因改組對(duì)于廣譜除草劑草甘膦的乙?；M(jìn)行優(yōu)化，形成轉(zhuǎn)基因植物中的草 甘膦抗性的新機(jī)制基礎(chǔ)（Castle等人（2004) Science 304,1151-1154)。
[0082] 抗生素抗性基因包括例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（npt)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hpt)。 兩種新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因用于選擇轉(zhuǎn)化的生物體：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶I (nptl)基因和新 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Il(nptll)基因。第二種是更廣泛使用的。它起初從轉(zhuǎn)座子Tn5中分離， 所述轉(zhuǎn)座子Τη5存在于細(xì)菌菌株大腸桿菌（Escherichia coli)K12中。該基因編碼氨基糖 苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶（指定為aph (3' )-II或NPTII)酶，其通過(guò)磷酸化使一系列氨基糖苷 抗生素例如卡那霉素、新霉素、遺傳霉素和巴龍霉素失活。NPTII廣泛用作植物轉(zhuǎn)化的選擇 標(biāo)記。它還用于不同生物體中的基因表達(dá)和調(diào)控研宄中，部分是因?yàn)榭蓸?gòu)建保留酶活性的 N末端融合物。NPTII蛋白質(zhì)活性可通過(guò)酶促測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)。在其他檢測(cè)方法中，經(jīng)修 飾的底物，磷酸化的抗生素，通過(guò)薄層色譜法、斑點(diǎn)印跡分析或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢 測(cè)。植物例如玉米、棉花、煙草、擬南芥屬、亞麻、大豆及許多其他植物已成功地用nptll基 因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0083] 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（指定為hpt、hph或aphIV)基因最初衍生自大腸桿菌。該基 因編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT)，其使氨基環(huán)多醇抗生素潮霉素 B解毒。大量植物已用hpt 基因轉(zhuǎn)化，并且潮霉素 B已證明在廣泛范圍的植物包括單子葉植物的選擇中非常有效。大 多數(shù)植物，例如谷類(lèi)植物，顯示出對(duì)潮霉素 B比卡那霉素更高的敏感性。同樣地，hpt基因 廣泛用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。hpt基因的序列已就其中植物轉(zhuǎn)化中的使用進(jìn)行修 飾。接近于該酶的羧基（C)末端的氨基酸殘基的缺失和替換已提高在某些植物例如煙草中 的抗性水平。同時(shí)，該酶的親水C末端已得到維持，并且對(duì)于HPT的強(qiáng)活性可以是必需的。 HPT活性已使用酶促測(cè)定法進(jìn)行檢查。非破壞性愈傷組織誘導(dǎo)測(cè)試可用于驗(yàn)證潮霉素抗性。
[0084] 涉及植物生長(zhǎng)和發(fā)育的基因已在植物中得到鑒定。涉及細(xì)胞分裂素生物合成的一 種此類(lèi)基因是異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT)。細(xì)胞分裂素通過(guò)刺激細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化在植物生 長(zhǎng)和發(fā)育中起關(guān)鍵作用（Sun 等人（2003)，Plant Physiol. 131 :167-176)。
[0085] 鈣依賴(lài)性蛋白質(zhì)激酶（CDPK)，主要在植物界中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸-蘇氨酸激酶家族， 可能充當(dāng)鈣介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的傳感器分子。鈣離子是在植物生長(zhǎng)和發(fā)育期間重要的 第二信使（Harper 等人 Science 252,951-954 (1993) ;Roberts 等人 Curr Opin Cell Biol 5,242-246 (1993) ;Roberts 等人 Annu Rev Plant Mol Biol 43,375-414(1992))。
[0086] 線(xiàn)蟲(chóng)應(yīng)答蛋白質(zhì)（NRP)在感染大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)后由大豆產(chǎn)生。NRP與味道修飾糖蛋 白奇異果素以及涉及腫瘤形成和過(guò)度應(yīng)答誘導(dǎo)的NF34蛋白質(zhì)具有同源性。NRP被認(rèn)為充當(dāng) 響應(yīng)線(xiàn)蟲(chóng)感染的防御誘導(dǎo)劑（Tenhaken等人BMC Bioinformatics 6:169(2005))。
[0087] 種子和谷粒的質(zhì)量在性狀例如飽和以及不飽和的脂肪酸或油水平和類(lèi)型、必需氨 基酸的質(zhì)與量以及碳水化合物的水平中反映。因此，商業(yè)性狀還可在一種或多種基因上編 碼，所述基因可提高例如甲硫氨酸和半胱氨酸，以少量存在于大豆中的兩種含硫氨基酸。胱 硫醚γ合酶（CGS)和絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶（SAT)是分別涉及甲硫氨酸和半胱氨酸合成的 蛋白質(zhì)。
[0088] 其他商業(yè)性狀可編碼提高油種子中的例如單不飽和脂肪酸例如油酸的基因。大豆 油例如含有高水平的多不飽和脂肪酸，并且比具有更高水平的單不飽和以及飽和脂肪酸的 油更易于氧化。高油酸大豆種子可通過(guò)油?；?2-去飽和酶（Fad2)活性的重組操縱進(jìn)行 制備。高油酸大豆油可用于需要高度氧化穩(wěn)定性的應(yīng)用中，例如在高溫下的長(zhǎng)時(shí)間段烹飪。
[0089] 棉子糖在許多商業(yè)上有意義的作物物種的可食用部分中以顯著數(shù)量累積，所述作 物物種例如大豆（栽培大豆（Glycine maxL. Merrill))、甜菜（甜菜（Beta vulgaris))、 棉花（陸地棉（Gossypium hirsutum L·))、低芥酸菜子（蕓苔屬物種（Brassica sp·))以 及所有主要可食用豆類(lèi)作物，包括豆類(lèi)（菜豆屬物種（Phaseolus sp.))、鷹嘴豆（鷹嘴豆 (Cicer arietinum))、豆工豆（豆工豆（Vigna unguiculata))、綠豆（綠豆（Vigna radiata))、 豌豆（豌豆（Pisum sativum))、小扁豆（兵豆（Lens culinaris))和羽扇豆（羽扇豆屬物 種（Lupinus sp.))。盡管在許多物種中豐富，但棉子糖是一些經(jīng)濟(jì)上重要的作物物種的有 效利用的障礙。
[0090] 涉及棉子糖合成的酶例如肌醇半乳糖苷合成酶表達(dá)的下調(diào)將是期望性狀。
[0091] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明考慮具有超過(guò)一種有利的轉(zhuǎn)基因的受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。兩 種或更多種轉(zhuǎn)基因可在單一轉(zhuǎn)化事件中提供，使用不同的轉(zhuǎn)基因編碼載體，或摻入兩種或 更多種基因編碼序列的單一載體。根據(jù)需要可采用任何描述的任何兩種或更多種轉(zhuǎn)基因， 例如賦予除草劑、昆蟲(chóng)、疾?。ú《?、細(xì)菌、真菌和線(xiàn)蟲(chóng)）或干旱抗性、油量與質(zhì)的轉(zhuǎn)基因，或 提高產(chǎn)量或營(yíng)養(yǎng)素質(zhì)量的轉(zhuǎn)基因。
[0092] 術(shù)語(yǔ)"花藥"或"花藥組織"指包含細(xì)胞、細(xì)胞層和細(xì)胞類(lèi)型的雄性植物組織，所述 細(xì)胞、細(xì)胞層和細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生能夠?qū)崿F(xiàn)受精的花粉粒。這些細(xì)胞包括但不限于孢子細(xì)胞、花 粉母細(xì)胞、性母細(xì)胞、小孢子、絨氈層、支持細(xì)胞層、花粉和衍生自這些細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。
[0093] "分離的核酸片段"指核糖核苷酸（RNA)或脫氧核糖核苷酸（DNA)的聚合物，它是 單鏈或雙鏈的，任選包含合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA形式的分離的核酸片 段可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段組成。
[0094] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核酸序列"和"核酸片段" / "分離的核酸片 段"在本文中可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋核苷酸序及類(lèi)似的范圍。多核苷酸可以是RNA或 DNA的聚合物，它們可以是單鏈或雙鏈，任選地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸堿基。 DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一個(gè)或多個(gè) 片段構(gòu)成。核苷酸（通常以它們的5'-單磷酸形式存在）可以用如下的單字母名稱(chēng)指代： "A"為腺苷酸或脫氧腺苷酸（分別對(duì)應(yīng)RNA或DNA)，"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表 示鳥(niǎo)苷酸或脫氧鳥(niǎo)苷酸，"U"表示尿苷酸，"T"表示脫氧胸苷酸，"R"表示嘌呤（A或G)，"Y" 表示嘧啶（C或T)，"K"表示G或T，"H"表示A或C或T，" I "表示肌苷，并且"N"表示任意 核苷酸。
[0095] "異源核酸片段"指對(duì)于本發(fā)明的植物啟動(dòng)子序列并非天然存在的序列。雖然該核 苷酸序列對(duì)于啟動(dòng)子序列是異源的，但它對(duì)于植物宿主可以是同源的、或天然的或異源的。 然而，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的啟動(dòng)子可與其天然編碼序列一起使用，以提高或降低表達(dá)，導(dǎo)致 經(jīng)轉(zhuǎn)化的種子中的表型變化。
[0096] 術(shù)語(yǔ)"其為功能上等價(jià)的片段（或變體）"和"功能上等價(jià)的片段（或變體）"在 本文中可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)指本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的一部分或子序列或變體，其中起始 轉(zhuǎn)錄或驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)（例如產(chǎn)生某一表型）的能力被保留。片段和變體可經(jīng)由例如定點(diǎn)誘 變和合成構(gòu)建的方法獲得。與提供本文描述的啟動(dòng)子序列一樣，考慮的片段和變體作用于 促進(jìn)可操作地連接的異源核酸序列的誘導(dǎo)性表達(dá)，形成重組DNA構(gòu)建體（以及嵌合基因）。 例如，該片段或變體可用于設(shè)計(jì)重組DNA構(gòu)建體，以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生所需表型。通過(guò) 在相對(duì)于異源核苷酸序列的適當(dāng)定向中連接啟動(dòng)子片段或其變體，重組DNA構(gòu)建體可設(shè)計(jì) 用于共抑制或反義。
[0097] 調(diào)控序列的功能片段可通過(guò)來(lái)自更大序列的一個(gè)或多個(gè)缺失形成。例如，啟 動(dòng)子直到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的TATA盒的5'部分可缺失，而不取消啟動(dòng)子活性，如通過(guò) Opsahl-Sorteberg, Η-G.等人，''Identification of a 49_bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleruone cell specific express ion''Gene 341 :49-58 (2004)描述 的。此類(lèi)變體應(yīng)保留啟動(dòng)子活性?；钚钥赏ㄟ^(guò)RNA印跡分析、報(bào)道基因活性測(cè)量（當(dāng)使用 轉(zhuǎn)錄融合物時(shí)）等等進(jìn)行測(cè)量。參見(jiàn)例如以引用的方式并入本文的Sambrook等人（1989) Molecular Cloning ：A Laboratory Manual (第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N. Y.)〇
[0098] 與本發(fā)明的調(diào)控序列雜交的序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列 并與本文公開(kāi)的啟動(dòng)子序列雜交的序列將與所公開(kāi)序列至少40%同源，50%同源，70%同 源，并且甚至 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更多同源。
[0099] 更小的片段也可保留啟動(dòng)子的調(diào)控特性，因此鑒定和缺失分析是鑒定必需區(qū)的一 種方法。缺失分析可從調(diào)控區(qū)的5'和3'端兩者發(fā)生。片段可通過(guò)定點(diǎn)誘變、使用聚合酶 鏈反應(yīng)的誘變等等來(lái)獲得。（參見(jiàn)，Directed Mutagenesis :A Practical Approach IRL Press (1991))〇
[0100] 在本發(fā)明的一些方面，啟動(dòng)子片段可包含SEQ ID NO :8的至少約20個(gè)鄰接核苷 酸，或至少約50個(gè)鄰接核苷酸，或至少約75個(gè)鄰接核苷酸，或至少約100、150、200、250、 300、350、400、450、500個(gè)鄰接核苷酸，或直到本文公開(kāi)的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸 數(shù)目（例如 1746 個(gè)，SEQ ID NO : 10)。
[0101] 在另一個(gè)方面，啟動(dòng)子片段是SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10中所示的核苷酸 序列。此類(lèi)片段的核苷酸通常包含特定啟動(dòng)子序列的TATA識(shí)別序列。此類(lèi)片段可通過(guò) 使用限制性酶切割本文公開(kāi)的天然存在的啟動(dòng)子核苷酸序列，通過(guò)由天然存在的啟動(dòng)子 DNA序列合成核苷酸序列而獲得，或可通過(guò)使用PCR技術(shù)而獲得。特別參見(jiàn)Mullis等人， Methods Enzymol. 155 :335-350(1987)和Higuchi，R.于PCR Technology 〖Principles and Applications for DNA Amplifications ；Erlich, H. A.編輯；Stockton Press Inc. ：New York，1989。
[0102] 本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子序列可進(jìn)行修飾，以提供一系列異源核苷酸序列的誘導(dǎo)性 表達(dá)水平。因此，可利用小于整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，并且保留驅(qū)動(dòng)編碼序列表達(dá)的能力。如實(shí)例 1-3中所述，當(dāng)通過(guò)化學(xué)品或脅迫處理誘導(dǎo)時(shí)，I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子片段以及更長(zhǎng)的I. 7kb ZmCASl啟動(dòng)子片段能夠驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。
[0103] 本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子序列的修飾可提供一系列異源核苷酸序列的誘導(dǎo)性表達(dá)。 因此，它們可修飾為弱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。一般地，"弱啟動(dòng)子"意指驅(qū)動(dòng)編碼 序列以低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。"低水平"意指約1/10, 〇〇〇轉(zhuǎn)錄物至約1/100, 〇〇〇轉(zhuǎn)錄物至 約1/500, 000轉(zhuǎn)錄物的水平。相反，強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼序列以高水平，或以約1/10轉(zhuǎn)錄物 至約1/100轉(zhuǎn)錄物至約1/1，000轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。
[0104] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"基本上相似的"和"基本上對(duì)應(yīng)的"指其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸 堿基的變化不影響核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某一表型的能力的核酸片段。這些術(shù)語(yǔ)也 是指本發(fā)明的核酸片段的修飾（例如缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸），相對(duì)于初始的未經(jīng) 修飾的核酸片段，該修飾基本上不會(huì)改變所得核酸片段的功能特性。因此，正如本領(lǐng)域的技 術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，本發(fā)明涵蓋的不僅僅是具體的示例性序列。
[0105] 此外，技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明所涵蓋的基本上類(lèi)似的核酸序列也通過(guò)它們?cè)谥?等嚴(yán)格條件（例如〇. 5X SSC，0. 1% SDS，60°C )下與本文例示的序列雜交，或與本文報(bào)告 并在功能上等價(jià)于本發(fā)明的啟動(dòng)子的核苷酸序列的任何部分雜交的能力限定。此類(lèi)同源 性的估計(jì)通過(guò)在嚴(yán)格條件下的DNA-DNA或DNA-RNA雜交提供，所述嚴(yán)格條件如本領(lǐng)域技術(shù) 人員充分理解的（Hames 和 Higgins，編輯；于 Nucleic Acid Hybridisation ;IRL Press: Oxford，U. K.，1985)。可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以篩選中度相似的片段例如來(lái)自遠(yuǎn)緣生物的同 源序列，到篩選高度相似的片段例如從近緣生物復(fù)制功能性酶的基因。雜交后洗滌部分決 定嚴(yán)格條件。一組條件使用一系列洗滌，開(kāi)始是6X SSC、0. 5% SDS在室溫下15分鐘，然后 用2乂33(：、0.5%303在45°0下重復(fù)30分鐘，再用0.2乂33(：、0.5%303在50°0下重復(fù)兩次， 每次30分鐘。另一組嚴(yán)格條件使用更高的溫度，其中洗滌等同于上文的那些，除了在0.2X SSC、0. 5% SDS中的最后兩次30分鐘洗滌的溫度增至60°C之外。另一組高度嚴(yán)格條件使用 在0. IX SSC、0. 1% SDS中在65°C下的兩次最終洗滌。
[0106] 一般而言，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列并與本文公開(kāi)的核苷酸序列雜交的序列將 與所公開(kāi)序列至少40%同源，50%同源，70%同源，并且甚至85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。艮口，在探針和靶之間 的序列相似性可改變（range)，共享至少約40 %、約50 %、約70 %以及甚至約85 %或更多序 列相似性。
[0107] 由本發(fā)明所涵蓋的優(yōu)選的基本上類(lèi)似的核酸序列是80%等同于本文報(bào)告的核酸 片段或80%等同于本文報(bào)告的核苷酸序列的任何部分的那些序列。更優(yōu)選的是90%等同 于本文報(bào)告的核酸序列或90%等同于本文報(bào)告的核苷酸序列的任何部分的核酸片段。最 優(yōu)選的是95%等同于本文報(bào)告的核酸序列或95%等同于本文報(bào)告的核苷酸序列的任何部 分的核酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解許多序列同一性水平可用于鑒定相關(guān)多核苷酸 序列。有用的百分比同一性的例子是上文列出的那些，還優(yōu)選的是從80%到100%的任何 整數(shù)百分比，例如 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98 和 99%。
[0108] "基本上同源的序列"指所公開(kāi)序列的變體，例如得自定點(diǎn)誘變的變體以及合成 衍生的序列。本發(fā)明的基本上同源的序列還指本文公開(kāi)的特定啟動(dòng)子核苷酸序列的那些 片段，其操作為促進(jìn)可操作地連接的異源核酸片段的誘導(dǎo)性表達(dá)。這些啟動(dòng)子片段將包含 本文公開(kāi)的特定啟動(dòng)子核苷酸序列的至少約20個(gè)鄰接核苷酸，優(yōu)選至少約50個(gè)鄰接核苷 酸，更優(yōu)選至少約75個(gè)鄰接核苷酸，甚至更優(yōu)選至少約100個(gè)鄰接核苷酸。此類(lèi)片段的核 苷酸通常包含特定啟動(dòng)子序列的TATA識(shí)別序列。此類(lèi)片段可通過(guò)使用限制性酶切割本文 公開(kāi)的天然存在的啟動(dòng)子核苷酸序列；通過(guò)由天然存在的啟動(dòng)子DNA序列合成核苷酸序 列而獲得；或通過(guò)使用PCR技術(shù)而獲得。特別參見(jiàn)Mullis等人，Methods Enzymol. 155 : 335-350(1987)和Higuchi，R.于PCR Technology 〖Principles and Applications for DNA Amplifications ;Erlich，H.A.編輯；Stockton Press Inc. :New York，1989。再次，這些啟 動(dòng)子片段的變體，例如得自定點(diǎn)誘變的變體，由本發(fā)明的組合物涵蓋。
[0109] "密碼子簡(jiǎn)并性"指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況 下發(fā)生變化的遺傳密碼的趨異度。因此，本發(fā)明涉及包含核苷酸序列的任何核酸片段，所述 核苷酸序列編碼本文所示的氨基酸序列的全部或主要部分。技術(shù)人員非常了解特定宿主細(xì) 胞在使用核苷酸密碼子來(lái)確定給定氨基酸時(shí)所表現(xiàn)出的"密碼子偏好性"。因此，當(dāng)合成核 酸片段用于宿主細(xì)胞中的改善表達(dá)時(shí)，期望設(shè)計(jì)該核酸片段，使得其密碼子使用頻率接近 宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率。
[0110] 可使用 LASARGENE 生物信息學(xué)計(jì)算套件（DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign 程序，或使用Vector NTI生物信息學(xué)計(jì)算套件（Invitrogen)的AlignX程序，來(lái)測(cè)定序列比 對(duì)和相似性百分比計(jì)算。用帶默認(rèn)參數(shù)（GAP I3ENALTY= 10，GAP LENGTH PENALTY = 10)的 Clustal比對(duì)方法（Higgins和Sharp，CABIOS 5 :151-153(1989))進(jìn)行序列的多重比對(duì)。用 Clustal方法進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 1、 GAP PENALTY = 3、WIND0W = 5和DIAGONALS SAVED = 5。關(guān)于核酸，這些參數(shù)為GAP PENALTY =10, GAP LENGTH PENALTY = 10, KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW = 4,和 DIAGONALS SAVED = 4。氨基酸或核苷酸序列的"主要部分"包含足夠的多肽的氨基酸序列或基因的核 苷酸序列以提供該多肽或基因的推定鑒定，所述推定鑒定通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員的序列人工 評(píng)估，或通過(guò)使用算法例如 BLAST (Altschul，S. F.等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1993)) 和Gapped Blast(Altschul，S.F.等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402(1997))的計(jì) 算機(jī)自動(dòng)化的序列比較和鑒定。BLASTN指針對(duì)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較核苷酸查詢(xún)序列的 BLAST程序。
[0111] "基因"指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，其包括編碼序列前的調(diào)控序列（5'非編碼 序列）和編碼序列后的調(diào)控序列（3'非編碼序列）。"天然基因"指自然狀態(tài)下與其自身的 調(diào)控序列一起的基因。可互換使用的"嵌合基因"或"重組表達(dá)構(gòu)建體"指并非天然基因的 任何基因，包含在自然界中未發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包含源 自不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或源自相同來(lái)源、但排列方式與天然存在的排列方式 不同的調(diào)控序列和編碼序列。"內(nèi)源性基因"指在生物體基因組中處于其天然位置的天然基 因。"外來(lái)基因"是指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，它通過(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生 物內(nèi)。外來(lái)基因可以包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因"是已通 過(guò)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組內(nèi)的基因。
[0112] "編碼序列"指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"調(diào)控序列"指位于編碼序列的 上游（5'非編碼序列）、中間或下游（3'非編碼序列），并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA 加工或穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含 子和多腺苷酸化識(shí)別序列。
[0113] "5'非編碼序列"指位于編碼序列上游的DNA序列，所述DNA序列影響相關(guān)編碼序 列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。
[0114] "內(nèi)含子"是基因中的間插序列，其被轉(zhuǎn)錄成RNA，但隨后在生成成熟mRNA的過(guò)程 中被切除。該術(shù)語(yǔ)也用于切除的RNA序列。"外顯子"是被轉(zhuǎn)錄的基因序列的一部分，并且 存在于得自該基因的成熟信使RNA中，但是不是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的必需部分。
[0115] 術(shù)語(yǔ)"組成型啟動(dòng)子"指在所有或大部分發(fā)育階段在所有或大多數(shù)組織中活性的 啟動(dòng)子。與分類(lèi)為"組成型"的其他啟動(dòng)子（例如泛素）一樣，絕對(duì)表達(dá)水平中的一些變化 可存在于不同組織或階段中。
[0116] 術(shù)語(yǔ)"組成型啟動(dòng)子"或"組織不依賴(lài)性啟動(dòng)子"在本文中可互換使用。
[0117] 術(shù)語(yǔ)"組織特異性啟動(dòng)子"指已顯示僅在特定類(lèi)型的細(xì)胞或組織中以更高水平指 導(dǎo)RNA合成的啟動(dòng)子，并且如果啟動(dòng)子在某些組織中優(yōu)選指導(dǎo)RNA合成，但在其他組織在也 以減少水平指導(dǎo)RNA合成，則通常被稱(chēng)為"組織特異性啟動(dòng)子"或"組織優(yōu)選的啟動(dòng)子"。
[0118] 在最常用的啟動(dòng)子中有胭脂堿合酶（NOS)啟動(dòng)子（Ebert等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 :5745-5749 (1987))，章魚(yú)堿合酶（OCS)啟動(dòng)子，花椰菜花葉病毒 屬啟動(dòng)子例如花椰菜花葉病毒（CaMV) 19S啟動(dòng)子（Lawton等人，Plant Mol. Biol. 9 : 315-324(1987))，CaMV 35S 啟動(dòng)子（Odell 等人，Nature 313 :810-812 (1985))，和玄參 花葉病毒35S啟動(dòng)子（Sanger等人，Plant Mol. Biol. 14 :433-43 (1990))，來(lái)自核酮糖 二磷酸輕化酶小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，Adh啟動(dòng)子（Walker等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 :6624-66280 (1987)，蔗糖合酶啟動(dòng)子（Yang 等人，？1'〇。.恥七1.八。&(1.5(^· U.S. A. 87 :4144-4148 (1990))，R基因復(fù)合體啟動(dòng)子（Chandler 等人，Plant Cell 1: 1175-1183(1989))，葉綠素 a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子等。其他常用啟動(dòng)子是用于馬鈴薯 塊莖ADPGPP基因的啟動(dòng)子，蔗糖合酶啟動(dòng)子，顆粒結(jié)合淀粉合酶啟動(dòng)子，谷蛋白基因啟動(dòng) 子，玉米蠟質(zhì)啟動(dòng)子，Brittle基因啟動(dòng)子和Shrunken 2啟動(dòng)子，酸性殼多糖酶基因啟動(dòng) 子和玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子（15kD、16kD、19kD、22kD和27kD ;Perdersen等人，Cell 29 : 1015-1026(1982))。更多的啟動(dòng)子在于2000年4月6日公布的PCT公布WO 00/18963中 描述，所述PCT公布的公開(kāi)內(nèi)容在此以引用方式并入。
[0119] "翻譯前導(dǎo)序列"指位于基因的啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前 導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列的經(jīng)充分加工后的mRNA上游。翻譯前導(dǎo)序列可影響mRNA的 初級(jí)轉(zhuǎn)錄過(guò)程、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的例子已得到描述（Turner，R.和 Foster, G. D. , Molecular Biotechnology 3 ：225 (1995))〇
[0120] "3'非編碼序列"指位于編碼序列下游的DNA序列，并且包括多腺苷酸化識(shí)別序列 和其他編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)的序列。多腺苷酸化信號(hào)通常表征 為影響多腺苷酸片添加到mRNA前體的3'端。不同3'非編碼序列的用途通過(guò)Ingelbrecht 等人 Plant Cell I :671-680(1989)例示。
[0121] " RNA轉(zhuǎn)錄物"指得自RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA 序列的完全互補(bǔ)的拷貝時(shí)，它被稱(chēng)為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或它可以是衍生自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后 加工的RNA序列并被稱(chēng)為成熟RNA。"信使RNA"（ "mRNA"）指無(wú)內(nèi)含子并且可通過(guò)細(xì)胞翻 譯成蛋白質(zhì)的RNA。"cDNA"指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。 cDNA可以是單鏈的或通過(guò)使用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)換成雙鏈的。"有義"RNA 指包括mRNA并因此可在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。"反義RNA"指與靶初 級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或一部分互補(bǔ)，并阻斷靶基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄物累積的RNA轉(zhuǎn)錄物（美 國(guó)專(zhuān)利5, 107, 065)。反義RNA可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即Y非編碼序列、3'非 編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補(bǔ)。"功能RNA"指反義RNA、核酶RNA或其他不能翻譯但是 對(duì)細(xì)胞過(guò)程有影響作用的RNA。
[0122] 術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指單個(gè)核酸片段上的核酸序列的關(guān)聯(lián)，以使得其中一個(gè)核 酸序列的功能受到另一個(gè)核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)（即， 該編碼序列受到該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制）時(shí)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接。編碼 序列可以按有義或反義的方向可操作地連接至調(diào)控序列。
[0123] 如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指功能終末產(chǎn)物例如mRNA或蛋白質(zhì)（前體或成熟的） 的生產(chǎn)。
[0124] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)盒"指可將核酸序列或片段導(dǎo)入其中的不連續(xù)的核酸片 段。
[0125] 基因的表達(dá)或過(guò)表達(dá)涉及基因轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。"反義抑 制"指產(chǎn)生能夠抑制靶蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物。"超表達(dá)"指在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生的基 因產(chǎn)物超出在正常生物或未轉(zhuǎn)化生物中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的水平。"共抑制"指能抑制相同 的或基本上類(lèi)似的外源或內(nèi)源基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄物累積的有義RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生（美國(guó)專(zhuān)利 5, 231，020)。共抑制的機(jī)制可處于DNA水平（例如DNA甲基化），轉(zhuǎn)錄水平，或轉(zhuǎn)錄后水平。
[0126] 以前已通過(guò)集中于超表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列設(shè)計(jì)了植物中的 共抑制構(gòu)建體，它導(dǎo)致所有與超表達(dá)序列具有同源性的RNA減少（參見(jiàn)Vaucheret等人， Plant J. 16 :651-659 (1998);以及 Gura，Nature 404 :804-808 (2000))。該現(xiàn)象的總體效率 較低，并且RNA減少的程度變化較大。近期工作已描述了 "發(fā)夾"結(jié)構(gòu)的使用，該結(jié)構(gòu)以互補(bǔ) 方向摻入mRNA編碼序列的全部或一部分，導(dǎo)致用于表達(dá)的RNA的潛在"莖-環(huán)"結(jié)構(gòu)（于 1999年10月21日公布的PCT公布WO 99/53050 ;和于2002年1月3日公布的PCT公布 WO 02/00904)。這在獲得的轉(zhuǎn)基因植物中提高了共抑制的頻率。另一種變化描述了使用植 物病毒序列指導(dǎo)近端mRNA編碼序列的抑制或"沉默"（于1998年8月20日公布的PCT公 布TO 98/36083)。遺傳學(xué)和分子證據(jù)已獲得，提示dsRNA介導(dǎo)的mRNA切割可能已成為在這 些基因沉默現(xiàn)象下的保守機(jī)制（Elmayan等人，Plant Cell 10:1747-1757(1998) ;Galun， In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant 41 (2) :113-123(2005) ;Pickford 等人，Cell.Mol.Life Sci. 60(5) :871-882(2003)) 〇
[0127] 如本文所述，"抑制"指在與具有天然酶或蛋白質(zhì)的非轉(zhuǎn)基因或野生型植物中可檢 測(cè)的酶活性或蛋白質(zhì)功能性水平進(jìn)行比較時(shí)，在轉(zhuǎn)基因植物中可檢測(cè)的酶活性或蛋白質(zhì)功 能性（例如與蛋白質(zhì)相關(guān)的表型）水平的減少。具有天然酶的植物中的酶活性水平在本文 中被稱(chēng)為"野生型"活性。具有天然蛋白質(zhì)的植物中的蛋白質(zhì)功能性水平在本文中被稱(chēng)為 "野生型"功能性。術(shù)語(yǔ)"抑制"包括減低、減少、下調(diào)、降低、抑制、消除和阻止。該減少可 能是由于天然mRNA翻譯成活性酶或功能蛋白質(zhì)中的降低。也可能是由于天然DNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA的量降低和/或天然mRNA的降解加快。術(shù)語(yǔ)"天然酶"指在非轉(zhuǎn)基因或野生型細(xì)胞中 天然產(chǎn)生的酶。術(shù)語(yǔ)"非轉(zhuǎn)基因"和"野生型"在本文中可互換使用。
[0128] "改變表達(dá)"指在轉(zhuǎn)基因生物體中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量或比例顯著不同于通過(guò)相 應(yīng)的野生型生物體產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的量（即表達(dá)是提高的或降低的）。
[0129] "轉(zhuǎn)化"指將核酸片段轉(zhuǎn)入宿主生物的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。含有轉(zhuǎn)化核 酸片段的宿主生物被稱(chēng)為"轉(zhuǎn)基因"生物體。優(yōu)選的大豆細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法是使用粒子加速的或 "基因槍"轉(zhuǎn)化技術(shù)（Klein，T.，Nature (London) 327 :70-73 (1987);美國(guó)專(zhuān)利 4, 945, 050)。
[0130] "瞬時(shí)表達(dá)"指通常報(bào)道基因例如葡糖苷酸酶（⑶S)，熒光蛋白質(zhì)基因 GFP、 ZS-YELL0W1N1、AM-CYAN1、DS-RED在宿主生物體的所選某些細(xì)胞類(lèi)型中的瞬時(shí)表達(dá)，其中轉(zhuǎn) 基因基因通過(guò)轉(zhuǎn)化方法瞬時(shí)導(dǎo)入。在瞬時(shí)基因表達(dá)測(cè)定法后，隨后棄去宿主生物體的經(jīng)轉(zhuǎn) 化的材料。
[0131] 本文所用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，并且Sambrook， J.等人于 Molecular Cloning ：A Laboratory Manual ;第 2 版；Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor，New York，1989(下文"Sambrook 等人，1989"） 或 Ausubel，F(xiàn). M.，Brent，R.，Kingston，R. E.，Moore，D. D.，Seidman，J. G.，Smith，J. A.和 Struhl, K.編輯；于 Current Protocols in Molecular Biology ；John Wiley and Sons ： 他界￥〇^，199〇(下文"41181^61等人，199〇"）中更全面地描述。
[0132] "PCR"或"聚合酶鏈反應(yīng)"是用于合成大量的特定DNA區(qū)段的技術(shù)，由一系列重復(fù) 循環(huán)組成（Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。典型地，雙鏈 DNA 被熱變性， 兩種與目標(biāo)片段的3'端區(qū)域互補(bǔ)的引物在較低溫度下與之退火，然后在中間溫度下得到 延伸。這三個(gè)連續(xù)步驟中的一組包含一個(gè)循環(huán)。
[0133] 術(shù)語(yǔ)"重組多核苷酸"、"重組核苷酸"、"重組DNA"、"重組DNA構(gòu)建體"和"重組表 達(dá)構(gòu)建體"在本文中可互換使用。重組DNA構(gòu)建體包含人工的或異源的核酸序列組合，例 如在自然界中未發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)控序列和編碼序列。例如，重組DNA構(gòu)建體可包含質(zhì)粒載 體或其片段，所述質(zhì)粒載體包含本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和異源目的多核苷酸。在其他實(shí)施 例中，重組構(gòu)建體可包含衍生自玉米、稻、高粱或不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或衍生 自相同來(lái)源但以不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。此類(lèi)構(gòu)建體可 獨(dú)自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方 法，該宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員充分了 解為了成功轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含本文提供的任何分離的核酸片段的宿主細(xì)胞，必須存在 于載體上的遺傳元件。技術(shù)人員也應(yīng)認(rèn)識(shí)到不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和模式的 表達(dá)（Jones 等人，EMBO J.4 :2411-2418(1985) ;De Almeida 等人，Mol. Gen. Genetics 218: 78-86 (1989))，并且因此必須篩選多個(gè)事件以便獲得展示所需表達(dá)水平和模式的品系。這 種篩選可通過(guò)DNA的Southern印跡分析、mRNA表達(dá)的Northern印跡分析、蛋白表達(dá)的免 疫印跡分析或表型分析等完成。
[0134] 本文證實(shí)玉米甘露醇脫氫酶基因啟動(dòng)子ZmCASl事實(shí)上可用作誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以 驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá)，并且此類(lèi)啟動(dòng)子可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員分離并使用。誘導(dǎo)的GUS 和MS45表達(dá)已在庫(kù)組織（sink tissue)例如花藥、愈傷組織、根和幼苗的芽以及發(fā)育中的 葉中觀(guān)察到（實(shí)例1-3)。
[0135] 甘露醇代謝在針對(duì)生命和無(wú)生命脅迫兩者的植物應(yīng)答中起重要作用。（Stoop等人 2001，Trends in Plant Science，第 1 卷，Issue 5,1996 年5 月，第 139-144 頁(yè)）。暴露于 高鹽度的芹菜植物顯示主要通過(guò)庫(kù)組織中的甘露醇脫氫酶活性降低引起的甘露醇累積提 高（Stoop 和 Pharr. 1993Plant Physiol. 103 :1001-1008)。如圖 IB 所示，ZmCASlcDNA(SEQ ID NO :5)顯示與玉米甘露醇脫氫酶（GI :226528549 ;SEQ ID NO :6)的高同一性％，圖I (B)。 連同我們的下列觀(guān)察=ZmCASl啟動(dòng)子可通過(guò)化學(xué)品例如安全劑或脅迫例如熱處理進(jìn)行誘 導(dǎo)，還可測(cè)試ZmCASl啟動(dòng)子響應(yīng)脅迫例如但不限于干旱、滲透或鹽脅迫或其組合的能力。
[0136] 由本文闡述的本公開(kāi)明確的是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可進(jìn)行下列操作：
[0137] 1)使含有ZMCASl啟動(dòng)子序列的核酸片段與合適的報(bào)道基因可操作地連接；存在 本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種報(bào)道基因，包括細(xì)菌GUS基因，螢火蟲(chóng)螢光素酶基因以及 青色、綠色、紅色和黃色熒光蛋白基因；對(duì)于其可獲得容易可靠測(cè)定法的任何基因可充當(dāng)報(bào) 道基因。
[0138] 2)將嵌合ZmCASl啟動(dòng)子：報(bào)道基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到適當(dāng)植物內(nèi)用于啟動(dòng)子的表達(dá)。 存在本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的可用作轉(zhuǎn)化的宿主的多種適當(dāng)植物，包括雙子葉植物：擬 南芥屬、煙草、大豆、油料種子、花生、向日葵、紅花、棉花、番茄、馬鈴薯、可可以及單子葉植 物：玉米、小麥、稻、大麥和棕櫚。
[0139] 3)通過(guò)測(cè)定報(bào)道基因產(chǎn)物的表達(dá)，來(lái)測(cè)試ZmCASl啟動(dòng)子在多種轉(zhuǎn)基因植物組織 的細(xì)胞類(lèi)型例如葉、根、花、種子中的表達(dá)，所述轉(zhuǎn)基因植物組織用嵌合ZmCASl啟動(dòng)子：報(bào) 道基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化。
[0140] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連 接至本發(fā)明的任何啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件的組合的至少一種異源核酸片段。重組DNA構(gòu)建體 可通過(guò)將本發(fā)明啟動(dòng)子的核酸片段或片段與異源核酸片段可操作地連接，所述片段基本上 類(lèi)似于并在功能上等價(jià)于SEQ ID NO :9或10中所示的核苷酸序列的任何部分。任何異源 核酸片段可用于實(shí)踐本發(fā)明。選擇取決于待實(shí)現(xiàn)的所需應(yīng)用或表型?？刹倏v多種核酸序列， 以便提供以適當(dāng)定向的核酸序列。認(rèn)為如本文所述的啟動(dòng)子元件的多種組合可用于實(shí)踐本 發(fā)明。
[0141] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連 接至本發(fā)明的ZmCASl啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件的組合的至少一種乙酰乳酸合酶（ALS)核酸片 段。乙酰乳酸合酶基因涉及植物中支鏈氨基酸的生物合成，并且是幾種除草劑包括磺酰脲 的作用部位。編碼可不再結(jié)合除草劑的蛋白質(zhì)的突變的乙酰乳酸合酶基因的表達(dá)允許轉(zhuǎn)基 因植物對(duì)除草劑抗性（美國(guó)專(zhuān)利5, 605, 011、美國(guó)專(zhuān)利5, 378, 824)。突變的乙酰乳酸合酶 基因也廣泛應(yīng)用植物轉(zhuǎn)化中，以選擇轉(zhuǎn)基因植物。
[0142] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含如本文所述的本發(fā) 明的重組DNA構(gòu)建體或如本文所述的本發(fā)明的分離多核苷酸。能用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì) 胞的例子包括但不限于酵母、細(xì)菌、和植物。
[0143] 可構(gòu)建包含本發(fā)明的重組表達(dá)構(gòu)建體的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體的選擇取決于將用于 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。技術(shù)人員熟知為了成功地轉(zhuǎn)化、篩選和繁殖包含嵌合基因的宿主細(xì) 胞，必須存在于質(zhì)粒載體上的遺傳元件。
[0144] 轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染方法對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的；多種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法是目前可獲得的。 隨著更新的方法可由于轉(zhuǎn)化作物或其他宿主細(xì)胞，它們可直接應(yīng)用。因此，廣泛多樣的方法 已開(kāi)發(fā)用于將DNA序列插入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，以獲得序列的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄物和翻譯，以 實(shí)現(xiàn)生物體中的表型變化。因此，可采用提供用于有效轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的任何方法。
[0145] 用于將表達(dá)載體導(dǎo)入對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的植物組織內(nèi)的方法是不同 的，并且將取決于所選植物。用于轉(zhuǎn)化廣泛多樣的植物物種的操作是眾所周知的并且在 文獻(xiàn)自始至終描述。參見(jiàn)例如，Miki等人，"Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" 于 Methods in Plant Molecular Biotechnology，同上；Klein 等人，Bio/ Technology 10 :268 (1992);和 Weising 等人，Ann. Rev. Genet. 22 :421-477(1988)。例 如，可使用例如下列技術(shù)將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組DNA內(nèi)：微粒介導(dǎo)的遞送 (Klein 等人，Nature 327 :70-73(1987));電穿孔（Fromm 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 5824(1985));聚乙二醇（PEG)沉淀（Paszkowski 等人，EMBO J. 3 :2717-2722(1984));直接 基因轉(zhuǎn)移（W0 85/01856和EP No. 0275069);體外原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（美國(guó)專(zhuān)利4, 684, 611); 和植物細(xì)胞原生質(zhì)體或胚性愈傷組織的顯微注射（Crossway，Mol. Gen. Genetics 202 : 179-185(1985))。植物組織與根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)的共培養(yǎng) 是另一個(gè)選項(xiàng)，其中將DNA構(gòu)建體置于二元載體系統(tǒng)內(nèi)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5, 591，616 ; Ishida 等人，"High Efficiency Transformation of Maize (Zea mays L. )mediated by Agrobacterium tumefaciens"Nature Biotechnology 14:745-750(1996)。當(dāng)根癌土壤桿 菌感染細(xì)胞時(shí)，根癌土壤桿菌宿主的毒性功能將指導(dǎo)該構(gòu)建體插入植物細(xì)胞DNA內(nèi)。參見(jiàn) 例如 Horsch 等人，Science 233 :496-498 (1984)和 Fraley 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 80 : 4803(1983)。
[0146] 用于轉(zhuǎn)化低芥酸菜子的標(biāo)準(zhǔn)方法在Moloney等人"High Efficiency Transformation of Brassica napus using Agrobacterium VectorsT3Iant Cell Reports 8:238-242(1989)中描述。玉米轉(zhuǎn)化通過(guò) Fromm 等人，Bio/Technology 8:833(1990)描 述。土壤桿菌屬（Agrobacterium)主要用于雙子葉植物中，但某些單子葉植物例如玉米也 可通過(guò)土壤桿菌屬進(jìn)行轉(zhuǎn)化（美國(guó)專(zhuān)利5, 550, 318)。稻轉(zhuǎn)化通過(guò)Hiei等人，"Efficient Transformation of Rice(Oryza sativa L. )Mediated by Agrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T_DNA"The Plant Journal 6(2) :271_282(1994)， Christou 等人，Trends in Biotechnology 10 :239(1992)和 Lee 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:6389(1991)。小麥可通過(guò)類(lèi)似于用于轉(zhuǎn)化玉米或稻的技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。高粱轉(zhuǎn) 化在Casas等人，同上以及通過(guò)Wan等人，PlantPhysiol. 104 :37(1994)描述。大豆轉(zhuǎn)化在 許多出版物包括美國(guó)專(zhuān)利5, 015, 580中描述。
[0147] 當(dāng)提及將核苷酸序列"導(dǎo)入"植物內(nèi)時(shí)，它意指這可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化方法發(fā)生，例如 植物組織的土壤桿菌轉(zhuǎn)化、微粒轟擊、電穿孔或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法中的任何 一種；或者，它可通過(guò)使具有異源核苷酸序列的植物與另一種植物雜交，使得后代具有摻入 其基因組內(nèi)的核苷酸序列而發(fā)生。此類(lèi)育種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
[0148] 用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物（主要通過(guò)使用根瘤土壤桿菌）并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法 已得到公布，尤其用于棉花（美國(guó)專(zhuān)利5, 004, 863、美國(guó)專(zhuān)利5, 159, 135);大豆（美國(guó)專(zhuān)利 5, 569, 834,美國(guó)專(zhuān)利5, 416, 011);蕓苔屬（美國(guó)專(zhuān)利5, 463, 174);花生（Cheng等人，Plant Cell R印.15 :653-657 (1996)，McKently 等人，Plant Cell R印.14 :699-703 (1995));番木 瓜（Ling 等人，Bio/technology 9 :752-758(1991));以及碗豆（Grant 等人，Plant Cell R印.15 :254-258(1995))。關(guān)于其他常用植物轉(zhuǎn)化方法的綜述，參見(jiàn)Newell，C. A.，Mol. Biotechnol.，16 :53-65 (2000)。這些轉(zhuǎn)化方法之一使用發(fā)根土壤桿菌（Agrobacterium rhizogenes) (Tepfler，M·和 Casse-Delbart，F(xiàn). Microbiol. Sci.，4 :24-28 (1987))。已公布 了使用DNA直接遞送的大豆轉(zhuǎn)化，使用PEG融合（PCT公布WO 92/17598)、電穿孔（Chowrira 等人，Mol. Biotechnol.，3 :17-23 (1995) ;Christou 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 : 3962-3966 (1987))、顯微注射或粒子轟擊（McCabe 等人，BiolTechnology 6:923(1988); Christou 等人，Plant Physiol. 87 :671-674(1988)) 〇
[0149] 存在多種用于從植物組織再生植物的方法。再生的具體方法將取決于起始植物組 織以及待再生的具體植物物種。從單植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從多種經(jīng)轉(zhuǎn)化的外植體再生、 發(fā)育和培養(yǎng)植物是本領(lǐng)域所熟知的（Weissbach和Weissbach，編輯；于Methods for Plant Molecular Biology ;Academic Press，Inc. :San Diego，CA，1988)。該再生和生長(zhǎng)過(guò)程通 常包括如下步驟：選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)這些個(gè)體化的細(xì)胞通過(guò)胚發(fā)育的通常階段或通 過(guò)生根小植株階段。轉(zhuǎn)基因胚以及種子以類(lèi)似的方式再生。隨后將所得的轉(zhuǎn)基因的生根小 苗種植在諸如土壤之類(lèi)的合適植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，將再生的植物進(jìn)行自花授粉以 產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，將得自再生植物的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的 植物進(jìn)行雜交。相反，將來(lái)自這些重要品系的植物的花粉用于給再生植物授粉。利用本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
[0150] 除以上所討論的操作外，從業(yè)者熟悉標(biāo)準(zhǔn)資源材料，所述材料描述用于大分子 (例如DNA分子、質(zhì)粒等等）的構(gòu)建、操縱和分離，重組DNA片段和重組表達(dá)構(gòu)建體的生成 以及克隆的篩選和分離的特定條件和操作（參見(jiàn)例如Sambrook，J.等人，于Molecular Cloning ：A Laboratory Manual ;第 2 版；Cold Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor，New York，1989 ;Maliga 等人，于 Methods in Plant Molecular Biology ； Cold Spring Harbor Press，1995 ;Birren 等人，于 Genome Ahalysis detecting Genes， I ；Cold Spring Harbor :New York，1998 ;Birren 等人，于 Genome Analysis Analyzing DNA，2 ;Cold Spring Harbor :New York，1998 ;Clark編輯，于 Plant Molecular Biology :A Laboratory Manual ;Springer :New York，1997)〇
[0151] 技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和模式的嵌合基因表 達(dá)（Jones 等人，EMBO J.4:2411-2418(1985) ;DeAlmeida 等人，Mol. Gen. Genetics 218: 78-86(1989))。因此，必須篩選多重事件以便獲得顯示期望表達(dá)水平和模式的品系。此類(lèi) 篩選可通過(guò)mRNA表達(dá)的RNA分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)分析或表型分析來(lái)完成。還關(guān)注的 是得自展示所需基因表達(dá)概況的轉(zhuǎn)化植物的種子。
[0152] 嵌合基因在大多數(shù)植物細(xì)胞中的誘導(dǎo)性表達(dá)使得當(dāng)需要靶異源核酸片段的誘導(dǎo) 性表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的ZmCASl啟動(dòng)子尤其有用。
[0153] 本發(fā)明的ZmCASl啟動(dòng)子的另一個(gè)一般應(yīng)用是構(gòu)建嵌合基因，所述嵌合基因可用 于減少植物細(xì)胞中的至少一種異源核酸片段的表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于異源核酸片 段的基因沉默的嵌合基因可通過(guò)將該片段與本發(fā)明的ZmCASl啟動(dòng)子連接進(jìn)行構(gòu)建。（關(guān)于 經(jīng)由共抑制阻斷植物基因表達(dá)的方法，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5, 231，020,以及于1999年10月21日 公布的PCT公布WO 99/53050、于2002年1月3日公布的PCT公布WO 02/00904和于1998 年8月20日公布的PCT公布WO 98/36083。）作為另外一種選擇，設(shè)計(jì)為表達(dá)用于異源核 酸片段的反義RNA的嵌合基因可通過(guò)將該片段以反向方向與本發(fā)明的ZmCASl啟動(dòng)子連接 進(jìn)行構(gòu)建。（關(guān)于經(jīng)由反義RNA阻斷植物基因表達(dá)的方法，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5, 107, 065。）共 抑制或反義嵌合基因可經(jīng)由轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物內(nèi)。隨后選擇其中異源核酸片段的表達(dá)是降低或 消除的轉(zhuǎn)化體。
[0154] 本發(fā)明還涉及改變（提高或降低）植物細(xì)胞中的至少一種異源核酸片段表達(dá)的方 法，所述方法包括：
[0155] (a)用本文描述的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；
[0156] (b)通過(guò)對(duì)（a)的細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；
[0157] (C)由步驟（a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)能繁殖的成熟植物；以及，
[0158] (d)選擇含有經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物，其中所述異源核酸片段的表達(dá)是提高的 或降低的。
[0159] 轉(zhuǎn)化和選擇可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法包括但不限于本文描述的方 法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0160] 本文所公開(kāi)的組合物和方法的非限制性例子如下：
[0161] 1. 一種分離的多核苷酸，包含：
[0162] a)包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10中所示的序列的核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ) 序列；
[0163] b)包含SEQ ID NO :10的功能片段的核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；
[0164] c)包含基于BLASTN比對(duì)方法，在與（a)或（b)的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少 85%序列同一性的序列的核苷酸序列；
[0165] d)在65°C下0. 1SSC、0. 1% (w/v)SDS洗滌的高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :9雜 交的核苷酸序列；
[0166] e)包含甘露醇脫氫酶的I. 7kb 5'非編碼序列的全部或片段的核苷酸序列；或，
[0167] f)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、添加和/或缺失而獲得的（a)、(b)、（c)、（d)或 (e)中指示的核苷酸序列之一的衍生物；并且，其中所述核苷酸序列是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0168] 2.根據(jù)實(shí)施例1所述的分離的多核苷酸，其中基于BLASTN比對(duì)方法，c)的核苷酸 序列在與SEQ ID NO :1中所示的序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少90%同一性。
[0169] 3.根據(jù)實(shí)施例1所述的分離的多核苷酸，其中基于BLASTN比對(duì)方法，c)的核苷酸 序列在與SEQ ID NO :1中所示的序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少95%同一性。
[0170] 4.根據(jù)實(shí)施例1所述的分離的多核苷酸，其中基于BLASTN比對(duì)方法，c)的核苷酸 序列在與SEQ ID NO :1中所示的序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少98%同一性。
[0171] 5.根據(jù)實(shí)施例1所述的分離的多核苷酸，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過(guò)化學(xué)品或脅 迫處理進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0172] 6.根據(jù)實(shí)施例1所述的分離的多核苷酸，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過(guò)安全劑或熱 處理進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0173] 7.根據(jù)實(shí)施例6所述的分離的多核苷酸，其中所述安全劑是N-(氨基羰基）-2-氯 苯磺酰胺。
[0174] 8.根據(jù)實(shí)施例6所述的分離的多核苷酸，其中所述熱處理包括大于26°C的溫度。
[0175] 9. -種重組DNA構(gòu)建體，包含可操作地連接至少一種異源核酸序列的實(shí)施例1所 述的分離的多核苷酸。
[0176] 10.根據(jù)實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述異源核酸序列編碼選自下列的 基因：雙鏈斷裂誘導(dǎo)基因、重組酶基因、報(bào)道基因、選擇標(biāo)記、疾病抗性賦予基因、除草劑抗 性賦予基因、昆蟲(chóng)抗性賦予基因；涉及碳水化合物代謝的基因、涉及脂肪酸代謝的基因、涉 及氨基酸代謝的基因、涉及植物發(fā)育的基因、涉及植物生長(zhǎng)調(diào)控的基因、涉及產(chǎn)量改善的基 因、涉及干旱抗性的基因、涉及寒冷抗性的基因、涉及植物中的熱和鹽抗性的基因。
[0177] 11.根據(jù)實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述異源核酸序列編碼選自下列的 蛋白質(zhì)：雙鏈斷裂誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、重組酶蛋白質(zhì)、報(bào)道蛋白質(zhì)、選擇標(biāo)記、賦予疾病抗性的蛋白 質(zhì)、賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)、賦予昆蟲(chóng)抗性的蛋白質(zhì)；涉及碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)、涉 及脂肪酸代謝的蛋白質(zhì)、涉及氨基酸代謝的蛋白質(zhì)、涉及植物發(fā)育的蛋白質(zhì)、涉及植物生長(zhǎng) 調(diào)控的蛋白質(zhì)、涉及產(chǎn)量改善的蛋白質(zhì)、涉及干旱抗性的蛋白質(zhì)、涉及寒冷抗性的蛋白質(zhì)、 涉及植物中的熱抗性和鹽抗性的蛋白質(zhì)。
[0178] 12. -種載體，包含實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體。
[0179] 13. -種細(xì)胞，包含實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體。
[0180] 14.根據(jù)實(shí)施例13所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
[0181] 15.根據(jù)實(shí)施例14所述的植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞具有穩(wěn)定摻入其基因組內(nèi)的實(shí) 施例9所述的重組DNA構(gòu)建體。
[0182] 16. -種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有穩(wěn)定摻入其基因組內(nèi)的實(shí)施例9所述 的重組DNA構(gòu)建體。
[0183] 17.根據(jù)實(shí)施例16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
[0184] 18.根據(jù)實(shí)施例17所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述單子葉植物選自：玉米、小麥、稻、 大麥、高粱、粟、甘蔗和黑麥。
[0185] 19.根據(jù)實(shí)施例16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
[0186] 20.根據(jù)實(shí)施例19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述雙子葉植物選自：大豆、蕓苔屬物 種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵。
[0187] 21.由實(shí)施例16的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。
[0188] 22. -種用重組表達(dá)構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含植物啟動(dòng) 子和可操作地連接至所述啟動(dòng)子的異源核酸片段，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子且能夠 控制所述異源核酸片段在植物細(xì)胞中的表達(dá)，并且進(jìn)一步地，其中所述啟動(dòng)子包含SEQ ID NO: 10的片段。
[0189] 23. -種在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼序列或功能RNA的方法，包括：
[0190] a)將實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)，其中所述至少一種異源序 列包含編碼序列或功能RNA ;
[0191] b)使步驟a)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)；
[0192] c)通過(guò)對(duì)b)的植物細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及，
[0193] d)選擇展示重組DNA構(gòu)建體的編碼序列或功能RNA表達(dá)的植物細(xì)胞。
[0194] 24.根據(jù)實(shí)施例23所述的方法，其中所述化學(xué)品是安全劑。
[0195] 25.根據(jù)實(shí)施例23所述的方法，其中所述脅迫處理是熱處理。
[0196] 26.根據(jù)實(shí)施例23所述的方法，所述方法還包括使d)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)成植物。
[0197] 27. -種在花藥細(xì)胞中表達(dá)編碼序列或功能RNA的方法，所述方法
[0198] 包括：
[0199] a)將實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)，其中所述至少一種異源序 列包含編碼序列或功能RNA ;
[0200] b)使步驟a)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)；
[0201] c)通過(guò)對(duì)b)的植物細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及，
[0202] d)鑒定展示重組DNA構(gòu)建體的編碼序列或功能RNA表達(dá)的花藥細(xì)胞。
[0203] 28.根據(jù)實(shí)施例23或?qū)嵤├?7所述的方法，其中所述至少一種異源序列是瞬時(shí)表 達(dá)的。
[0204] 29.根據(jù)實(shí)施例23或?qū)嵤├?7所述的方法，其中所述至少一種異源序列穩(wěn)定摻入 所述植物細(xì)胞中。
[0205] 30. -種用于改變植物中至少一種異源核酸片段的表達(dá)的方法，包括：
[0206] (a)用實(shí)施例9所述的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；
[0207] (b)通過(guò)對(duì)（a)的細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子
[0208] (c)由步驟（a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)能繁殖的成熟植物；以及，
[0209] (d)選擇含有所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物，其中所述異源核酸片段的表達(dá)是提 高的或降低的。
[0210] 31. -種轉(zhuǎn)基因改變可銷(xiāo)售的植物性狀的方法，包括：
[0211] a)將實(shí)施例9所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物內(nèi)；
[0212] b)通過(guò)對(duì)（a)的植物的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；
[0213] c)使得自步驟b)的能繁殖的、成熟植物生長(zhǎng)；以及
[0214] d)基于所述改變的可銷(xiāo)售的性狀，選擇在至少一種植物組織中表達(dá)所述至少一種 異源核苷酸序列的植物。
[0215] 32.根據(jù)實(shí)施例31所述的方法，其中所述可銷(xiāo)售的性狀選自：疾病抗性、除草劑抗 性、昆蟲(chóng)抗性、碳水化合物代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝、植物發(fā)育、植物生長(zhǎng)調(diào)控、產(chǎn)量改 善、干旱抗性、寒冷抗性、熱抗性和鹽抗性。
[0216] 33. 一種分離的多核苷酸，包含：
[0217] a)包含SEQ ID NO : 19或SEQ ID NO :22的全部或功能片段的核苷酸序列；
[0218] b)包含核苷酸序列（a)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列的核苷酸序列；或，
[0219] c)包含基于BLASTN比對(duì)方法，在與（a)或（b)的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少 90%序列同一性的序列的核苷酸序列；并且，
[0220] 其中所述核苷酸序列是啟動(dòng)子。
[0221] 34.根據(jù)實(shí)施例33所述的分離的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0222] 實(shí)盤(pán)
[0223] 本發(fā)明將在下列實(shí)例中進(jìn)一步限定，其中除非另有說(shuō)明，否則份數(shù)和百分比是以 重量計(jì)并且度數(shù)是攝氏度。除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明中列出的啟動(dòng)子、cDNA、銜接子和引 物的序列全部采取5'至3'方向。分子生物學(xué)中的技術(shù)通常如下列中所述進(jìn)行：Ausubel， F. Μ.等人，于 Current Protocols in Molecular Biology ；John Wiley and Sons ：New York，1990 或 Sambrook，J.等人，于 Molecular Cloning :A Laboratory Manual;第 2版； Cold Spring Harbor Laboratory Press ：Cold Spring Harbor, New York，1989(下文 "Sambrook等人，1989"）。應(yīng)該理解，這些實(shí)例盡管說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但僅是以 例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基 本特征，并且在不脫離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出多種變化和修改以使其 適用于多種用法和條件。因此，除那些本文所示和所述的那些外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的 多種修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附 權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
[0224] 本文闡述的每篇參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容均全文以引用的方式并入本文。
[0225] 實(shí)例 1
[0226] 在小孢子和/或絨氈層中表汰的安全劑誘導(dǎo)的cDNA的鑒宙。
[0227] 用于鑒宙安全劑誘導(dǎo)的cDNA的策略設(shè)計(jì)。
[0228] 不同于安全劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子ZmIN2_2,在植物中具有組織特異性的條件調(diào)控的啟 動(dòng)子的分離（Hershey等人美國(guó)專(zhuān)利5, 364, 780,1994年11月15日），將允許小孢子和/ 或絨氈層中的基因的條件調(diào)控。此前，已證實(shí)雖然在安全劑處理后，ZmIN2-2轉(zhuǎn)錄物表達(dá) 在玉米中的愈傷組織、葉和花藥組織中提高，但通過(guò)該啟動(dòng)子調(diào)控的基因在玉米絨氈層細(xì) 胞中不表達(dá)（Cigan等人2001. Sex. Plant Reprod. 14,135-142)。免疫定位研宄證實(shí)通過(guò) ZmIN2-2調(diào)控的基因存在于除了絨氈層或小孢子之外的所有花藥細(xì)胞類(lèi)型中。迄今為止， 未鑒定響應(yīng)CBSU(氯苯磺酰胺）安全劑并在小孢子發(fā)生的四分體階段在絨氈層細(xì)胞或小 孢子中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。為了允許分離在小孢子或絨氈層中表達(dá)的安全劑誘導(dǎo)的候 選啟動(dòng)子，設(shè)計(jì)利用由植物作出的兩個(gè)基礎(chǔ)觀(guān)察的策略，所述植物用由玉米花藥特異性啟 動(dòng)子 5126(5126 :DAM;Unger 等人，2001，Transgenic Res. 10,409-422)表達(dá)的大腸桿菌 (E. coli)去甲基化酶（DAMethylase)基因轉(zhuǎn)化。首先，來(lái)自表達(dá)5126 :DAM的雄性不育植物 的四分體階段花藥的細(xì)胞學(xué)檢查揭示在其他方面結(jié)構(gòu)正常顯示的花藥中的異常小孢子和 幾乎去除的絨氈層細(xì)胞。其次，從5126 :DAM不育花藥中分離的mRNA的RNA分析指示兩個(gè) 絨氈層特異性轉(zhuǎn)錄物5126和MS45的喪失，而未預(yù)期為絨氈層特異性的轉(zhuǎn)錄物（玉米肌動(dòng) 蛋白）容易地檢測(cè)到（Cigan 等人 2001. Sex. Plant R印rod. 14,135-142)。因此，從 5126 : DAM不育植物中分離的花藥應(yīng)減少或可能完全缺乏絨氈層和/或小孢子特異性mRNA。
[0229] 此外，來(lái)自從野生型雄性能繁殖的CBSU處理的植物中分離的RNA與從雄性不育 CBSU處理的5126 :DAM植物中分離的RNA的ZmIN2-2轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的比較顯示，與MS45和 5126絨氈層特異性mRNA形成對(duì)比，ZmIN2-2在從5126 :DAM CBSU處理的植物中分離的花藥 RNA 中不減少（Cigan 等人 2001. Sex. Plant R印rod. 14,135-142) 〇
[0230] 使用不育植物設(shè)計(jì)了策略，所述不育植物減少或缺乏絨氈層和/或小孢子特異 性mRNA。該策略涉及用CBSU處理玉米植物，并且比較來(lái)自這些處理的對(duì)照植物與處理的 5126 :DAM植物的花藥mRNA轉(zhuǎn)錄物概況。此類(lèi)策略的確導(dǎo)致mRNA的鑒定和分離，并且最終 導(dǎo)致如下所述響應(yīng)安全劑并且是小孢子或絨氈層表達(dá)的啟動(dòng)子的鑒定和分離。
[0231] 為此，差異RNA雜交用于富集通過(guò)安全劑或熱處理提高的玉米花藥或愈傷組織 mRNA。隨后，這些mRNA用作探針以從由CBSU處理的玉米植物制備的花藥cDNA文庫(kù)中分離 cDNA。這些cDNA隨后用于篩選從雄性能繁殖的和雄性不育的5126 :DAM對(duì)照和安全劑處理 的植物中分離的mRNA，作為如下所述鑒定通過(guò)CBSU或熱處理誘導(dǎo)或和在絨氈層或小孢子 中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的方法。
[0232] 來(lái)自CBSU處理的野牛塑棺物的玉米花藥cDNA f庫(kù)構(gòu)律和安全劑誘導(dǎo)的cDNA的 分離。
[0233] 野生型玉米植物生長(zhǎng)至小孢子發(fā)育的減數(shù)分裂階段。植物用30mg 2-CBSU進(jìn)行 澆水并允許發(fā)育至小孢子發(fā)育的四分孢子和早期空泡階段。聚A+花藥RNA從野生型對(duì)照 和CBSU處理的植物中分離并貯存。由從CBSU處理的植物中分離的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)， 排列在尼龍濾網(wǎng)上并貯存。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，使用Clontech PCR-選擇cDNA消減試 劑盒（#K1804-1)生成cDNA消減文庫(kù)，以富集CBSU特異性轉(zhuǎn)錄物。使用該方法，來(lái)自野生 型植物的花藥聚A+mRNA用于富集在來(lái)自CBSU處理的植物的花藥聚A+mRNA中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄 物。將該cDNA消減文庫(kù)亞克隆到pSPORT (BRL)載體內(nèi)，將集落鋪平板，挑選并測(cè)序。在測(cè)序 的載體插入片段中，兩種DNA序列以高比例存在，超過(guò)測(cè)序的插入片段的10%，并且被稱(chēng)為 ZmCASlc-l(477bp ;SEQ ID NO :1)和ZmCASlc-2(438bp ;SEQ ID NO :2) (￡BSU_S花藥消減 1)。 ZmCASlc-I和ZmCASlc-2兩者均與來(lái)自植物的甘露醇脫氫酶具有序列同一性。ZmCASlc-I 和ZmCASlc-2 DNA片段用作雜交探針，以篩選濾網(wǎng)排列的上述cDNA CBSU-花藥文庫(kù)，以分 離含有全長(zhǎng)cDNA的雜交克隆。ZmCASlc-I和ZmCASlc-2兩者均鑒定相同的cDNA克隆。一 個(gè)cDNA克隆含有1354bp SalI-NotI插入片段（SEQ ID NO :3)，所述SalI-NotI插入片段 進(jìn)行測(cè)序并鑒定為 1338bp 全長(zhǎng) cDNA 克隆，稱(chēng)為 ZmCASlcDNA (SEQ ID NO :4)。ZmCASlcDNA 能夠編碼354氨基酸序列（SEQ ID NO :5)，與玉米甘露醇脫氫酶（GI編號(hào)226528549， ΝΡ_001147757· 1，SEQ ID NO :6 ;圖 1)具有 99. 7% 同一性。
[0234] 為了測(cè)定ZmCASlcDNA是否1)通過(guò)CBSU處理在玉米花藥中被誘導(dǎo)，和2)在來(lái)自 CBSU處理的5126 :DAM植物中的絨氈層和小孢子去除的玉米花藥中減少或不存在，將477bp ZmCASlc-IDNA 片段（SEQ ID NO :1)以及來(lái)自 ZmMS45、Zm5126、ZmActin 和 ZmUbiquitin 的 DNA片段（Cigan等人2001. Sex. Plant R印rod. 14,135-142)用作針對(duì)從雄性能繁殖的（F) 和雄性不育（S)、對(duì)照（-)或CBSU處理的（+)植物中分離的玉米花藥mRNA的雜交探針。如 圖2所示，組成性表達(dá)的玉米肌動(dòng)蛋白（ACTIN)和泛素（UBI)轉(zhuǎn)錄物容易地檢測(cè)到，并且 跨越所有花藥RNA樣品和處理不改變其穩(wěn)態(tài)水平。MS45和5126轉(zhuǎn)錄物在來(lái)自雄性能繁殖 的植物的花藥RNA中容易地檢測(cè)到，但在來(lái)自雄性不育植物的花藥RNA中不存在（圖2)， 進(jìn)一步支持這些RNA局限于玉米絨毯層的觀(guān)察（Cigan等人2001. Sex. Plant Reprod. 14， 135-142)。
[0235] 來(lái)自對(duì)照雄性能繁殖的（_，F(xiàn))和對(duì)照不育植物（_，S)的花藥RNA不揭示可檢測(cè)水 平的IN2-2轉(zhuǎn)錄物，而強(qiáng)雜交信號(hào)在來(lái)自衍生自CBSU處理的對(duì)照雄性能繁殖的和雄性不育 植物的花藥的mRNA中檢測(cè)到（圖2)。相比之下，關(guān)于ZmCASl的強(qiáng)雜交信號(hào)僅在來(lái)自衍生 自雄性能繁殖的CBSU處理的植物（+，F(xiàn))的花藥的mRNA中揭示。在來(lái)自雄性不育的CBSU 處理的植物（+，S)的花藥的mRNA中觀(guān)察到的減少的ZmCASl信號(hào)指示該ZmCASl轉(zhuǎn)錄物存 在于花藥的細(xì)胞層中。該觀(guān)察指示ZmCASl組織特異性表達(dá)不同于IN2-2表達(dá)，并且因此使 得ZmCASl啟動(dòng)子成為不同于在花藥中以空間表達(dá)的IN2-2啟動(dòng)子的候選物。
[0236] 當(dāng)ZmCASl探針用于與由CBSU處理的玉米愈傷組織或玉米葉雜交時(shí)，強(qiáng)雜交在來(lái) 自愈傷組織、葉和花藥的mRNA中觀(guān)察到（圖3)，類(lèi)似于IN2-2探針，提示除在花藥中的表達(dá) 夕卜，ZmCASl轉(zhuǎn)錄物也響應(yīng)安全劑CBSU處理在愈傷組織和葉中表達(dá)。
[0237] I. 7kb和截短的I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子片段的分離
[0238] 為了分離對(duì)應(yīng)于ZmCASl啟動(dòng)子的DNA序列，使用477bp ZmCASlc-IDNA片段（SEQ ID NO :1)作為雜交探針，篩選來(lái)自玉米品系B73的亞基因組SauIIIA基因組噬菌體文庫(kù)。 分離含有4069bp玉米B73DNA片段（SEQ ID NO :7)并與ZmCASlc-I探針雜交的噬菌體，切 除質(zhì)粒并測(cè)序。該4069bp基因組DNA的DNA序列分析鑒定了與ZmCASlC cDNA具有序列同 一性的幾個(gè)區(qū)域。對(duì)于啟動(dòng)子研宄，寡核苷酸指導(dǎo)的誘變用于在SEQ ID NO :7中的核苷酸 位置3447-3452處導(dǎo)入Real DNA限制位點(diǎn)，根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)，使用MORPH位點(diǎn)特異性質(zhì)粒 DNA誘變?cè)噭┖?引物-3引物（Boulder，CO)，使用寡核苷酸5' -GCAGTTCATTCCTCATGACTG CTGCAGCAGAGC-3'（SEQ ID NO :8)。分離包含 SEQ ID NO :9 的截短的 I. Okb 玉米 ZmCASl 啟 動(dòng)子的 HindIII-RcaI 片段（ZmCASlHindIII Pro, SEQ ID NO : 15)和包含 SEQ ID NO : 10 的 I. 7kb 玉米 ZmCASl 啟動(dòng)子的 BamHI-RcaI (ZmCASIBamPro, SEQ ID NO :16)片段，并用于植物 中的啟動(dòng)子研宄。
[0239] 如圖4、實(shí)例2和本文描述的其他實(shí)例所示，I. 7kb ZmCASl啟動(dòng)子（SEQ ID NO :10) 和截短的l.Okb ZmCASl啟動(dòng)子（SEQ ID NO :9)在植物細(xì)胞中是活性的，并且通過(guò)安全劑 (CBSU，圖4A、4B)和/或熱處理（圖4B)兩者誘導(dǎo)。
[0240] 實(shí)例 2
[0241] 當(dāng)GUS和ZmMS45詈于ZmCASl啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄棹制下時(shí)，晌應(yīng)安全劑CBSU或熱處理， 在玉米細(xì)朐和棺物中觀(guān)察到這@基閔的提高表汰。
[0242] 土壤桿菌屬介導(dǎo)的未成熟胚芽的轉(zhuǎn)化用于生成下列的整合拷貝：包含LOkb ZmCASl 啟動(dòng)子（SEQ ID NO:9)的 PHP16974(SEQ ID NO:ll;ZmCASlHindIII Pro: ⑶S/35SPAT)，包含 L7kb ZmCASl 啟動(dòng)子（SEQ ID N0:10)的 PHP16975(SEQ ID N0:12， ZmCASlBamPro :⑶S/35SPAT)，以及包含 I. Okb ZmCASl 啟動(dòng)子的 PHP16972 (SEQ ID NO : 13， ZmCASlHindIII Pro :MS45/35SPAT)或包含 I. 7kb ZmCASl 啟動(dòng)子的 PHP16973 (SEQ ID NO : 14, ZmCASlBamPro ：MS45/35SPAT ：)〇
[0243] 如實(shí)例I和圖3所示，除在花藥中的表達(dá)外，ZmCASl轉(zhuǎn)錄物也響應(yīng)安全劑CBSU處 理在愈傷組織和葉組織中表達(dá)。選擇雙丙氨磷抗性愈傷組織事件用于分析和植物再生。
[0244] 為了測(cè)定來(lái)自玉米的I. 7kb或I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子是否能夠指導(dǎo)⑶S報(bào)道基因 的誘導(dǎo)表達(dá)，在室溫下將三個(gè)雙丙氨磷抗性愈傷組織事件置于維持培養(yǎng)基和含有提高量的 安全劑CBSU-2的維持培養(yǎng)基上共18小時(shí)，取出并用X-Gluc染色以檢測(cè)⑶S活性。如圖 4A所示，輕微⑶S表達(dá)在維持培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織中檢測(cè)到（圖4A :C)。相比之下，低 水平的⑶S表達(dá)在10mg/l CBSU上生長(zhǎng)的愈傷組織中檢測(cè)到（圖4A : 10)，而強(qiáng)⑶S表達(dá)在 100mg/l CBSU上生長(zhǎng)的PHP16975愈傷組織事件中觀(guān)察到（圖4A :100)。該數(shù)據(jù)指示I. 7kb ZmCASl啟動(dòng)子在玉米愈傷組織中是活性的，并且可通過(guò)安全劑處理進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0245] 當(dāng)在室溫下在IOOmg/升CBSU的存在下溫育時(shí)，含有PHP16974 (其含有驅(qū)動(dòng)⑶S報(bào) 道基因的ZmCASl啟動(dòng)子的截短的I. Okb片段）的七個(gè)隨機(jī)雙丙氨磷抗性愈傷組織事件能 夠誘導(dǎo)⑶S表達(dá)（圖4B ;26C+CBSU)。在分離的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)這7個(gè)愈傷組織事件在不含CBSU 的維持培養(yǎng)基上生長(zhǎng)但在37°C下溫育2天，回到室溫并且隨后用X-gluc染色時(shí)，也觀(guān)察到 提高的⑶S表達(dá)（圖4B ;37C)。該數(shù)據(jù)指示截短的I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子在玉米愈傷組織 中是活性的，并且可通過(guò)安全劑和/或熱處理進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0246] 植物還由含有PHP16975得愈傷組織事件再生，并在溫室中生長(zhǎng)至大約5葉期。在 該發(fā)育階段，在用30mg 2-CBSU澆水前（C)和澆水后（S)收集圖5所示來(lái)自由3個(gè)雙丙氨 磷抗性事件再生的植物的葉穿孔，以檢查響應(yīng)安全劑的施加在葉中的GUS表達(dá)。如圖5所 示，跨越分析的3個(gè)PHP16975轉(zhuǎn)化的植物，在用CBSU澆水后（S) 2天的葉穿孔中檢測(cè)到強(qiáng) ⑶S表達(dá)。）。該數(shù)據(jù)還指示1.7kb ZmCASl啟動(dòng)子在玉米葉中是活性的，并且可通過(guò)安全劑 進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0247] T-DNA 載體 PHP16972(SEQ ID NO : 13, ZmCASlHindIII Pro :MS45/35S :PAT)和 PHP16973 (SEQ ID NO : 14, ZmCASlBamPro :MS45/35S :PAT)用于轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織，所述玉 米愈傷組織生成為含有MS45/ms45雜合和mS45/ms45純合突變型植物的分離群體。為了檢 測(cè)在玉米花藥中在1. 0或I. 7kb ZmCAS啟動(dòng)子的控制下的MS45RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)，含有在 玉米MS45基因中的天然存在的突變的植物用于這些研宄，所述突變導(dǎo)致MS45RNA和蛋白質(zhì) 的喪失。來(lái)自MS45/ms45植物的花粉用于給雄性不育ms45/ms45植物授精，用于生成將為 如Cigan等人2001中所述的ms45/ms45的胚芽。通過(guò)將玉米MS45基因置于這些轉(zhuǎn)化載體 中的ZmCASl啟動(dòng)子的控制下，除GUS外的基因可測(cè)試在愈傷組織、葉和玉米花藥中響應(yīng)安 全劑的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，如先前已對(duì)于ZmIn2-2 :MS45調(diào)控的表達(dá)證實(shí)的（Cigan等人2001. Sex. Plant R印rod. 14,135-142)。在室溫下將含有整合的PHP16972拷貝的五個(gè)隨機(jī)雙丙氨磷 抗性事件置于維持培養(yǎng)基（圖5,（-))和含有IOOmg/升安全劑CBSU-2的維持培養(yǎng)基（圖 5 (+))上共18小時(shí)，取出并且如所述的制備聚A+RNA并用于RNA分析（Cigan等人2001. Sex. Plant Reprod. 14,135-142)，使用ZmMS45和ZmActin探針用于雜交分析。如圖6所示， 對(duì)應(yīng)于MS45mRNA的雜交信號(hào)的強(qiáng)誘導(dǎo)在來(lái)自在CBSU(+)上生長(zhǎng)的ms45/ms45愈傷組織的 RNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)檢測(cè)到。當(dāng)愈傷組織在不存在CBSU的情況下生長(zhǎng)時(shí)，觀(guān)察到極低信號(hào)。肌動(dòng) 蛋白用作對(duì)照探針以顯示在所有樣品中存在幾乎相等的RNA水平。多重植物由用PHP16973 轉(zhuǎn)化的m S45/ms45愈傷組織事件再生并在溫室中生長(zhǎng)。植物在小孢子發(fā)育的減數(shù)分裂階段 用30mgCBSU澆水。2天后由對(duì)照和CBSU處理的植物收集葉和花藥（四分體，早期單核小孢 子階段），并且如所述的（Cigan等人2001)，由4個(gè)葉穿孔或6個(gè)花藥制備全細(xì)胞蛋白質(zhì)提 取物。葉和花藥蛋白質(zhì)在10% SDS變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至支持硝酸纖維 素，并且用于使用針對(duì)玉米MS45蛋白質(zhì)的抗體的蛋白質(zhì)分析。來(lái)自PHP16973對(duì)照（C)和處 理的（+)植物的葉提取物的檢查（圖7)證實(shí)在衍生自CBSU處理的植物的葉提取物中提高 的MS45蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)水平（泳道3、5、7、9)。提高的MS45蛋白質(zhì)也在衍生自PHP16973CBSU 處理的植物花藥的提取物（圖8)中檢測(cè)到（泳道2、4、7)。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持當(dāng)通過(guò)安全 劑進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，ZmCASl啟動(dòng)子在玉米細(xì)胞例如花藥、愈傷組織和葉中是活性的。
[0248] 本文描述的GUS和MS45結(jié)果合在一起支持當(dāng)置于玉米細(xì)胞和植物中的I. 7kb或 I. OKb ZmCASl啟動(dòng)子的控制下時(shí)，該基因可被轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，并且轉(zhuǎn)錄可響應(yīng)安全劑CBSU和或 熱處理店施加在愈傷組織、葉和花藥中提高。
[0249] 實(shí)例 3
[0250] 用包含驅(qū)動(dòng)GUS表汰的截短的I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子的PHP16974轉(zhuǎn)化的稻棺物的 熱處理導(dǎo)致在發(fā)芽幼苗中的GUS表汰。
[0251] 為了測(cè)定ZmCASl啟動(dòng)子是否可在除玉米以外的植物物種中響應(yīng)安全劑處理或熱 處理而條件調(diào)控表達(dá)，土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用于生成包含截短的I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子的 PHP16974(ZmCASlHindIII Pro:⑶S)的整合拷貝，用于在稻中的研宄。來(lái)自10-14日齡的 發(fā)芽種子（水稻cv. Kitaake)的盾片用于稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（Toki 1997，P1 Mol. Biol Reporter 15 :16-21)。選擇含有PHP16974的雙丙氨磷抗性愈傷組織事件，并就其響應(yīng)安全劑施加的 能力進(jìn)行篩選。四個(gè)獨(dú)立的雙丙氨磷抗性事件在維持培養(yǎng)基或含有IOOmg/升CBSU的維持 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)24小時(shí)，取出并用X-Gluc染色。如圖9所示，當(dāng)在含有CBSU安全劑的培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)時(shí)，在PHP16974愈傷組織事件中觀(guān)察到強(qiáng)⑶S表達(dá)（圖9)。使PHP16974雙丙氨磷抗 性事件再生成植物。葉組織由這些植物收集并用于DNA雜交分析，以鑒定單拷貝PHP16974 插入片段。這些植物允許設(shè)置自交種子并用于后續(xù)研宄，以監(jiān)控在ZmCASl啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控 制下的⑶S表達(dá)。使選自2個(gè)單拷貝PHP16974事件的十六粒種子滅菌，在無(wú)激素培養(yǎng)基上 在28°C或37°C下生長(zhǎng)48小時(shí)，并允許發(fā)芽。發(fā)芽的種子隨后在28C下溫育另外2天，并且 用X-Gluc組織化學(xué)染色，以檢測(cè)⑶S活性（參考）。如圖IOA和IOC所示，在28°C下發(fā)芽 的幼苗顯示出極低水平的可檢測(cè)的Gus染色。相比之下，在37°C下發(fā)芽的稻幼苗顯示在根 以及枝基部處顯著的藍(lán)色染色（圖IOB和10D)。這些結(jié)果與玉米中的觀(guān)察一致。即，當(dāng)⑶S 基因通過(guò)I. Okb ZmCASl啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控時(shí)，在37C下的溫育導(dǎo)致即使在不存在安全劑處理 的情況下提尚的Gus活性。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的多核苷酸，包含： a) 包含SEQ ID NO :9或SEQ ID NO: 10中所示的序列的核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)序 列； b) 包含SEQ ID NO : 10的功能片段的核苷酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)序列； c) 包含基于BLASTN比對(duì)方法，在與（a)或（b)的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少85 % 序列同一性的序列的核苷酸序列； d) 在65°C下0. 1SSC、0. 1% (w/v)SDS洗滌的高度嚴(yán)格條件下與SEQID NO :9雜交的核 苷酸序列； e) 包含甘露醇脫氫酶的1.7kb 5'非編碼序列的全部或片段的核苷酸序列；或， f) 通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替換、添加和/或缺失而獲得的（a)、（b)、（c)、（d)或（e) 中指示的核苷酸序列之一的衍生物；并且， 其中所述核苷酸序列是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中基于BLASTN比對(duì)方法，c)的核苷酸序 列在與SEQ ID NO :1中所示的序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少90%同一性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中基于BLASTN比對(duì)方法，c)的核苷酸序 列在與SEQ ID NO :1中所示的序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少95%同一性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中基于BLASTN比對(duì)方法，c)的核苷酸序 列在與SEQ ID NO :1中所示的序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少98%同一性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過(guò)化學(xué)品或脅迫 處理進(jìn)行誘導(dǎo)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通過(guò)安全劑或熱處 理進(jìn)行誘導(dǎo)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中所述安全劑是N-(氨基羰基）-2-氯苯 磺酰胺。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中所述熱處理包括大于26°C的溫度。
9. 一種重組DNA構(gòu)建體，包含可操作地連接至少一種異源核酸序列的權(quán)利要求1所述 的分離的多核苷酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述異源核酸序列編碼選自下列的 基因：雙鏈斷裂誘導(dǎo)基因、重組酶基因、報(bào)道基因、選擇標(biāo)記、疾病抗性賦予基因、除草劑抗 性賦予基因、昆蟲(chóng)抗性賦予基因；涉及碳水化合物代謝的基因、涉及脂肪酸代謝的基因、涉 及氨基酸代謝的基因、涉及植物發(fā)育的基因、涉及植物生長(zhǎng)調(diào)控的基因、涉及產(chǎn)量改善的基 因、涉及干旱抗性的基因、涉及寒冷抗性的基因、涉及植物中的熱和鹽抗性的基因。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體，其中所述異源核酸序列編碼選自下列的 蛋白質(zhì)：雙鏈斷裂誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、重組酶蛋白質(zhì)、報(bào)道蛋白質(zhì)、選擇標(biāo)記、賦予疾病抗性的蛋白 質(zhì)、賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)、賦予昆蟲(chóng)抗性的蛋白質(zhì)；涉及碳水化合物代謝的蛋白質(zhì)、涉 及脂肪酸代謝的蛋白質(zhì)、涉及氨基酸代謝的蛋白質(zhì)、涉及植物發(fā)育的蛋白質(zhì)、涉及植物生長(zhǎng) 調(diào)控的蛋白質(zhì)、涉及產(chǎn)量改善的蛋白質(zhì)、涉及干旱抗性的蛋白質(zhì)、涉及寒冷抗性的蛋白質(zhì)、 涉及植物中的熱抗性和鹽抗性的蛋白質(zhì)。
12. -種載體，包含權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體。
13. -種細(xì)胞，包含權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞具有穩(wěn)定摻入其基因組內(nèi)的權(quán)利 要求9所述的重組DNA構(gòu)建體。
16. -種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有穩(wěn)定摻入其基因組內(nèi)的權(quán)利要求9所述的 重組DNA構(gòu)建體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述單子葉植物選自：玉米、小麥、稻、大 麥、高粱、粟、甘蔗和黑麥。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是雙子葉植物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述雙子葉植物選自：大豆、蕓苔屬物 種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵。
21. 由權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。
22. -種用重組表達(dá)構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，包含植物啟動(dòng)子和可操作地連接至所述 啟動(dòng)子的異源核酸片段，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子且能夠控制所述異源核酸片段在 植物細(xì)胞中的表達(dá)，并且進(jìn)一步地，其中所述啟動(dòng)子包含SEQ ID NO : 10的片段。
23. -種在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼序列或功能RNA的方法，包括： a) 將權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)，其中所述至少一種異源序列 包含編碼序列或功能RNA ; b) 使步驟a)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)； c) 通過(guò)對(duì)b)的植物細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及， d) 選擇展示所述重組DNA構(gòu)建體的編碼序列或功能RNA表達(dá)的植物細(xì)胞。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述化學(xué)品是安全劑。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述脅迫處理是熱處理。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，還包括使d)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)成植物。
27. -種在花藥細(xì)胞中表達(dá)編碼序列或功能RNA的方法，所述方法包括： a) 將權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)，其中所述至少一種異源序列 包含編碼序列或功能RNA ; b) 使步驟a)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)； c) 通過(guò)對(duì)b)的植物細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及， d) 鑒定展示所述重組DNA構(gòu)建體的編碼序列或功能RNA表達(dá)的花藥細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求27所述的方法，其中所述至少一種異源序列是瞬時(shí)表 達(dá)的。
29. 根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求27所述的方法，其中所述至少一種異源序列穩(wěn)定摻入 所述植物細(xì)胞中。
30. -種用于改變植物中至少一種異源核酸片段的表達(dá)的方法，包括： (a) 用權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； (b) 通過(guò)對(duì)（a)的細(xì)胞的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子； (c) 由步驟（a)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生長(zhǎng)能繁殖的成熟植物；以及， (d)選擇含有所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物，其中所述異源核酸片段的表達(dá)是提高的或 降低的。
31. -種轉(zhuǎn)基因改變可銷(xiāo)售的植物性狀的方法，包括： a) 將權(quán)利要求9所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物內(nèi)； b) 通過(guò)對(duì)（a)的植物的化學(xué)品或脅迫處理來(lái)誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子； c) 使得自步驟b)的能繁殖的、成熟植物生長(zhǎng)；以及 d) 基于所述改變的可銷(xiāo)售的性狀，選擇在至少一種植物組織中表達(dá)所述至少一種異源 核苷酸序列的植物。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述可銷(xiāo)售的性狀選自：疾病抗性、除草劑抗 性、昆蟲(chóng)抗性、碳水化合物代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝、植物發(fā)育、植物生長(zhǎng)調(diào)控、產(chǎn)量改 善、干旱抗性、寒冷抗性、熱抗性和鹽抗性。
33. -種分離的多核苷酸，包含： a) 包含SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :22的全部或功能片段的核苷酸序列； b) 包含所述核苷酸序列（a)的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列的核苷酸序列；或， c) 包含基于BLASTN比對(duì)方法，在與（a)或（b)的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少90 % 序列同一性的序列的核苷酸序列；并且，其中所述核苷酸序列是啟動(dòng)子。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104487577SQ201380025943
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月18日
【發(fā)明者】M. 西甘 A., 恩格-華萊士 E. 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司