專(zhuān)利名稱(chēng)：：調(diào)控植物中基因表達(dá)的核酸啟動(dòng)子序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及在植物中調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸啟動(dòng)子序列。
背景技術(shù)：
：谷粒胚乳(cerealgrainendosperm)是人類(lèi)飲食中糖類(lèi)(carbohydrate)的唯一主要來(lái)源。因此對(duì)胚乳的遺傳修飾為進(jìn)一步增加谷類(lèi)作物及相關(guān)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和/或經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了潛在的機(jī)遇(Lamacchia等.2001;Shewry和Jones2005)。一個(gè)具體的研究途徑聚焦于處理谷類(lèi)種子以產(chǎn)生藥用蛋白，例如人蛋白質(zhì)和抗體替代物。在下游從種子提取藥用蛋白相較于從其它植物組織也相對(duì)更加直接，存在的潛在可能干擾這種方法的無(wú)關(guān)化合物(extraneous)較少。小麥?zhǔn)且俗⒛康挠糜陂_(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的作物，原因在于它比玉米和稻更低廉的生產(chǎn)成本。盡管已經(jīng)在小麥胚乳中高水平產(chǎn)生了一些重組蛋白(由St6ger等.2005綜述)，尚未實(shí)現(xiàn)抗體和其它藥用或工業(yè)蛋白質(zhì)的成功產(chǎn)生。這歸因于可用的具有適當(dāng)基因表達(dá)水平和特異性的啟動(dòng)子序列有限。在這點(diǎn)上，啟動(dòng)子通常跨越物種界限以相似的方式發(fā)揮功能，然而對(duì)于谷類(lèi)胚乳似乎并非如此，其在物種之間有著顯著的差異(Drea等.2005)。
發(fā)明內(nèi)容盡管小麥種子作為重組蛋白表達(dá)體系具有巨大潛力，但是目前僅表征了非常有限數(shù)目的啟動(dòng)子用于這個(gè)目的。本發(fā)明概括地涉及來(lái)自谷類(lèi)種子的分離的核酸序列，所述核酸序列可用于在谷類(lèi)種子的特定組織內(nèi)調(diào)控高水平的基因表達(dá)。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸包含對(duì)應(yīng)于基因的啟動(dòng)子活性區(qū)(promoter-activeregion)的核苷酸序列，所述基因包含編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列。5在一種實(shí)施方案中，啟動(dòng)子活性區(qū)包含SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列，或它的變體。優(yōu)選地，所述變體與SEQIDNO:1中所示的核苦酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%,和更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。優(yōu)選地，可轉(zhuǎn)錄的DNA序列獲得自種子。更優(yōu)選地，所述種子源自谷類(lèi)(cerea)，例如，^f旦不限于，小麥(wheat)。甚至更優(yōu)選地，所述谷類(lèi)是小麥?？赊D(zhuǎn)錄DNA序列的轉(zhuǎn)錄可以是組成型的，或者是組織特異性的。有利的是，所述可轉(zhuǎn)錄DNA序列選自下組SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27中所示核苷酸序列。優(yōu)選地，所述可轉(zhuǎn)錄DNA序列在谷類(lèi)胚乳中高轉(zhuǎn)錄。更優(yōu)選地，所述可轉(zhuǎn)錄DNA序列在小麥胚乳中高轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還可輕易預(yù)見(jiàn)到這樣的核苷S吏序列，該序列對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子活性區(qū)的啟動(dòng)子活性片段。就調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄而言，啟動(dòng)子活性片段可以包括許多調(diào)控元件，例如，但不限于，TATA框、INR元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子活性片段包含至少一個(gè)選自表l中所列的元件。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸包含SEQIDNO:l中所列核苷酸序列，或它的變體。在一種實(shí)施方案中，第二個(gè)方面的變體核酸包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;S即DNO:7;SEQIDNO:8;SEQIDNO:9;SEQIDNO:10;SEQIDNO:ll;S即DNO:12;SEQIDNO:13;SEQIDNO:14;和SEQIDNO:15。在另一種實(shí)施方案中，所述變體與SEQIDNO:l中所示的分離的核酸具有至少(at)50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%,和更優(yōu)選地至少95。/。、96%、97%、98%或99%序列同一性。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的基因，所述基因包含與編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列可操作地連接的第一個(gè)方面的核苷酸序列或第二個(gè)方面的核苦酸序列。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供嵌合基因，所述嵌合基因包含與異源核酸可操作地連接的第一個(gè)方面的分離的核酸或第二個(gè)方面的分離的核酸。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供遺傳構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含選自下組的分離的核酸以及一個(gè)或多個(gè)其它核苷酸序列第一個(gè)方面的分離的核酸；第二個(gè)方面的分離的核酸；編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列；和第四個(gè)方面的嵌合基因。有利的是，所述一個(gè)或多個(gè)其它核苷酸序列包括但不限于元件，所述元件諸如轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)子、用于在原核生物中自主復(fù)制的序列、用于mRNA加工的調(diào)節(jié)元件、選擇性標(biāo)記和可篩選的標(biāo)記。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述遺傳構(gòu)建體是表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含選自下組的分離的核酸第一個(gè)方面的分離的核酸；和第二個(gè)方面的分離的核酸。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述遺傳構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包含第三個(gè)方面的分離的基因或第四個(gè)方面的嵌合基因。所述表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步的特征可以在于所述分離的核酸能夠優(yōu)先指導(dǎo)在小麥胚乳中的轉(zhuǎn)錄。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供用第五個(gè)發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。合適的情況下，宿主細(xì)胞源自植物，如谷類(lèi)。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞源自至少包含胚乳的谷類(lèi)。更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞源自小麥。在第七個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生重組蛋白的方法，包括以下步驟向植物宿主細(xì)胞或組織導(dǎo)入能夠產(chǎn)生所述重組蛋白的第五個(gè)方面的遺傳構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述植物是谷類(lèi)，例如，但不限于，小麥。在第八個(gè)方面，本發(fā)明提供促進(jìn)表達(dá)靶向于植物胚乳的方法，包括以下步驟在植物胚乳中表達(dá)第四個(gè)方面的嵌合基因。優(yōu)選地，所述植物是谷類(lèi)，例如，但不限于，小麥。更優(yōu)選地，所述谷類(lèi)是小麥。在第九個(gè)方面，本發(fā)明提供經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，所述植物包含第一或第二個(gè)方面的分離的核酸。植物包含它的任何分類(lèi)學(xué)分組，包括被子植物(angiosperms)、棵子植物(gymnosperms)、單子葉才直物(monocotyledons)和雙子葉才直物(dicotyledons)。優(yōu)選的植物是單子葉植物，諸如谷類(lèi)、甘蔗(sugarcane)、香蔑(banana)和菠蘿(pineapple),-f旦不P艮于這些。更優(yōu)選地，所述植物是谷類(lèi)。甚至更優(yōu)選地，所述谷類(lèi)是小麥。優(yōu)選地，所述改變的表型因異源核酸的表達(dá)產(chǎn)生。本發(fā)明還提供源自本發(fā)明的經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物的細(xì)胞、組織、葉、果實(shí)、花、種子和其它繁殖材料、用于無(wú)性繁殖的材料(materialusedforvegetativepropagation),包括Fl雜合體在內(nèi)的子代植物、雄性不育植物和全部其它植物和一直物產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述植物產(chǎn)品是種子。更優(yōu)選地，所述種子是谷類(lèi)的產(chǎn)品，所述谷類(lèi)例如，但不限于，小麥。甚至更優(yōu)選地，所述谷類(lèi)是小麥。在第十個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的多肽，該多肽包含SEQIDNO:28中所示的氨基酸序列。在第十一個(gè)方面，本發(fā)明提供與第十個(gè)方面的分離的多肽或它的片段結(jié)合的抗體或其片段。在本說(shuō)明書(shū)全文中，除非上下文另有需要，應(yīng)將詞語(yǔ)"包含"理解為表示包括規(guī)定的整數(shù)或整數(shù)的組，但是不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)的組。附圖簡(jiǎn)述為了使本發(fā)明易于理解和進(jìn)行實(shí)施，現(xiàn)將參考附圖通過(guò)舉例的方式來(lái)描述優(yōu)選的實(shí)施方案，其中同樣的參考編號(hào)指相同的部分，并且其中圖1:在全部小麥(栽培種(cv.)Banks)LongSAGE文庫(kù)中TagA的相對(duì)豐度。所有文庫(kù)均構(gòu)建自完整種子，只有14*構(gòu)建自果皮組織。圖2:基因組步查(genome-walking)PCR產(chǎn)物的凝膠純化。左側(cè)泳道的標(biāo)記物(SM)指明了條帶大小。第一和第二輪PCR產(chǎn)物分別呈現(xiàn)在泳道1-4和5-8。每一輪的陰性對(duì)照以短橫線(xiàn)(-)標(biāo)記。含有正確啟動(dòng)子序列的條帶以箭頭標(biāo)出。圖3:匹配TagA的14dpa發(fā)育中小麥種子EST和Unigene簇Ta.2025EST序列(gnllUGI)的比對(duì)。與第一個(gè)序列相同的堿基位置用點(diǎn)(.)表示，用短橫線(xiàn)(-)標(biāo)出序列缺口。對(duì)應(yīng)于TagA的longSAGE標(biāo)記序歹'J(TAG)和用于基因組步查的引物序列(PROM1—1A，PROM1—1B)用方框框出(boxed)。推定的編碼區(qū)為粗體字，兩側(cè)的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)以下劃線(xiàn)標(biāo)記。序列可如下鑒別TaBaD14EST-le—G06(SEQIDNO:16)、TaBaD14EST-lf—G05(SEQIDNO:17)、TaBaD14EST-l-M—C05(SEQIDNO:18)、TaBaD14EST-ld_F06(SEQIDNO:19)、TaBaD14EST-lf_C02(SEQIDNO:20)、TaBaD14EST-lB_E10(SEQIDNO:21)、TaBaD14ESTlg一B06(SEQIDNO:22)、TaBaD14EST-ld—E03(SEQIDNO:23)、TaBaD14EST-ld—D02(SEQIDNO:24)、TaBaD14EST-l-M—G02(SEQIDNO:25)、TaBaD14EST-lf—F02(SEQIDNO:26)和TaBaD14EST-lf—F03(SEQIDNO:27)。圖4:啟動(dòng)子序列與共有序列的比對(duì)。與共有序列相同的堿基位置用點(diǎn)(.)表示，用短橫線(xiàn)(-)標(biāo)出缺口。與EST序列相同的區(qū)域用突出(highlighted)顯示。序列可以如下鑒另'J:共有序列(SEQIDNO:l)、Proml_2—17(SEQIDNO:2)、Proml—26(SEQIDNO:3)、Proml—2一3(SEQIDNO:4)、P畫(huà)1—2—13(SEQIDNO:5)、Proml—2—18(SEQIDNO:6)、Proml—2—7(SEQIDNO:7)、Proml—2—15(SEQIDNO:8)、Proml_216(SEQIDNO:9)、Proml_2—21(SEQIDNO:10)、Proml—2—19(SEQIDNO:11)、Proml—2—20(SEQIDNO:12)、P讓l—2一24(SEQIDNO:13)、Proml_2—14(SEQIDNO:14)、Proml—2—10(SEQIDNO:15)。來(lái)自栽培種Banks基因組DNA的相應(yīng)啟動(dòng)子序列說(shuō)明，所述序列與BobWhite序列(SEQIDNO:l)在SEQIDNO:1的位置100-1354(SEQIDNO:29)相同。圖5:與TagA匹配的EST的推定氨基酸序列翻譯(SEQIDNO:28)，包括選擇的PredictProtein基序和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)細(xì)節(jié)。發(fā)明詳述被認(rèn)定為屬于本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)和序列為在谷類(lèi)植物中，特別是在'J、麥中開(kāi)發(fā)重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)提供了新的、有益的手段。這些啟動(dòng)子對(duì)這種目的的適合性歸因于它們能夠指導(dǎo)在發(fā)育中的小麥種子胚乳中的高水平轉(zhuǎn)錄。作為用于過(guò)表達(dá)重組蛋白的區(qū)室，谷類(lèi)胚乳是理想的候選者，因?yàn)楣阮?lèi)胚乳是9貯存蛋白積累的天然部位，并為重組蛋白合成提供了穩(wěn)定的環(huán)境。DNA通過(guò)DNA依賴(lài)性RNA聚合酶轉(zhuǎn)化為RNA是一個(gè)高度復(fù)雜且受到嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程，這是因?yàn)樾枰_保數(shù)以千計(jì)的基因在時(shí)間和空間上進(jìn)行正確的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的位置通常與可轉(zhuǎn)錄DNA序列相鄰和/或在其上游，并為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和進(jìn)一步的基因表達(dá)事件提供指導(dǎo)方針(roadmap)。能夠指導(dǎo)精確的轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子區(qū)代表了初級(jí)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。因此在一個(gè)寬泛的方面，本發(fā)明提供分離的核酸，該核酸包含對(duì)應(yīng)于分離的啟動(dòng)子活性區(qū)的核苷酸序列，所述啟動(dòng)子活性區(qū)與可轉(zhuǎn)錄DNA序列的起點(diǎn)相鄰。在一個(gè)具體的方面，本發(fā)明提供分離的核酸，該核酸包含對(duì)應(yīng)于基因的啟動(dòng)子活性區(qū)的核苷酸序列，所述基因包含編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄I)NA序列。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"、"啟動(dòng)子區(qū)"和"啟動(dòng)子活性區(qū)"意指指導(dǎo)與其可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄DNA序列表達(dá)的核苦酸序列，其中通過(guò)起始、調(diào)節(jié)或以其它方式調(diào)控所述可轉(zhuǎn)錄DNA序列的轉(zhuǎn)錄來(lái)進(jìn)行所述指導(dǎo)。.就本發(fā)明而言，"分離的"意指已經(jīng)不同于其天然狀態(tài)的材料，或以其它方式經(jīng)過(guò)人為操作的材料。分離的材料可以基本上(substantially)或本質(zhì)上(essentially)不含在其天然狀態(tài)下通常與其共存的成分，或者可以經(jīng)過(guò)操作從而連同在其天然狀態(tài)下通常與其共存的成分一起成為人工狀態(tài)。分離的材料可以是天然形式或重組形式。術(shù)語(yǔ)"核酸"用于本文指單鏈或雙鏈的mRNA、RNA、cRNA和DNA,包括cDNA、基因組DNA和DNA-RNA雜合體。"可操作地連接(operablylinked)"意指功能性連接。僅為舉例，將本發(fā)明的啟動(dòng)子核酸與可轉(zhuǎn)錄的核酸可操作地連接，從而能夠起始、控制、調(diào)節(jié)或以其他方式指導(dǎo)所述可轉(zhuǎn)錄核酸的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)"可轉(zhuǎn)錄的DNA序列"或"轉(zhuǎn)錄的DNA序列"不包括驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)。依賴(lài)于本發(fā)明的這個(gè)方面，可轉(zhuǎn)錄的序列可以完全或部分源于任何本領(lǐng)域已知的來(lái)源，包括植物、真菌、動(dòng)物、細(xì)菌基因組或附加體(episome)，真核的、核的或質(zhì)粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學(xué)合成的DNA?？赊D(zhuǎn)錄序列可以在編碼區(qū)或非翻譯區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)修飾，其能夠影響表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達(dá)的速率或表達(dá)調(diào)控的方式。這些修飾包括，但不限于，插入、缺失和取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸?？赊D(zhuǎn)錄序列可以含有不間斷的編碼序列，或者它可以包括一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，其通過(guò)適當(dāng)?shù)募艚狱c(diǎn)結(jié)合?？赊D(zhuǎn)錄序列也可以編碼融合蛋白?？梢钥紤]的向植物組織中引入的本發(fā)明的嵌合核酸構(gòu)建體將包括這樣的構(gòu)建體，其中的可轉(zhuǎn)錄序列及其啟動(dòng)子各自源自不同的物種。為了支持真核生物中復(fù)雜的基因表達(dá)性質(zhì)，啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)逐漸成為在結(jié)構(gòu)和功能兩方面高度多樣化的實(shí)體(entites)。例如，啟動(dòng)子可以分為"強(qiáng)的"或"弱的"，它們是與轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生的相對(duì)水平相關(guān)的常規(guī)術(shù)語(yǔ)。另外，特定的啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)RNA在多種或全部組織中產(chǎn)生，并且因此被稱(chēng)為"組成型啟動(dòng)子"?；蛘?，另外的啟動(dòng)子已經(jīng)顯示出指導(dǎo)RNA僅在特定細(xì)胞類(lèi)型或組織中以較高水平產(chǎn)生，并被稱(chēng)作"組織特異性啟動(dòng)子"。本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)在谷類(lèi)胚乳中是高活性的，所述谷類(lèi)包括大麥(barley)、玉米(com)、小麥(wheat)、玉米(maize)等，但不限于此。優(yōu)選地，谷類(lèi)是小麥。適當(dāng)?shù)兀梢允褂眯←湹腂obWhite或Banks品禾中(variety)。無(wú)論啟動(dòng)子的類(lèi)型如何，可轉(zhuǎn)錄DNA序列的啟動(dòng)子活性區(qū)必須有足夠長(zhǎng)度，從而使其能夠起始并調(diào)節(jié)與其偶聯(lián)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)的長(zhǎng)度范圍可以在100bp至幾千個(gè)堿基。優(yōu)選地，啟動(dòng)子活性區(qū)是100bp-4kb。更優(yōu)選地，啟動(dòng)子活性區(qū)大于150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp和1400bp。甚至更優(yōu)選地，啟動(dòng)子活性區(qū)的長(zhǎng)度大于1500bp。優(yōu)選地，啟動(dòng)子活性區(qū)小于4kb、3.5kb、3kb、2.5kb和2kb。在這些實(shí)施方案的特定形式中，盡管不一定是僅有的形式，啟動(dòng)子活性區(qū)對(duì)應(yīng)于可轉(zhuǎn)錄DNA序列(例如，但不限于，SEQIDNO:28)翻譯起始位點(diǎn)上游的約100bp至約400bp。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子活性區(qū)包含如SEQIDNO:l中所示的核苦酸序列，或其變體。術(shù)語(yǔ)"變體"用于下述核酸的情況，所述核酸與參比核酸展現(xiàn)出可定義的序列同一性水平。例如，變體核酸可以與參比序列在下文定義的嚴(yán)緊條件下雜交，或者享有可以使用如下所述的序列比較算法定義的百分比序列同一性水平。變體也包括其中已經(jīng)添加或缺失、或者已經(jīng)用不同的核普酸或經(jīng)修飾堿基(例如肌苦、曱基胞嘧啶)替換了一個(gè)或多個(gè)核香酸的核酸。在這點(diǎn)上，本領(lǐng)域充分了解能夠?qū)⒈群怂徇M(jìn)行特定改變(包括突變、添加、缺失和取代)，由此改變的核苦酸序列保持參比核苷酸序列的生物學(xué)功能或活性。術(shù)語(yǔ)"變體"也包括天然存在的等位基因變體。根據(jù)本發(fā)明的分離的天然啟動(dòng)子在早前制備的變體或非變體形式(version)的變體可以使用某類(lèi)重組技術(shù)來(lái)進(jìn)行人工工程改造。合適的技術(shù)的非限定性實(shí)例包括隨機(jī)誘變(例如，轉(zhuǎn)座子誘變)、寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCRi秀變和表達(dá)盒i秀變(cassettemutagenesis)。因此在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供變體核酸，該變體核酸是SEQIDNO:1中所示核芬酸序列的變體。在特定實(shí)施方案中，所述變體可以包含選自下組的核香酸序列SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;SEQIDNO:8;SEQIDNO:9;SEQIDNO:10;SEQIDNO:ll;SEQIDNO:12;SEQIDNO:13;SEQIDNO:14;和SEQIDNO:15。在另外的特定實(shí)施方案中，變體核酸可以包含任何一個(gè)或多個(gè)如SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;SEQIDNO:8;SEQIDNO:9;SEQIDNO:10;SEQIDNO:11;SEQIDNO:12;SEQIDNO:13;SEQIDNO:14;和SEQIDNO:15中所示的變體殘基。在另外的特定實(shí)施方案中，變體核酸可以包含對(duì)應(yīng)于源自另一小麥栽培種的啟動(dòng)子序列的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，變體核酸可以包含來(lái)自栽培種Banks基因組DNA的核苷酸序列(SEQIDNO:29),其是與SEQIDNO:1的第100-1354位的核苷酸序列相同的核苷酸序列。本發(fā)明還預(yù)期啟動(dòng)子活性區(qū)或分離的啟動(dòng)子序列的變體，所述變體基于序列之間的同源性而享有關(guān)聯(lián)(relationship)。"同源性"指核普酸序列中與參比核苷酸序列相同的核苦酸的百分?jǐn)?shù)。同源性可以使用序列比較程序諸如BESTFIT(Deveraux"a/.1984,A^c/e/cyk'/A尺esewc/712，387-395)來(lái)測(cè)定，將其通過(guò)引用并入本文。以這種方式，比對(duì)排列中插入缺口來(lái)進(jìn)行比較，這些缺口可以通過(guò)例如BESTFIT使用的比較算法來(lái)決定。用于描述兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列之間序列關(guān)聯(lián)的術(shù)語(yǔ)包括"參比序列，，、"比較窗口(comparisonwindow)"、"序列同一性，，、"序列同一'1"生百分比"和"基本相同"。"參比序列，，的長(zhǎng)度為至少6個(gè)，但常常是15-18個(gè)，并且通常是至少25個(gè)單體單元，所述單體單元包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸可以各自包含(l)在所述兩個(gè)多核芬酸之間相似的序列(即，僅為完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)在所述兩個(gè)多核苷酸之間有差異的序列，所以?xún)蓚€(gè)(或更多個(gè))多核香酸之間的序列比較通常這樣進(jìn)行，將兩個(gè)多核苷酸的序列通過(guò)"比較窗口"比較，以鑒定和比較具有序列相似性的局部區(qū)域。"比較窗口，，指與參比序列比較的通常為6-12個(gè)連續(xù)殘基的概念性區(qū)段。為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)，比較窗口與參比序列(不含添加或缺失)相比可以包含約20%或更少的添加或缺失(即，缺口)。用于比對(duì)比較窗口的序列最佳比對(duì)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI,USA,通過(guò)引用并入本文)或通過(guò)檢視(inspection)來(lái)進(jìn)行，并且由所選的多種方法中的任一種均可生成最佳比對(duì)(即，通過(guò)比較窗口產(chǎn)生最高百分比同源性)。也可參考BLAST程序家族，如以Altschul等，1997,Wwc/.21:3389公開(kāi)的為例，將其通過(guò)引用并入本文。對(duì)序列分析的詳細(xì)討論可以參見(jiàn)Ausubel等"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&SonsInc，1994-1998,第15章第19.3單元。術(shù)語(yǔ)"序列同一性，，用于本文指序列通過(guò)比較窗口以逐個(gè)核苷酸為基礎(chǔ)的相同程度。因此，"序列同一性百分比"如下計(jì)算，通過(guò)比較窗口比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列，測(cè)定在兩個(gè)序列中都存在相同核酸石成基(例如，A、T、C、G、I)的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用匹配位置屬除以比較窗口中的位置總數(shù)(即，窗口大小)，再將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。就本發(fā)明而言，"序列同一性，，將被理解為意指通過(guò)DNASIS計(jì)算機(jī)程序(用于Windows的版本2.5;可從HitachiSoftwareengineeringCo.，Ltd.，SouthSanFrancisco,California,USA獲得)計(jì)算的"匹配百分比，，，其中使用該軟件所附參考手冊(cè)中所用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)(defaults)設(shè)定，將其通過(guò)引用并入本文。在一種實(shí)施方案中，核酸變體與本發(fā)明的分離核酸享有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90。/。且更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在另一實(shí)施方案中，核酸變體在至少低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選在至少中嚴(yán)緊條件下，并且更優(yōu)選在高嚴(yán)緊條件下，與本發(fā)明的核酸包括片段雜交。"雜交"用于本文表示至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列配對(duì)產(chǎn)生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA雜合體(hybrid)。包含互補(bǔ)核苷酸序列的雜合序列通過(guò)石成基配對(duì)產(chǎn)生。修飾的嘌呤(例如，肌香，曱基肌苷和曱基腺苷)和修飾的嘧啶(硫尿苷和曱基胞嘧啶)亦可參與到堿基配對(duì)中。"嚴(yán)緊性，，用于本文指雜交過(guò)程中的溫度和離子強(qiáng)度條件，以及存在或不存在特定的有機(jī)溶劑和/或洗滌劑。嚴(yán)緊性越高，則進(jìn)行雜交的核苷酸序列之間必需的互補(bǔ)性水平將會(huì)越高。"嚴(yán)緊性條件，，指在這些條件下只有具有高頻率互補(bǔ)堿基的核酸將會(huì)雜交的條件。本文涉及的低嚴(yán)緊性條件包括并涵蓋(i)從至少約1%v/v到至少約15%v/v曱酰胺和從至少約1M到至少約2M鹽用于在42。C雜交，和至少約1M到至少約2M鹽用于在42。C洗滌；和(ii)1。/。牛血清白蛋白(BSA)、lmMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS用于在65°C雜交，和(i)2xSSC、0.1%SDS;或(ii)0.5%BSA、1mMEI)TA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS用于在室溫洗滌。中嚴(yán)緊性條件包括并涵蓋(i)從至少約16%v/v到至少約30%v/v曱酰胺和從至少約0.5M到至少約0.9M鹽用于在42°C雜交，和至少約0.5M到至少約0.9M鹽用于在42°C洗涂；和(ii)1。/。牛血清白蛋白(BSA)、lmMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS用于在65°C雜交，和(a)2xSSC、0.1%SDS;或(b)0,5%BSA、1mMI<:DTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS用于在42。C洗滌。高嚴(yán)緊性條件包括并涵蓋(i)從至少約31%v/v到至少約50%v/v曱酰胺和從至少約0.01M到至少約0.15M鹽用于在42。C雜交，和至少約0.01M到至少約0.15M鹽用于在42°C洗滌；(ii)1%BSA、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS用于在65。C雜交，和(a)O.lxSSC、0.1%SDS;或(b)0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHP04(pH7.2)、1%SDS用于在超過(guò)65。C的溫度下洗滌約1小時(shí)；和(iii)0.2xSSC、0.1%SDS用于在68。C或以上洗滌約20分鐘。概括而言，錯(cuò)配堿基數(shù)每增加1%，雙鏈體DNA的Tm降低約1。C。雖然如此，嚴(yán)緊條件是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，諸如在Ausubel等(見(jiàn)上文)的第2.9和2.10章中所述，將其通過(guò)引用并入本文。技術(shù)人員也將認(rèn)識(shí)到可以對(duì)多種因素進(jìn)行操作以?xún)?yōu)化雜交的特異性。對(duì)最終洗滌的嚴(yán)緊性的優(yōu)化能夠?yàn)楦咚诫s交提供保證。通常，互補(bǔ)核苷酸序列通過(guò)印跡技術(shù)來(lái)鑒定，所述印跡技術(shù)包括將核苷酸固定在基質(zhì)(優(yōu)選合成膜諸如硝酸纖維素)上的步驟，雜交步驟，和檢測(cè)步驟。Southern印跡用于鑒定互補(bǔ)DNA序列；Northern印跡用于鑒定互補(bǔ)RNA序列。斑點(diǎn)印跡和狹線(xiàn)印跡可以用于鑒定互補(bǔ)的DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA多核苷酸序列。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且已經(jīng)在通過(guò)引用并入本文的Ausubel等(見(jiàn)上文)中，在第2.9.1至2.9.20頁(yè)中描述。本發(fā)明的核酸變體可以根據(jù)以下流程制備(i)從合適的宿主，例如細(xì)菌物種獲得核酸提取物；(ii)創(chuàng)建可1物(任選地是簡(jiǎn)并引物)，其中每個(gè)？1物包含對(duì)應(yīng)于編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列的核苷酸序列的片段，或包含與編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列相鄰的核苷酸序列的片段；和(iii)藉由核酸擴(kuò)增技術(shù)，使用所述引物從所述核酸提取物擴(kuò)增一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物。如用于本文，"擴(kuò)增產(chǎn)物"指通過(guò)核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。如用于本文，"核酸序列擴(kuò)增技術(shù)"包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，例如如CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,Ausubel等編(JohnWiley&SonsNYUSA1995-2001)的第15章中所述，鏈置換擴(kuò)增(SDA);滾環(huán)復(fù)制(RCR),如例如國(guó)際申請(qǐng)WO92/01813和國(guó)際申請(qǐng)WO97/19193中所述；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，如例如Sooknanan等.1994,Biotechniques171077中所述；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR),如例如國(guó)際申請(qǐng)WO89/09385和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY的第15章(見(jiàn)上文)中所述；Q-卩復(fù)制酶擴(kuò)增，如例如Tyagi等.1996，Proc.Natl.15Acad.Sci.USA&:5395中所述；和解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增，如例如國(guó)際申請(qǐng)WO2004/02025中所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易意識(shí)到，本發(fā)明還預(yù)期啟動(dòng)子活性區(qū)的啟動(dòng)子活性片段及其核苷酸序列變體。將容易理解的是，當(dāng)啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子活性片段與特定基因融合并引入植物細(xì)胞中時(shí)，該片段致使所述基因以高于不存在該片段時(shí)可能產(chǎn)生的表達(dá)水平的水平表達(dá)。啟動(dòng)子的活性能夠通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定。例如，可以參考Medberry等(1992,P/awfCW/4:185;1993，77ze尸/a"http://2:619,通過(guò)引用并入本文)，Sambrook等(1989,見(jiàn)上文)和McPherson等(美國(guó)專(zhuān)利第5,164,316號(hào)，通過(guò)引用并入本文)。特定最小核酸區(qū)，或稱(chēng)為調(diào)節(jié)元件，是片段要擁有啟動(dòng)子活性所必需的。這些調(diào)控元件是不同的啟動(dòng)子序列元件的混合，所述啟動(dòng)子序列元件諸如但不限于，TATA框、INR元件、BRE元件、質(zhì)體元件和胚乳特異性元件以及基因特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域熟知的是，例如，TATA框和INR元件能夠獨(dú)立地起始精確的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，啟動(dòng)子活性片段包含至少一個(gè)表1所示列表中的元件。更優(yōu)選地，啟動(dòng)子活性片段包含至少兩個(gè)表1所示列表中的元件。表2對(duì)位于啟動(dòng)子活性片段中的可能的調(diào)節(jié)基因元件提供了更詳盡的列舉?？赊D(zhuǎn)錄DNA序列和蛋白質(zhì)本發(fā)明的啟動(dòng)子最初因?yàn)樗鼈冎笇?dǎo)可轉(zhuǎn)錄DNA序列在發(fā)育中的小麥種子胚乳中高水平產(chǎn)生的能力而局部化(localised)。使用如下文所述的基因表達(dá)系列分析(SAGE)來(lái)筌定本發(fā)明的可轉(zhuǎn)錄DNA序列。這種類(lèi)型的示例性核苷酸序列示于SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、S即DNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27。然而，應(yīng)該理解的是本發(fā)明不限于使用任何特定的用于鑒定這些差異表達(dá)的基因的方法。例如，用于鑒定在不同組織中差異表達(dá)的基因的可選方法包括，但不P艮于cDNA和基因組扣除雜交法(subtractivehybridisation),如例3口Bulman牙口Neill(1996,In"尸/aw/GeweZso/加Zow:/Wwczj:/"/Vac"ce",G.D.Foster和D.Twell編，Chichester,UK,Wiley,第369-397頁(yè))所述；顯微cDNA陣列的多探針?lè)俟夥治觯缋鏢chena(1996Bz'o五ssa;;s18:427-431)所述；mRNA差異展示，如例如Liang和Pardee(1992,5We"ce257:967-970)和Callard等(1994，&o7k^m々"^16:1096-1103)所述；基于由大規(guī)模cDNA末端測(cè)序顯現(xiàn)的相同序列(EST)出現(xiàn)頻率進(jìn)行的mRNA豐度的計(jì)算機(jī)分析，^口^f列^口Cooke等(1996,ESTgewom/c^e《we"c/"g;n9乂ec^y.In尸/a"Z(7ewe"o/a"o"..尸n'"c0/eya"d尸rac"'ce，見(jiàn)上文，第410-419頁(yè))教導(dǎo)的；或使用無(wú)啟動(dòng)子的4艮告基因通過(guò)插入i秀變進(jìn)^亍的啟動(dòng)子標(biāo)記(promotertaggingbyinsertionalmutagenesiswithpromoterlessreportergenes)，^口侈寸^口Lindsey禾口Topping(1996，7^/)iV/4-wedz'a&dz>wer//owi3/ww/age"ew'i1.In尸/awZ(7ewe/yo/W/o"..尸n'"cz》/as朋^尸racf/ce，見(jiàn)上文，第275-300頁(yè))和Mudge和Birch(1998，Jw^ra/./25:637-643)所公開(kāi)，將所述文獻(xiàn)全部通過(guò)引用并入本文。還應(yīng)該理解的是本發(fā)明可以考慮SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27中所示可轉(zhuǎn)錄DNA序列的分離的核酸變體。在一種實(shí)施方案中，核酸變體與本發(fā)明的分離的核酸共享至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%并且更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。如上文所述，可轉(zhuǎn)錄DNA序列含有，但不限于，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的可轉(zhuǎn)錄DNA序列編碼如SEQIDNO:28中所示的氨基酸序列。盡管不希望受到任何特定理論的限制，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析暗示這種氨基酸序列對(duì)應(yīng)于4鼓體相關(guān)蛋白(microbody-associatedprotein)。"蛋白質(zhì)，，意指氨基酸多聚體。氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸,D-或L-氨基酸，如本領(lǐng)域充分理解的。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)，，包括并且涵蓋"肽"，其通常用于描述具有不多于五十(50)個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，以及"多肽"，其通常用于描述具有多于五十(50)個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)?；?、嵌合基因和遺傳構(gòu)建體本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子或其變體可以和與其天然結(jié)合的核酸或異源核酸融合以分別形成基因和嵌合基因。本發(fā)明的啟動(dòng)子提供了一種附加的優(yōu)勢(shì)，即高水平的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生。"異源核酸"意指不同于本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子的核酸。在操作上，將所述異源核酸與本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子核酸可操作地連接以實(shí)現(xiàn)異源核酸的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)異源核酸包括如前文定義的可轉(zhuǎn)錄DNA。術(shù)語(yǔ)"基因"在本文用于描述基因組內(nèi)離散的核酸基因座(locus)、單元或區(qū)域，其可以包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子、外顯子、剪接位點(diǎn)、開(kāi)讀框和5'和/或3'非編碼調(diào)節(jié)序列諸如啟動(dòng)子和/或聚腺芬酸化序列。"基因"還包括該基因的RNA拷貝或cDNA拷貝。"嵌合基因"在本文定義為單鏈或雙鏈的核酸，優(yōu)選DNA分子，其包括與異源核酸可操作地連接的本發(fā)明的分離的核酸、變體或啟動(dòng)子活性片段。因此在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期一種分離的基因，其包含與可轉(zhuǎn)錄DNA序列可操作地連接的啟動(dòng)子活性區(qū)。在這種實(shí)施方案的優(yōu)選形式中，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)錄DNA序列位于啟動(dòng)子活性區(qū)的鄰近。更優(yōu)選地，可轉(zhuǎn)錄DNA序列編碼SEQIDNO:28。還預(yù)期本發(fā)明提供一種以轉(zhuǎn)化和表達(dá)異源核酸為目的的嵌合基因。容易預(yù)料的是本發(fā)明適合于表達(dá)由所述異源核酸編碼的范圍廣泛的(abroadspectrumof)分子。然而，本發(fā)明尤其適合于表達(dá)編碼用作生物藥物的生物學(xué)活性蛋白的核酸。通常，盡管不限于此，所述生物學(xué)活性蛋白將具有舒減性質(zhì)(palliativeproperty)。非限定性實(shí)例包括生長(zhǎng)因子、激酶、免疫刺激性抗原、抗體、調(diào)節(jié)蛋白諸如細(xì)胞因子、趨化因子等。本發(fā)明的啟動(dòng)子和分離的基因相當(dāng)適合包括在遺傳構(gòu)建體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地理解遺傳構(gòu)建體是包含多種核苷酸序列元件中任一種的核酸，所述構(gòu)建體的功能依賴(lài)于期望的構(gòu)建體用途。用途從用于對(duì)重組DNA進(jìn)行常規(guī)操作和增殖的載體到更復(fù)雜的應(yīng)用諸如異源核酸的原核或真核表達(dá)和經(jīng)遺傳修飾的植物或動(dòng)物的產(chǎn)生。通常，盡管不限于此，將遺傳構(gòu)建體設(shè)計(jì)為提供多于一種應(yīng)用。僅作為舉例，預(yù)定的終用途是在真核系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白的遺傳構(gòu)建體可以在表達(dá)所需的序列之外具有并入的用于如在原核生物中克隆和增殖等功能的核苷酸序列。在設(shè)計(jì)和制備這些遺傳構(gòu)建體時(shí)一個(gè)重要的考慮是用于預(yù)定應(yīng)用所需的核苷酸序列?；谏衔乃?，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是遺傳構(gòu)建體是能夠適用于多種目的中任一種的多用途工具(versatiletool)。因此在一個(gè)具體的方面，本發(fā)明提供多種遺傳構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的分離的核酸以及一個(gè)或多個(gè)其它核香酸序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體，其包含對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的啟動(dòng)子活性區(qū)的核苦酸序列以及一個(gè)或多個(gè)其它核香酸序列。在這種實(shí)施方案的一種形式中，啟動(dòng)子活性區(qū)是包含可轉(zhuǎn)錄DNA序列SEQIDNO:28的基因的啟動(dòng)子活性區(qū)。在這種特定實(shí)施方案的另一形式中，對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的核苷酸序列示于SEQIDNO:1或是其變體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳構(gòu)建體是表達(dá)載體，將該表達(dá)載體設(shè)計(jì)為可接受分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼用來(lái)重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的核苦酸序列。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體至少包含啟動(dòng)子，此外還包含一個(gè)或多個(gè)操作、增殖和表達(dá)重組DNA所需的其它核苷酸序列。在這種實(shí)施方案的一種形式中，啟動(dòng)子是包含可轉(zhuǎn)錄DNA序列的基因的啟動(dòng)子活性區(qū)。優(yōu)選地，所述可轉(zhuǎn)錄DNA序列編碼SEQIDNO:28。在這種實(shí)施方案的另一形式中，對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子的核苷酸序列示于SEQIDNO:1或是其變體。"載體"意指源自例如質(zhì)粒、噬菌體或植物病毒的核酸，優(yōu)選DNA分子，可以向其中插入或克隆核酸序列。載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)并且可能能夠在限定的宿主細(xì)胞包括靶細(xì)胞或組織或祖細(xì)胞(progenitorcell)或其組織中自主復(fù)制，或者可以與限定宿主的基因組整合從而使克隆的序列成為可復(fù)制的。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，線(xiàn)型或閉環(huán)質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。栽體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以包含單獨(dú)的載體或質(zhì)粒、共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子(transposon)。載體的選擇將通常依賴(lài)于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的兼容性。載體也可以包括能夠用于選擇合適的轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記諸如抗生素抗性基因。這些抗性基因的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳構(gòu)建體包含分離的核酸，所述分離的核酸包含對(duì)應(yīng)于可表達(dá)序列的核芬酸序列。優(yōu)選地，可表達(dá)序列是本發(fā)明的分離的基因或嵌合基因。更優(yōu)選地，可表達(dá)序列是本發(fā)明的嵌合基因。附加序列根據(jù)可能的需要，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括增強(qiáng)子(翻譯或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。這些增強(qiáng)子區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且可以包括ATG起始密碼子和相鄰序列。起始密碼子必需符合(inphasewith)與異源或內(nèi)源DNA序列相關(guān)的編碼序列的開(kāi)讀框，以確保完整序列的翻譯。翻譯調(diào)控信號(hào)和起始密碼子可以是多補(bǔ)來(lái)源的，天然和合成來(lái)源均可。翻譯起始區(qū)可以由翻譯起始區(qū)的來(lái)源提供，或由異源或內(nèi)源DNA序列提供。所述序列也可以源自選擇用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的來(lái)源，并且可以經(jīng)過(guò)特異性修飾以增加mRNA的翻;奪。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的實(shí)例包括，但不限于，來(lái)自CaMV35S啟動(dòng)子和章魚(yú)堿合酶基因的元件，如例如Last等(美國(guó)專(zhuān)利第5，2卯,924號(hào)，將其通過(guò)引用并入本文)所述。提出當(dāng)應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化的背景下，增強(qiáng)子元件諸如ow元件的使用，并且特別是多拷貝的元件的使用，將發(fā)揮增加相鄰啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平的作用。由于插入在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列起點(diǎn)之間的DNA序列，即，非翻譯前導(dǎo)序列能夠影響基因表達(dá)，也可采用特定前導(dǎo)序列。優(yōu)選的前導(dǎo)序列包括含有下述序列的那些，所述序列被選擇用于指導(dǎo)異源或內(nèi)源DNA序列的最優(yōu)表達(dá)。例如，這樣的前導(dǎo)序列包括優(yōu)選的共有序列，該共有序列能夠增加或保持mRNA穩(wěn)定性并防止翻i奪的不當(dāng)起始，如例如Joshi(1987，Wwc/.力cW/e&，15:6643)所述，將其通過(guò)引用并入本文。然而，其它前導(dǎo)序列，例如RTBV的前導(dǎo)序列，具有預(yù)期會(huì)降低mRNA穩(wěn)定性和/或減少mRNA翻譯的高度二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，將最優(yōu)選這樣的前導(dǎo)序列(i)不具有高度二級(jí)結(jié)構(gòu)，(ii)具有高度二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)不抑制mRNA穩(wěn)定性和/或減少翻譯，或(iii)源自在植物中高表達(dá)的基因。按照期望也可包括調(diào)節(jié)元件，諸如蔗糖合酶內(nèi)含子，如例如Vasil等(1989P/i^/o/.,91:5175)所述；Adh內(nèi)含子I,如例如Callis等(1987，20/)eve/op.,II)所述；或TMVo)元件，如例如Gallie等(1989,TTzeCe〃，1:301)等所述?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)踐的其它這類(lèi)調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此外，可以采用導(dǎo)向序列(targetings叫uence)使異源或內(nèi)源核苷酸序列的蛋白質(zhì)產(chǎn)物靶向植物細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)區(qū)室或靶向胞外環(huán)境。例如，可以將編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transitpeptide)或信號(hào)肽序列的DNA序列與編碼期望蛋白質(zhì)的序列可操作地連接，從而在翻譯時(shí)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)分別轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的胞內(nèi)或胞外目標(biāo)(destination),并且所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽隨后能夠在翻譯后被去除。轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)胞內(nèi)膜(例如液泡、嚢泡、質(zhì)體和線(xiàn)粒體膜)來(lái)發(fā)揮作用，而信號(hào)肽指導(dǎo)蛋白質(zhì)通過(guò)胞外膜。例如，轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽能夠?qū)⑵谕牡鞍踪|(zhì)導(dǎo)向特定細(xì)胞器諸如質(zhì)體(例如，葉綠體)，而非細(xì)胞質(zhì)。因此，遺傳構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列，該序列可搡作地連接于本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)或啟動(dòng)子變體與異源或內(nèi)源核芬酸序列之間。例如，可以參考Heijne等(1989，￡wr乂所oc/zem.，180:535)和Keegstra等(1989,爿"".尸/a"f尸/zjwo/.戶(hù)/朋fMo/.所o/"40:471)，將它們通過(guò)引用并入本文。也可將本發(fā)明的分離的核酸引入載體，諸如質(zhì)粒。質(zhì)粒載體包括附加的DNA序列，這些DNA序列提供用于表達(dá)盒在原核和真核細(xì)胞中的簡(jiǎn)單選擇、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化，例如，pUC-衍生載體、pSK-衍生載體、pGEM-衍生載體、pSP-衍生載體或pBS-衍生載體。附加DNA序列包括提供用于載體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)；選擇性標(biāo)記基因，優(yōu)選編碼抗生素或除草劑抗性；獨(dú)特的多克隆位點(diǎn)，其提供多個(gè)位點(diǎn)以插入嵌合DNA構(gòu)建體中編碼的DNA序列或基因；和增強(qiáng)對(duì)原核和真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的序列。載體優(yōu)選含有允許該載體穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組或允許該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于該細(xì)胞的基因組進(jìn)行自主復(fù)制的元件。在將載體引入宿主細(xì)胞時(shí)，載體可能整合入宿主細(xì)胞基因組。對(duì)于整合，載體可以依賴(lài)于異源或內(nèi)源DNA序列或任何其它載體元件通過(guò)同源重組將該載體穩(wěn)定整合入所述基因組。或者，載體可以含有附加核酸序列用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組向宿主細(xì)胞基因組中的整合。所述附加核酸序列使載體能夠整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)目與相應(yīng)靶序列高度同源的核酸以增加同源重組的可能性，諸如100-1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400-1,500個(gè)堿基對(duì)，并且最優(yōu)選800-1,500個(gè)堿整合元件可以是非編碼核酸序列或編碼核酸序列。對(duì)于自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使載體能夠在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn),和允許在芽孢桿菌屬(^a"7/w)中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAM.beta.l的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是具有使其在芽孢桿菌屬細(xì)胞中的功能對(duì)溫度敏感的突變的復(fù)制起點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，Ehrlich,1978,ZVoc.A^/.^cad75:1433)。標(biāo)記基因?yàn)榱舜龠M(jìn)對(duì)轉(zhuǎn)化體的鑒定，遺傳構(gòu)建體理想地包含選擇性或可篩選的標(biāo)記基因作為可表達(dá)的異源或內(nèi)源核香酸序列，或者在可表達(dá)的異源或內(nèi)源核苷酸序列之外還包含選擇性或可篩選的標(biāo)記基因。標(biāo)記的實(shí)際選擇不是非常重要，只要所述標(biāo)記與所選植物細(xì)胞組合有功能(即，有選擇性)即可。標(biāo)記基因和感興趣的異源或內(nèi)源核苷酸序列不必連接，因?yàn)椴幌噙B基因的共轉(zhuǎn)化(如例如美國(guó)專(zhuān)利第4,399,216號(hào)中所述)在植物轉(zhuǎn)化中也是一種有效方法。術(shù)語(yǔ)選"t奪性或可篩選的標(biāo)記基因包括編碼"分泌性標(biāo)記(secretablemarker)"的基因，作為鑒定或選擇被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段能夠檢測(cè)所述分泌性標(biāo)記的分泌。實(shí)例包括編碼分泌性抗原的標(biāo)記，分泌性抗原能夠通過(guò)抗體相互作用鑒定，或編碼分泌性酶的標(biāo)記，分泌性酶能夠通過(guò)它們的催化活性來(lái)檢測(cè)。分泌性蛋白包括，但不限于，細(xì)胞壁中插入或俘獲的蛋白質(zhì)(例如，包括諸如伸展蛋白或煙草PR-S的表達(dá)單元中存在的前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì))；小的、可擴(kuò)散的蛋白質(zhì)，例如通過(guò)ELISA可以檢測(cè)；和在胞外溶液中可以檢測(cè)的小的活性酶(例如，cx-淀粉酶、P-內(nèi)酰胺酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。選擇性標(biāo)記細(xì)菌選纟奪性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌(5ac///wsw^7/"或地衣芽孢桿菌(5ac/〃w/!'c/zem/om^)的&/基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，諸如氨千西林、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。用于選擇植物轉(zhuǎn)化體的示例性選擇性標(biāo)記包括，但不限于，編碼潮霉素B抗性的/^g基因；賦予對(duì)卡那霉素、巴龍霉素、G418等的抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶("eo)基因，如例如Potrykus等(1985,Mo/.199:183)所述；來(lái)自大鼠肝臟的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對(duì)谷胱甘肽衍生的除草劑的抗性，如例如EP-A256223中所述；谷氨酰胺合成酶基因，其在過(guò)表達(dá)時(shí)賦予對(duì)谷氨酰胺合成酶抑制劑諸如膦絲菌素的抗性，如例如WO87/05327所述；來(lái)自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(&re/tom少CMW〃Woc/zrawogewe"的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對(duì)選擇劑膦絲菌素的抗性，如例如EP-A275957中所述；編碼5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolshikimate-3-phosphatesynthase)(EPSPS)的基因，其賦予對(duì)N-膦酰曱基甘氨酸(N-phosphonomethylglycine)的耐受性，如例如Hinchee等(1988,歷o&c/z.,6:915)所述；賦予針對(duì)bialaphos的抗性的6ar基因，如例如WO91/02071中所述；腈水解酶基因諸如來(lái)自肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種(尺/eZw/e〃ao加e朋e)的6x"，其賦予對(duì)溴草腈(bromoxynil)的抗性(Stalker等，1988，5Wence，242:419);二氪葉酸還原酶(DHFR)基因，其賦予對(duì)氨曱喋呤的抗性(Thillet等，1988,J說(shuō)o/.C7zem.,263:12500);突變的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其賦予對(duì)咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化合物的抗性(EP-A-154204);突變的鄰氨基苯曱酸合酶基因，其賦予對(duì)5-曱基色氨酸的抗性；或賦予對(duì)除草劑的抗性的茅草枯脫鹵素酶(dalapondehalogenase)基因?？珊Y選標(biāo)記優(yōu)選的可篩選標(biāo)記包括，但不限于，編碼(3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的wW」基因，已知該酶的多種顯色底物；p-半乳糖苷酶基因，其編碼已知有顯色底物的酶；水母發(fā)光蛋白基因(Prasher等，1985,所oc/zew.5/o//z>v.W&s.Comw.,126:1259)，其可以用于鈣敏感性生物發(fā)光檢測(cè)；綠色熒光蛋白基因(Niedz等,1995尸/朋fCe〃/e;o,力，14:403);允許用生物發(fā)光檢測(cè)的螢光素酶(/"c)基因(Ow等，1986，5We"ce，234:856);p-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe，1978，尸rac.A^/.^cadL/5"v475:3737),其編碼已知有多種顯色底物(例如，PADAC，一種顯色頭孢菌素)的酶；R-位點(diǎn)基因(R-locusgene),其編碼調(diào)節(jié)植物組織中花色素香色素(紅色)產(chǎn)生的產(chǎn)物(Dellaporta等，1988，在C7zrawoyome6VwcwreF匿"o",第263-282頁(yè)中)；a-淀粉酶基因(Ikuta等,1990，胸e凌,8:241);編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸啥喟秃投喟王?d叩aquinone)的酶的酪氨酸酶基因(Katz等，1983,/G饑M/cra&o/.,129:2703)，多巴和多巴醌進(jìn)一步濃縮形成容易檢測(cè)的化合物黑色素；或xy/五基因(Zukowsky等，1983,尸rac.iV加/.爿cad80:1101),其編碼能夠轉(zhuǎn)化顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶。經(jīng)遺傳修飾的植物和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供的遺傳構(gòu)建體的一種廣泛應(yīng)用是過(guò)表達(dá)重組蛋白用系統(tǒng)。預(yù)期這樣的系統(tǒng)適用于表達(dá)任何種類(lèi)的蛋白質(zhì)，包括抗體、技術(shù)性蛋白質(zhì)(technicalprotein)(諸如可商購(gòu)的酶)和生物學(xué)活性蛋白質(zhì)。然而，本發(fā)明的分離的核酸和遺傳構(gòu)建體尤其適合于基于以分子農(nóng)業(yè)(molecularfarming)為目的生成經(jīng)遺傳修飾的植物的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)遺傳修飾的"廣泛地指向植物或動(dòng)物中引入異源核酸。異源核酸可以通過(guò)染色體整合的手段進(jìn)入宿主基因組而存在于所迷生物中，或者通過(guò)附加體復(fù)制而存在于所述生物中。盡管不是必然的，但是遺傳修飾可導(dǎo)致宿主生物表型的改變。"分子農(nóng)業(yè)"的意思是使用在遺傳上增強(qiáng)的植物來(lái)產(chǎn)生用作生物藥物的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)。Twyman等2003(TrendsinBiotechnology,li:570-578)提供了可用于這種技術(shù)的宿主系統(tǒng)和表達(dá)技術(shù)的實(shí)例，并且將其通過(guò)引用并入本文。使用植物作為重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)與基于原核生物、酵母和動(dòng)物的系統(tǒng)相比可提供多種顯著的優(yōu)勢(shì)，包括低生產(chǎn)成本、因不存在人病原體而帶來(lái)的安全效益、規(guī)?？烧{(diào)性(scalability)并且能夠精確折疊和裝配復(fù)雜的蛋白質(zhì)。已有多種不同的平臺(tái)用于分子農(nóng)業(yè)，包括多葉作物(leafycrops)、谷類(lèi)和豆科才直物種子(cerealandlegumeseeds)、油泮+種子(oilseeds)、水果(fruits)、蔬菜(vegetables)、水^咅系統(tǒng)(hydroponicsystems)、藻類(lèi)(algae)和苔蘚(moss)?；诜N子的生產(chǎn)平臺(tái)帶來(lái)的具體優(yōu)勢(shì)是種子能夠以穩(wěn)定形式長(zhǎng)時(shí)間貯藏蛋白質(zhì)。此外，因?yàn)楦咚降闹亟M蛋白積累在種子內(nèi)的小體積中，實(shí)際上起始材料是濃縮蛋白溶液，這大大促進(jìn)了純化和加工。來(lái)自谷類(lèi)作物的種子尤其有利，原因是高生物量產(chǎn)率(biomassyield)和在種子中不存在成問(wèn)題的酚類(lèi)物質(zhì)。小麥因其低生產(chǎn)成本而提供了一種非常有吸引力的表達(dá)宿主?；诜N子的重組表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)理想性質(zhì)是組織特異性表達(dá)的可能性。種子的不同區(qū)室(compartment)具有專(zhuān)門(mén)的貯藏能力。通常而言，盡管不限于此，種子中的貯藏功能或者在胚和胚乳間分配，或者由子葉承擔(dān)。胚乳是以24積累養(yǎng)分用于胚的萌發(fā)為唯一目的的專(zhuān)用貯藏組織，并且因此是理想的用于重組蛋白表達(dá)的區(qū)室。在貯藏組織中進(jìn)行表達(dá)的額外的益處在于避免異源蛋白在營(yíng)養(yǎng)器官中的積累，由此防止對(duì)宿主植物的毒性。組織特異性表達(dá)由特異性啟動(dòng)子指導(dǎo)，在遺傳構(gòu)建體中使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子代表了分子農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要方面。在前文的啟發(fā)下，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在另一特定方面，本發(fā)明提供促進(jìn)重組蛋白在植物胚乳中組織特異性表達(dá)的方法，其包括表達(dá)本發(fā)明的嵌合基因的步驟。重組蛋白可以使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便地制備，所述標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程如以下文獻(xiàn)中所述，例如Sambrook等，MOLECULARCLONING.ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress,1989),將其通過(guò)引用并入本文，具體在第16和17部分中；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubel等，(JohnWiley&Sons,Inc.1995-1999)，將其通過(guò)引用并入本文，具體在第10和16章中；以及CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCEEds.Coligan等，(JohnWiley&Sons,Inc.1995-1999)，將其通過(guò)引用并入本文，具體在第1、5和6章中。用于重組蛋白表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞和/或植物組織。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞或組織源自植物諸如，但不限于，谷類(lèi)、多葉作物、豆科植物、水果和蔬菜。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞或組織源自谷類(lèi)。本發(fā)明的啟動(dòng)子和遺傳構(gòu)建體適合于生成任何類(lèi)型的經(jīng)遺傳修飾的植物，該植物在它的生活史中產(chǎn)生種子。非限定性實(shí)例包括谷類(lèi)、豆科植物和多葉作物諸如煙草(tobacco)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞源自谷類(lèi)諸如，但不限于，玉米(maize)、稻(rice)、大麥(barley)或'J、麥(wheat)。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞源自小麥。植物轉(zhuǎn)化經(jīng)遺傳修飾的植物的產(chǎn)生中的初始步驟是將DNA引入植物宿主細(xì)胞。許多技術(shù)可用于將DNA引入植物宿主細(xì)胞。存在多種本領(lǐng)域工作人員熟知的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，而新技術(shù)也在不斷地為人所知。轉(zhuǎn)化技術(shù)的特定選擇將通過(guò)其轉(zhuǎn)化特定植物物種的效率以及使用所選特定方法學(xué)實(shí)施本發(fā)明的人員的經(jīng)驗(yàn)和偏好來(lái)決定。對(duì)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，將遺傳構(gòu)建體引入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特定選擇不是本發(fā)明的關(guān)鍵也不是對(duì)本發(fā)明的限制，只要它達(dá)到可以接受的核酸轉(zhuǎn)移水平即可。對(duì)用于植物改良的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)實(shí)際實(shí)施的指導(dǎo)由Birch(1997,^ww.Wev.尸/a"fP/^j/o/.尸/a"/Mo/ec5/o/.48:297陽(yáng)326)提供，將其通過(guò)引用并入本文。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"意指通過(guò)將遺傳物質(zhì)引入生物來(lái)改變基因型。理論上適合于轉(zhuǎn)化的雙子葉和單子葉植物二者均可如下修飾，通過(guò)將本發(fā)明的嵌合DNA構(gòu)建體引入受體細(xì)胞并且培養(yǎng)含有并表達(dá)異源或內(nèi)源核苷酸序列的新植物。應(yīng)該理解的是能夠?qū)Χ喾N植物組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，包括葉紡錘形骨針或葉輪(leafspindleorwhorl)、葉片(leafblade)、腋芽(axillarybuds)、莖(stems)、苗端(shootapex)、葉鞘(leafsheath)、胚愈傷組織(embryoniccallus)、節(jié)間(internode)、葉柄(petioles)、花柄(flowerstalks)、才艮(root)或花序(inflorescence),但不限于這些。已經(jīng)證明了使用根癌農(nóng)桿菌(jgra^"en'wm化me/ac!'era)腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的T-DNA在雙子葉(闊葉)植物諸如煙草、馬鈴薯和苜蓿中引入并表達(dá)異源或嵌合DNA序列是可能的(參見(jiàn)，例如，Umbeck,美國(guó)專(zhuān)利第5,004,863號(hào)和國(guó)際申請(qǐng)PCT/US93/02480)?？梢詫⒈景l(fā)明的構(gòu)建體利用含Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌引入植物細(xì)胞。在使用根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物作為轉(zhuǎn)化媒介物(transformationvehicle)時(shí)，最有利的是使用農(nóng)桿菌屬(爿gra6aceWMw)的非致癌性菌抹作為載體攜帶者(vectorcarrier),從而使經(jīng)轉(zhuǎn)化組織能夠進(jìn)行正常的非癌性分化。優(yōu)選含有二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)(binaryTiplasmidsystem)的農(nóng)桿菌。這種二元系統(tǒng)包含(l)具有毒力區(qū)的第一Ti質(zhì)粒，用于將轉(zhuǎn)運(yùn)DNA(T-DNA)引入植物，和(2)嵌合質(zhì)粒。嵌合質(zhì)粒包含野生型Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)的至少一個(gè)邊界區(qū)位于待轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的側(cè)翼。已經(jīng)證明二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)可有效轉(zhuǎn)化植4勿纟田月包，^口例:fe口DeFramond(1983,5/otec/7"o/ogy,l:262)禾口Hoekema等(1983,A/^we,303:179)所述。這種二元系統(tǒng)相對(duì)于其他系統(tǒng)是優(yōu)選的，原因是它不要求向農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的整合。涉及使用農(nóng)桿菌的方法包括，但不限于(a)將農(nóng)桿菌與培養(yǎng)的分離的原生質(zhì)體共培養(yǎng)；(b)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織；或(c)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化種子、頂/尖(apices)或分生組織(meristems)。近來(lái)，已經(jīng)證明了單子葉植物稻、玉米、菠蘿和甘蔗易受農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，例如如美國(guó)專(zhuān)利第6,037,522號(hào)、國(guó)際公開(kāi)W099/36637和Arencibia等(1998,rraragem'cW&s.7:213)中所述。然而，一些單子葉作物類(lèi)植物尚未使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化成功地轉(zhuǎn)化。然而，將來(lái)可以對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行操作以使其發(fā)揮載體的作用用于這些其它的單子葉植物。此外，使用Ti質(zhì)粒作為模式系統(tǒng)，可能能夠人工構(gòu)建用于這些植物的轉(zhuǎn)化載體。Ti質(zhì)粒也可通過(guò)人為方法引入單子葉植物，所述方法諸如顯微注射，或單子葉植物原生質(zhì)體與含有T區(qū)的細(xì)菌原生質(zhì)球之間的融合，隨后可將其整合入植物的核DNA中。此外，基因轉(zhuǎn)移可以通過(guò)由農(nóng)桿菌進(jìn)行的原位轉(zhuǎn)化完成，如Bechtold等(1993,d」cad尸a&，316:1194)所述。這種方法的基礎(chǔ)是真空滲入農(nóng)桿菌細(xì)胞的懸液?？蛇x地，核酸可以使用農(nóng)桿菌的毛根誘導(dǎo)(root-inducing)(Ri)質(zhì)粒作為載體引入?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)也可用作載體用于將外源核酸引入植物細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利第4,407,956號(hào))。將CaMVDNA基因組插入親本細(xì)菌質(zhì)粒創(chuàng)建能夠在細(xì)菌中增殖的重組DNA分子?？寺≈螅梢栽俅慰寺≈亟M質(zhì)粒并且通過(guò)引入期望的核酸序列來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。其后將經(jīng)修飾的重組質(zhì)粒的病毒部分從親本細(xì)菌質(zhì)粒切下，再用于接種植物細(xì)胞或植物。核酸也可以通過(guò)電穿孔引入植物細(xì)胞，如例如Fromm等(1985,尸rac.Ato/.力cat/.S"'.，".5".j，82:5824)和Shimamoto等(1989,A^wre338:274-276)所述。在這種技術(shù)中，在含有相關(guān)核酸序列的載體或核酸的存在下對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔。高場(chǎng)強(qiáng)的電脈沖使膜可逆地具有可透過(guò)性，允許核酸的引入。經(jīng)電穿孔的植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁，分裂并形成植物愈傷組織。進(jìn)行的高速?zèng)_擊穿透(highvelocityballisticpenetration)(也稱(chēng)作粒子轟擊或微粒轟擊)，所述核酸包含在小珠或顆?；|(zhì)的內(nèi)部或在其表面上，如例如由Klein等(1987,A^"re327:70)所述。盡管通常僅需要新核酸序列的單一引入，但是這種方法特別4是供用于多重引入(multipleintroductions)?？蛇x地，可以通過(guò)使用機(jī)械或化學(xué)手段使核酸接觸植物細(xì)胞來(lái)引入核酸。例如，可以通過(guò)使用微量移液管的顯微注射直接將核酸以機(jī)械方法轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中?；蛘撸梢詫⒑怂崾褂镁垡叶嫁D(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中，聚乙二醇與遺傳物質(zhì)形成沉淀復(fù)合物由細(xì)胞吸收。還可以考慮碳化硅或鎢須，例如，如美國(guó)專(zhuān)利第5,302,523號(hào)中所述。當(dāng)前已知多種方法用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化。目前，優(yōu)選用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是微粒轟擊外植體或懸浮細(xì)胞，和直接的DNA攝取或電穿孔，如例如Shimamoto等(1989,見(jiàn)上文)所述。已經(jīng)通過(guò)用微粒轟擊將吸水鏈霉菌(&repowyc&s/^gmsco//cM)基因引入玉米懸浮培養(yǎng)物的胚發(fā)生細(xì)胞而獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植物(Gordon-Kamm，1990，尸/a"rCW/，2:603-618)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了向其它單子葉作物諸如小麥和大麥的糊粉原生質(zhì)體中引入遺傳物質(zhì)(Lee，1989,尸/朋？Mo/.B/o/.13:21-30)。通過(guò)僅選擇老化的致密和結(jié)節(jié)狀胚發(fā)生愈傷組織(agedcompactandnodularembryogeniccallustissues)用于建立胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，已經(jīng)從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物再生了小麥植物(Vasil，1990，所o/rec/mo/.8:429-434)。與這些作物所用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的組合使本發(fā)明能夠應(yīng)用于單子葉植物。這些方法也可應(yīng)用于雙子葉植物(dicot)的轉(zhuǎn)化和再生。已經(jīng)從胚發(fā)生愈傷組織再生了轉(zhuǎn)基因甘蔗植物，如例如Bower等(1996,Mo/ecw/ar^eeA"g2:239-249)所述?？蛇x地，不同技術(shù)的組合可以用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)化方法的效率，例如，在使用農(nóng)桿菌包被的微粒的轟擊(EP-A-486234)或微粒轟擊引發(fā)創(chuàng)傷之后與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)?？梢允褂萌魏芜m用于靶植物的方法。通常而言，在轉(zhuǎn)化過(guò)程之后使植物細(xì)胞再生以獲得完整植物。術(shù)語(yǔ)"再生"用于本文的意思是從一個(gè)植物細(xì)胞、一組植物細(xì)胞、植物部分(包括種子)或植物件(plantpiece)(例如，來(lái)自原生質(zhì)體、愈傷組織或組織部分)培養(yǎng)完整的、分化的植物。從原生質(zhì)體再生因植物的物種而異，但是通常首先制備原生質(zhì)體的懸液。在特定的物種中，胚形成可以稍后從原生質(zhì)體懸液誘導(dǎo)，直到作為天然胚成熟并萌發(fā)的階段。培養(yǎng)基將通常含有生長(zhǎng)和再生所必需的多種氨基酸和激素。使用的激素的實(shí)例包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。在一些情況下向培養(yǎng)基添加谷氨酸和脯氨酸是有利的，特別是對(duì)于如玉米和苜蓿(alfalfa)等物種。有效的再生將依賴(lài)于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史。如果這些變量得到控制，那么再生是可以重復(fù)的。再生也發(fā)生自植物愈傷組織、外植體、器官或部分。轉(zhuǎn)化可以在器官或植物部分進(jìn)行再生的情況下進(jìn)行，如例如Mw/zoA/"￡"z，o/ogv,Vol.118和Klee等(1987，y4朋wa/7eWewo/尸/贈(zèng)尸一/o/ogy,38:467)中所述，將其通過(guò)引用并入本文。利用Horsch等的葉盤(pán)(leafdisks)轉(zhuǎn)化再生法(1985，Sc&wce，227:1229,通過(guò)引入并入本文)，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)葉盤(pán)，接著在約2-4周中形成苗(shoot)。將發(fā)育的苗從愈傷組織切下并移植到適當(dāng)?shù)母T導(dǎo)選擇培養(yǎng)基中。在根出現(xiàn)后盡快將生根的小植抹移植到土壤中。可以按照需要為小植株換盆(repot)，直到成熟。在無(wú)性繁殖的作物中，成熟轉(zhuǎn)基因植物的繁殖通過(guò)獲取插條(cutting)或通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)進(jìn)行以產(chǎn)生多抹相同的植物。對(duì)理想的轉(zhuǎn)基因體(transgenote)進(jìn)行選擇，獲得新品種，并為商業(yè)用途進(jìn)行無(wú)性繁殖。在種子繁殖的作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可以自交以產(chǎn)生純合近交植物(homozygousinbredplant)。所述近交植物產(chǎn)生含有新引入的雜合基因的種子?？梢耘嘤@些種子以產(chǎn)生將會(huì)產(chǎn)生所選表型(例如，早期開(kāi)花)的植物。從再生植物獲得的部分，諸如花、種子、葉、枝、果實(shí)等包括在本發(fā)明中，只要這些部分包含所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。再生植物的子代和變體以及突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些部分包含引入的核酸序列。應(yīng)該理解的是文獻(xiàn)描述了許多用于再生特定植物類(lèi)型的技術(shù)，并且更多的技術(shù)也在不斷地為人所知。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠參考文獻(xiàn)的細(xì)節(jié)并且能夠在不進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)的條件下選擇合適的技術(shù)。衷在為了確認(rèn)再生植物中異源核酸的存在，可以實(shí)施多種測(cè)定法。這些測(cè)定法包括，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的"分子生物學(xué)"測(cè)定法，諸如Southern和Northern印跡和PCR;可以通過(guò)western印跡、高效液相層析或ELISA分析由所述異源DNA表達(dá)的蛋白質(zhì)(例如，叩tll)，如本領(lǐng)域所熟知的。可用于表征轉(zhuǎn)基因植物的多種方法的實(shí)例在PLANTMOLECULARBIOLOGYALaboratoryManualEd.M.S.Clark(Springer-Verlag，Heidelberg,1997)的第9和11章中提供，將這些章通過(guò)引用并入本文。29為了使本發(fā)明易于理解并且可以產(chǎn)生實(shí)際效果，提供以下非限制實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法LongSAGE分析LongSAGE文庫(kù)根據(jù)Mcintosh等(2006)構(gòu)建自收集的各發(fā)育階段(開(kāi)花后8、14、20和30天(dpa))以及成熟種子的小麥(普通小麥Banks栽培種(7>"/cwmaeWvwmcv.Banks))種子樣品。本研究試圖確定在20和30dpa兩種文庫(kù)中存在的最豐富的LongSAGE轉(zhuǎn)錄物(或標(biāo)記物(tag)),進(jìn)而確定用于進(jìn)一步的基因啟動(dòng)子研究的合適候選物。藉由NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)通過(guò)使用Genbank植物EST序列的比較注釋了(annotate)約50個(gè)LongSAGE標(biāo)記物(數(shù)據(jù)未顯示)。已經(jīng)得到充分表征并且在大多數(shù)情況下已經(jīng)取得專(zhuān)利的與麥谷蛋白(glutenin)或麥醇溶蛋白(gliadin)基因匹配的全部標(biāo)記物不再考慮作為啟動(dòng)子候選。選擇了具有序列CATGTTGTTCCGTGTAGTACC的單一LongSAGE標(biāo)記物(本文稱(chēng)為T(mén)agA)用于進(jìn)一步的分析，原因是它的高表達(dá)水平。TagA是30dpa文庫(kù)內(nèi)第二豐富的標(biāo)記物，并且在其它幾個(gè)文庫(kù)中也大量出現(xiàn)(圖1)。EST文庫(kù)構(gòu)建將LongSAGE標(biāo)記物與我們實(shí)驗(yàn)室生成的源自相同小麥種子(14dpa)樣品的全長(zhǎng)EST序列進(jìn)行手動(dòng)比較。該EST文庫(kù)使用DBBiosciencesClontech(FosterCity,CA)CreatorSMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒以pDNR-LIB載體構(gòu)建。測(cè)序了約1000個(gè)EST克隆，并將那些匹配的TagA納入進(jìn)一步的分析。基因組步查使用BDGenomeWalkerUniversalKit(BDBiosciencesClontech)按照說(shuō)明書(shū)從小麥(栽培種BobWhite)基因組DNA獲得了這種轉(zhuǎn)錄物的上游啟動(dòng)子序列。使用CloneManagerProfessionalSuitev8從與TagA匹配的EST序列的5，端設(shè)計(jì)了PCR擴(kuò)增用反向基因特異性引物。使用Proml—la(GGCTAGCACCATGATGGTAGCAACAC)進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，對(duì)第二輪PCR反應(yīng)使用PromlJb(TGGCTGCCTATCTCGTCACACTCTTC)。將每個(gè)反應(yīng)的約5iLil在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，再藉由UV透照技術(shù)使用溴化乙錠使相應(yīng)的PCR產(chǎn)物顯像。為了比較，還電泳了5pl的Invitrogen(Carlsbad，CA)E-gelLowRangeQuantitativeDNALadder(圖2)。凝膠純化和克隆將約20|nl的每種第二輪PCR產(chǎn)物與5pi6xTAE上樣染料混合，并且在1.5%NuSieveGTGAgarose(CambrexBioScience,RocklandMEM氐炫點(diǎn)凝膠上在含溴化乙錠的lxTAE緩沖液中以60v進(jìn)行約2小時(shí)電泳。使用手持UVP(Upland,CA)UVM-57302nm透照燈使凝膠中存在的DNA條帶顯像，并且用潔凈的手術(shù)刀片從每個(gè)泳道切下最亮條帶。將凝膠切片在72。C熔化1分鐘，其后在需要用于載體連接之前將其保持在37°C。使用Promega(Madison,WI)pGEM-TEasyVector按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行半體積連接反應(yīng)(halfvolumeligations),將連接反應(yīng)物(ligation)置于冰上冷卻5分鐘(在添加熔化的凝膠PCR產(chǎn)物之后)，然后在室溫溫育過(guò)夜。將連接反應(yīng)物根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)克隆至OneShotTOP10ElectrocompTM大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中，其中將連接反應(yīng)物在72。C預(yù)熱1分鐘，再保持在37。C。將轉(zhuǎn)化反應(yīng)物鋪板至LBAmp/IPTG/X-gal瓊脂平板上，并且在37。C溫育過(guò)夜。使用AmershamBiosciences(Buckinghamshire,UK)的TempHPhiTMDNATemplateAmplificationKit的半反應(yīng)從每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)擴(kuò)增了8個(gè)陽(yáng)性菌落，并且使用M13正向和反向引物測(cè)序。所得數(shù)據(jù)確認(rèn)了圖2中箭頭所指的DNA條帶對(duì)應(yīng)于PCR引物所來(lái)源的EST序列數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。隨后挑取了源自這個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的約24個(gè)菌落并且在含Amp的LB中在37。C單獨(dú)培養(yǎng)過(guò)夜。質(zhì)粒純化^[吏用Qiagen(Hilden,Germany)QIAprepspinMiniprepKit4安照i兌明書(shū)進(jìn)行，并使用NanodropND-1000分光光度計(jì)(NanoDropTechnologies,WilmingtonDE)分析DNA濃度。測(cè)序和數(shù)據(jù)分析使用AppliedBiosystems(FosterCity,CA)BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit進(jìn)行了測(cè)序。為獲得全部EST序列使用了M13正向引物，而對(duì)于全部菌落和小量制備物測(cè)序則同時(shí)需要M13正向和反向引物。自動(dòng)DNA測(cè)序使用ABI3730x148毛細(xì)管DNA分析儀(capillaryDNAanalyser)(AppliedBiosystems)進(jìn)行。手動(dòng)4企查了來(lái)自正向和反向序列的lt據(jù)，并且組31合形成每個(gè)菌落或小量制備物的單一序列。其后使用MEGAv3.1(Kumar等2004)中的ClustalW(Higgins等1994)比對(duì)了小量制備物序列,并且用原始EST檢查了同源性。從全部匹配的小量制備物啟動(dòng)子序列裝配了單一的共有序列，并且藉由PLACE(http:〃www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)(Prestridge1991;Higo等1999)和PlantCARE(http:Vbioinformatics.psb.ugent.be/)(Lescot等2002)服務(wù)器篩選了調(diào)節(jié)元件。藉由基于網(wǎng)絡(luò)的PredictProtein服務(wù)器(http:〃www.predictprotein.org/)(Rost等2004)通過(guò)分析EST序列的推定編碼區(qū)作出了關(guān)于基因功能的假設(shè)。結(jié)果EST分析基于網(wǎng)絡(luò)的比較發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于Unigene簇Ta.2025的匹配TagA的EST序列(4個(gè)序列)，將所述序列下載并與我們的小麥EST文庫(kù)中存在的類(lèi)似序列比對(duì)(圖3)。在這些序列中觀察到了非常小的差異，并且觀察到的與末端多聚A序列相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度上的差異不改變推定的翻譯。由于這些EST轉(zhuǎn)錄物短且明確的性質(zhì)，指定推定的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始位點(diǎn)相對(duì)簡(jiǎn)單。在這點(diǎn)上，來(lái)自高等植物的mRNA轉(zhuǎn)錄物趨向于具有富含AU的前導(dǎo)序列(長(zhǎng)度<200bp)，并且翻譯通常起始于第一AUG密碼子(Joshi等1997)。使用網(wǎng)絡(luò)上可獲得的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(例如NCBI、PlantGDB、TIGR)通過(guò)對(duì)EST序列進(jìn)行多種核香酸和翻譯后氨基酸的比較來(lái)探尋相應(yīng)基因的推定功能，然而未觀察到與任何功能已知的基因的顯著同源性。然而，藉由PredictProtein對(duì)推定的翻譯后氨基酸序列進(jìn)行的基序和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)指出這種基因可能編碼一種小的微體相關(guān)蛋白(圖5)。啟動(dòng)子序列分析成功克隆并測(cè)序了約1300bp的推定TagA啟動(dòng)子序列的基因組DNA片段。獲得了許多與相應(yīng)的EST序列5'端相同的高度類(lèi)似序列(趨異性不大于2.1%)。比對(duì)了這些序列并且確定了共有序列(圖4)。分析共有序列的調(diào)節(jié)元件揭示了可能的(likely)TATA和CAAT框和幾種可能的胚乳元件的存在(表1)。還存在幾種涉及早期脫水和光應(yīng)答的元件，這說(shuō)明相應(yīng)的蛋白質(zhì)可能參與了滲透保護(hù)(osm叩rotection)。使用PLACE服務(wù)器檢測(cè)到的其它基因調(diào)節(jié)元件在表2中列出。討論在這個(gè)研究中，我們已經(jīng)為在發(fā)育中的種子中高表達(dá)的內(nèi)源小麥基因確定了新的啟動(dòng)子序列，這代表了開(kāi)發(fā)用于成功遺傳轉(zhuǎn)化小麥和其它谷類(lèi)顆粒的新表達(dá)盒的第一步。有趣的是，在該啟動(dòng)子序列中檢測(cè)到了與胚乳基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)元件。因此預(yù)期通過(guò)進(jìn)一步的研究，這種啟動(dòng)子序列可以用于將高表達(dá)的異源基因從小麥和其它植物物種遞送至種子的胚乳中。有意于這種目的的類(lèi)似研究已經(jīng)將高分子量(HMW)麥谷蛋白亞基基因的啟動(dòng)子作為目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)該基因具有胚乳特異性的表達(dá)(Lamacchia等2001)。對(duì)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄物的分析進(jìn)一步提出翻譯的蛋白質(zhì)可以被分泌至胚乳內(nèi)的蛋白微體。在這點(diǎn)上，由本研究中描述的轉(zhuǎn)錄序列編碼的蛋白質(zhì)信號(hào)肽(尤其是ARA微體信號(hào)序列)可以用于進(jìn)一步引導(dǎo)重組蛋白沿著分泌途徑并且進(jìn)入胚乳內(nèi)的蛋白質(zhì)體中。已經(jīng)將N-末端和C-末端信號(hào)序列用于引導(dǎo)重組蛋白在小麥胚乳中定位，最引人注目的是人血清白蛋白(Arcalis等2004)。需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定本研究中描述的蛋白質(zhì)的定位及其可能的功能。實(shí)施例2通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建經(jīng)遺傳修飾的小麥構(gòu)建體使用構(gòu)建體pEvec202N"w來(lái)制備用于小麥轉(zhuǎn)化的所有構(gòu)建體。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列、CaMV35S啟動(dòng)子與妳W5r(下文稱(chēng)作她序列)的轉(zhuǎn)錄融合物將通過(guò)PCR生成，諸如Furtado，A.和Henry，R丄(2006),PlantBiotechnologyJournal^421-434中所述。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥和稻的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因小麥通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的對(duì)胚發(fā)生愈傷組織的轉(zhuǎn)化來(lái)生成。在無(wú)菌條件下從小麥種子分離胚。將用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌在MGL培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)于接種，使用Eppendorf移液器將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物液滴置于未成熟的胚的切面(cutside)上。將平板在黑暗中于24。C溫育約2天之后，將胚轉(zhuǎn)移至含有BCI-DM培養(yǎng)基的平板中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有潮霉素和特美汀(timentin)。暗溫育約6周之后(每?jī)芍苻D(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中)，將產(chǎn)生的胚發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有潮霉素的FHG培養(yǎng)基。在移入土壤之前，將生成的苗轉(zhuǎn)移至BCI培養(yǎng)基中發(fā)育出根。對(duì)來(lái)自GFP的綠色熒光的檢測(cè)使用配備有熒光觀察用附件的復(fù)式顯微鏡進(jìn)行。為了確定轉(zhuǎn)基因的存在，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行PCR篩選，其中使用純化的基因組DNA。通過(guò)PCR篩選所有潮霉素抗性植物的序列(諸如根據(jù)Furtado,A.和Henry,R丄(2006)，PlantBiotechnologyJournalii421-434)。Southern印跡雜交基本上根據(jù)已經(jīng)確立的規(guī)程進(jìn)行(Maniatis等，1982)。將來(lái)自未轉(zhuǎn)化或經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的基因組DNA用///m/III消化并且檢查消化產(chǎn)物，之后在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行解離(resolve),其后轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Nylon-hybond，Roche,Germany)上。使用對(duì)應(yīng)于她基因的Dig標(biāo)記的探針進(jìn)^f亍雜交，其后使用Dig檢測(cè)系統(tǒng)顯示信號(hào)(Roche，Germany)。實(shí)施例3通過(guò)粒子轟擊構(gòu)建經(jīng)遺傳修飾的小麥用于粒子轟擊的構(gòu)建體質(zhì)粒pAGN是一種基于pGEM3Zf+的載體(PromegaCorporation,Ml,USA)并且含有綠色焚光蛋白基因的合成變體(g^S657^(Patterson等，1997)和"cw終止子序列，將所述質(zhì)粒作為克隆載體用于生成啟動(dòng)子構(gòu)建體。將啟動(dòng)物制備。質(zhì)粒pAGN也將^H乍i!"隆載體來(lái)生成基因構(gòu)建:p;/.g/^mw、它們含有玉米泛素、花椰菜花葉病毒35SRNA啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與她基因和"w終止子序列相連。使用質(zhì)粒pDP687作為對(duì)照來(lái)檢查成功的粒子轟擊和細(xì)胞存活力，該質(zhì)粒含有花椰菜花葉病毒35SRNA啟動(dòng)子(CaMV35S)，其調(diào)控兩個(gè)基因的組成型表達(dá)，兩個(gè)基因各自編碼調(diào)節(jié)紅色花色素苷色素合成的轉(zhuǎn)錄因子。組織制備、粒子轟擊和溫育條件如Furtado，A.和Henry,R丄(2006),PlantBiotechnologyJournal1:421-434中所述進(jìn)行。整篇說(shuō)明書(shū)的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不是將本發(fā)明限定為任何一種實(shí)施方案或具體的特征的集合。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，在本文內(nèi)容的啟發(fā)下，在不背離本發(fā)明范圍的前提下，可以對(duì)示例的具體實(shí)施方案進(jìn)行多種修飾和改變。將本文涉及的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。參考文獻(xiàn)Arcalis,E.，S.Marcel,F.Altmann,D.Kolarich,G.Drakakaki，R.Fischer,P.ChristouandE.Stoger(2004).UnexpectedDepositionPatternsofRecombinantProteinsinPost-EndoplasmicReticulumCompartmentsofWheatEndosperm10.1104/pp.l04.050153.PlantPhysiol.136(3):3457-3466.*Bairoch，A.,P.BucherandK.Hofman(1997).PROSITE.NucleicAcidsResearch25:217-221.Brinch-Pedersen，H.,F.Hatzack，L.D.SorensenandRB.Holm(2003).Concertedactionofendogenousandheterologousphytaseonphyticaciddegradationinseedoftransgenicwheat(7H"c畫(huà)ae幼V臓L.).TransgenicRes.12:649-659.Drea,S.,D.J.Leader,B.C.Arnold,P.Shaw,L.DolanandJ.H.Doonan(2005).SystematicSpatialAnalysisofGeneExpressionduringWheatCaryopsisDevelopment.PlantCell17(8):2172-2185.Higgins,D.,J.Thompson,T.Gibson,J.D.Thompson,D.G.HigginsandG.T.J.(1994).CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsResearch22:4673-4680.Higo，K.，Y.Ugawa,M.IwamotoandT.Korenaga(1999).Plantcis-actingregulatoryDNAelements(PLACE)database:1999.NucleicAcidsResearch27(1):297-300.Joshi，C.P.,H.Zhou,X.HuangandV.L.Chiang(1997).contextsequences35oftranslationinitiationcodoninplants.PlantMolecularBiology35:993-1001.Kumar,S.,K.TamuraandM.Nei(2004).MEGA3:IntegratedsoftwareforMolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisandsequencealignment.BriefingsinBioinformatics5:150-163.Lamacchia,C.,P.R.Shewry，N.DiFonzo,J.L.Forsyth,N.Harris,P.A.Lazzeri,J.A.Napier,N.G.HalfordandP.Barcelo(2001).Endosperm-specificactivityofastorageproteingenepromoterintransgenicwheatseed.JournalofExperimentalBotany52(355):243-250.Lescot，M.,P.D6hais，G.Thijs,K.Marchal,Y.Moreau,Y.VandePeer,P.Rouz6andS.Rombauts(2002).PlantCARE,adatabaseofplantcis-actingregulatoryelementsandaportaltotoolsforinsilicoanalysisofpromotersequences.NucleicAcidsResearch30(1):325-327.Mcintosh,S.,L.Watson,P.Bundock,A.C.Crawford,J,White,GCordeiro,D.Barbary,L.RookeandR.J.Henry(2006).SAGEofthemostabundanttranscriptsinthedevelopingwheatcaryopsis.ThePlantJournalinpress.Prestridge,D.S.(1991).SIGNALSCAN:AcomputerprogramthatscansDNAsequencesforeukaryotictranscriptionalelements.CABIOS7:203-206.*Rost,B.(1996).PHD.MethodsinEnzymology266:525-539.*Rost,B.,P.FariselliandR.Casadio(1996).PHDhtm.ProteinScience7:1704-1718.Rost,B.，G.YachdevandJ.Liu(2004).ThePredictProteinServer.NucleicAcidsR6S6arch32(WebServerissue):W321-W326.Shewry,P.R.andH.D.Jones(2005).Transgenicwheat:wheredowestandafterthefirst12yearsAnnalsofAppliedBiology147(1):1-14.St6ger，E.，J.K.C.Ma,R.FischerandP.Christou(2005).Sowingtheseedsofsuccess:pharmaceuticalproteinsfromplants.CurrentOpinioninBiotechnology16(2):167-173.St6ger,E.,M.Parker,P.ChristouandR.Casey(2001).PeaLeguminOverexpressedinWheatEndospermAssemblesintoanOrderedParacrystallineMatrix.PlantPhysiol.125:1732-1742.表格表l:啟動(dòng)子共有序列中存在的可能的植物調(diào)節(jié)元件*距轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)多少bp基序鏈距離*序列質(zhì)粒元件+-2ATAGAATATA框+-31TATAAATCAAT框+-49CAAAT光應(yīng)答元件+-65ACTTTGE框+-83CAAATGE框+-176CACTTGE框+-193CAGCTGE框+-236CATATG晝夜節(jié)律元件+-371CAANNNNATCE框+-619CATGTG胚乳特異性元件+-654AACAAAC谷醇溶蛋白框+-835TGCAAAGAE框+-1033CATTTG未折疊蛋白應(yīng)答+-1153CCNNNNNNNNNNNNCCACG脫水應(yīng)答元件+-1072CTAACCA37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表2:在共有啟動(dòng)子序列中測(cè)得的其它基因調(diào)節(jié)元件因子或位點(diǎn)名稱(chēng)位置(鏈)信號(hào)序列-10PEHVPSBD位點(diǎn)87(+)TATTCT-300C0RE位點(diǎn)563(-)TGTAAAG-.300ELEMENT位點(diǎn)562(-)TGHAAARK-300ELEMENT位點(diǎn)1128(-)TGHAAARK2SSREDPR0TBANAPA位點(diǎn)145(+)CAAACACAACAC0RE0SGLUB1位點(diǎn)656AACAAACA服1':LATERD1位點(diǎn)171(-)ACGTGABRELATERD1位點(diǎn)931(-)ACGTG八CGTAB腦0TIFA20SEM位點(diǎn)169(-)ACGTGKCACGTATERD1位點(diǎn)172wACGTACGTATERD1位點(diǎn)932(+)ACGTACGTATERD1位點(diǎn)1202(+)ACGTACGTATERD1位點(diǎn)172(-〉A(chǔ)CGTACGTATERD1位點(diǎn)932(-)ACGT/1C(;TA1'ERD1位點(diǎn)1202(-)ACGTACGTOSGL眼位點(diǎn)931(-)GTACGTGANAER01CONSENSUS位點(diǎn)655(+)AAACAAA八NAER01C0NSENSUS位點(diǎn)334(-)AAACAAAAR1':1位點(diǎn)304(-)RGTGACGCARFAT位點(diǎn)527(+)TGTCTCAR卩AT位點(diǎn)1213(+)TGTCTCARFAT位點(diǎn)350(-)TGTCTCARIHAT位點(diǎn)295(十)NGATTARR1AT位點(diǎn)393(+)NGATTARR1AT位點(diǎn)794(+)NGATTARR1AT位點(diǎn)846(十)NGATTARR1AT位點(diǎn)227(+)NGATT證1AT位點(diǎn)677(+)NGATTA1"UAT位點(diǎn)740(+)NGATTARR1AT位點(diǎn)130(-)NGATT證1AT位點(diǎn)748(-)NGATTA1;R1AT位點(diǎn)802(-)NGATT纖1A丁位點(diǎn)8]6(-)NGATTAIR1AT位點(diǎn)854(-)NGATT,憶1AT位點(diǎn)894(-)NGATTARR1AT位點(diǎn)1271(-)NGATTASF腦TIFCAMV位點(diǎn)1363TGACGASF1,IFCAMV位點(diǎn)386(-)TGACGASF腦T1FCAMV位點(diǎn)1203(-)TGACGB0XCPSAS1位點(diǎn)250(-)CTCCCAC130X1INTPATPB位點(diǎn)1308(+)ATAGAA,IPCCHS位點(diǎn)169(-)ACGTGGCBP50SWX位點(diǎn)171(-)CAACGTGCAATB0X1位點(diǎn)199(+)CAATCAATB0X1位點(diǎn)486(+)CAATCAATB0X1位點(diǎn)629(+)CAATCAATB0X1位點(diǎn)703CAAT<image>imageseeoriginaldocumentpage39</image>D0FC0REZM位點(diǎn)728(+)AAAGl)O卜'COREZM位點(diǎn)918(+)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)1301(+)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)1333(+)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)102(-)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)344(-)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)369(_)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)471(-)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)563(-)AAAGD0PC0REZM位點(diǎn)1086(-)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)1128(-)AAAGD0FC0REZM位點(diǎn)1238(-)AAAG1〕()1環(huán)EZM位點(diǎn)1246(-)AAAG1)PBFC0REDCDC3位點(diǎn)1156(+)ACACNNGD1)I5FC0REDCDC3位點(diǎn)691(-)ACACNNGDI)I仆、C0REDCDC3位點(diǎn)1136(-)ACACNNG1H0NSENSUS位點(diǎn)1223(-)WTTSSCSSEB0XB醒PA位點(diǎn)15(+)CANNTGEBOXBNNAPA位點(diǎn)277(+)CA,GEBOXBNNAPA位點(diǎn)691(+)CANNTGliBOXB,APA位點(diǎn)1074(+)CANNTGEBOXBNNAPA位點(diǎn)1117(+)CANNTGEBOXB剛APA位點(diǎn)1134(+)CANNTGE130XBNNAPA位點(diǎn)1227(+)CA瞎GM()XB醒PA位點(diǎn)15(-)C扁TGI':I3()XBNNAPA位點(diǎn)277(-)CA剛TG1:B0XBNNAPA位點(diǎn)691(_)CA薩GI':I50XBNNAPA位點(diǎn)1074(-)CA,TGKBOXB隨APA位點(diǎn)1117(-)CANNTGEBOXBNNAPA位點(diǎn)1134(-)CA剛TGEB(JXBNNAPA位點(diǎn)1227(-)C緒NTGELREC0REPCRP1位點(diǎn)611(+)TTGACC1':MHVCH0KD位點(diǎn)562(-)TGTAAAGTGATA隨位點(diǎn)672(+)GATAGATABOX位點(diǎn)1056GATAn雄BOX位點(diǎn)1287(+)GATA(;ATAB0X位點(diǎn)1369(+)GATA(;ATABOX位點(diǎn)620(-)GATAG八TAB0X位點(diǎn)945(-)GATAGATABOX位點(diǎn)955(-)GATAGATAB0X位點(diǎn)1220(-)GATA(;CCCORE位點(diǎn)264(+)GCCGCC(;T1CONSENSUS位點(diǎn)605(+)GRWAAW(;T1CONSENSUS位點(diǎn)297(-)G隨AWGT1CONSENSUS位點(diǎn)875(-)GRWAAWGT1CONSENSUS位點(diǎn)1129(-)GRWAAW(;TlCONSENSUS位點(diǎn)1239(-)G隨AW(;TICORE位點(diǎn)1348(-)GGTTAA(;T1GMSCAM4位點(diǎn)1129(-)GAAAAAGTGANTG10位點(diǎn)1362(+)GTGA(;TGANTGIO位點(diǎn)310(-)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)388(-)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)591(-)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)622(-)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)750(—)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)804(-)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)856(-)GTGAGTGANTG10位點(diǎn)1133(-)GTGAHEXMOTIFTAH3H4位點(diǎn)1202(+)ACGTCAMARTB0X位點(diǎn)648(-)TTWTWTTWTTMYB1AT位點(diǎn)432(+)WAACCAMYB1AT位點(diǎn)238(+)WAACCAMYB1AT位點(diǎn)1194(-)WAACCAMYB2AT位點(diǎn)33(-)TAACTGMYB2C0NSENSUSAT位點(diǎn)33(-)YAACKGMYB2C0NSENSUSAT位點(diǎn)214(-)YAACKGMYBATRD22位點(diǎn)237wCTAACCAMYBCORE位點(diǎn)33(+)CNGTTRMYBCORE位點(diǎn)214(+)CNGTTRMY13C0RE位點(diǎn)221CNGTTRMYBCORE位點(diǎn)1049(-)CNGTTRMYBPZM位點(diǎn)810(+)CCWACCMYBST1位點(diǎn)671(+〉GGATAMYBST1位點(diǎn)1220(-)GGATAMYCATERD1位點(diǎn)691(+)CATGTGMYCATRD22位點(diǎn)691(-)CACATGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)15(+)CA剛TGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)277(+)CA匿GMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)691(+)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1074(+)CA離GMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1117(+)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1134(+)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1227(+)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)15(-)CA薩TGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)277(-)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)691(-)CA,GMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1074(-)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1117(-)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1134(-)CANNTGMYCCONSENSUSAT位點(diǎn)1227(-)CANNTGNAPl畫(huà)Tl剛位點(diǎn)692(-)TACACATN0I)C0N2GM位點(diǎn)188CTCTTN0DC0N2GM位點(diǎn)1334(-)CTCTTN0DC0N2GM位點(diǎn)1356(-)CTCTTNTBBF1ARR0LB位點(diǎn)562(+)ACTTTANTBBF1ARR0LB位點(diǎn)462(-)ACTTTANTBBF1ARR0LB位點(diǎn)917(-)ACTTTA0SE2R00TN0DULE位點(diǎn)188(+)CTCTT0SE2R00TN0DULE位點(diǎn)1334(-)CTCTT()SE2R00T曙ULE位點(diǎn)1356(-)CTCTTP1BS位點(diǎn)84(+)GNATATNC位點(diǎn)84(-)GNATATNCTOLASK;l位點(diǎn)651(+)AATAAAK)LASIGl位點(diǎn)992(+)AATAAA卩OUSIGl位點(diǎn)376(-)AATAAATOLASIG1位點(diǎn)599(-)AATAAAP0LASIG2位點(diǎn)371(-)AATTAAATOUSIG3位點(diǎn)648(+)AATAATP0LLEN1LELAT52位點(diǎn)104)AGAAAPOLLEN1LELAT52位點(diǎn)194(-)AGAAAPOLLEN1LELAT52位點(diǎn)770(-)AGAAAPREATPRODH位點(diǎn)12(+)ACTCATPREATPRODH位點(diǎn)357wACTCATPREATPRODH位點(diǎn)912(-)ACTCATPR0LAMINB0X0SGLUB1位點(diǎn)474(+)TGCAAAGPR0LAMINB0X0SGLUB1位點(diǎn)471(-)TGCAAAGPYRIMIDINEB0X0SRAMY1A位點(diǎn)101(+)CCTTTTPYRIMIDINEB0X0SRAMY1A位點(diǎn)1085(+)CCTTTTQF丄EMENTZMZM13位點(diǎn)612AGGTCARAV1AAT位點(diǎn)1049CAACARAV1AAT位點(diǎn)77(-)CAACARAV1AAT位點(diǎn)1249(-)CAACAR1':AL卩HALGLHCB21位點(diǎn)433(+)AACCAA固LPHALGI細(xì)21位點(diǎn)812(+)AACCAAREBETALGLHCB21位點(diǎn)1220(-)CGGATAR0()TM0TIFTAP0X1位點(diǎn)73(+)ATATT1《00TM0T[FTAP0X1位點(diǎn)86(+)ATATTR00TM0TIFTAP0X1位點(diǎn)1149(-)ATATTRYREPEATBNNAPA位點(diǎn)137(+)CATGCARYREPEATLEGUM1NB0X位點(diǎn)137(+)CATGCAYS1卜'B0XS0RPS1L21位點(diǎn)45(-)ATGGTAS1FB0XS0RPS1L21位點(diǎn)69(-)ATGGTAS1FB0XSORPS1L21位點(diǎn)111(-)ATGGTAS1PB0XS0RPS1L21位點(diǎn)980(-)ATGGTAS哪CONSSTPRIOA位點(diǎn)526(+)YTGTCWCSEBFCONSSTPR10A位點(diǎn)1212wYTGTCWCS哪CONSSTPRIOA位點(diǎn)350(-)YTGTCWCSEF4M0TIFGM7S位點(diǎn)337(+)RTTTTTRS1TEIIATCYTC位點(diǎn)1303(-)TGGGCYS0RLIP1AT位點(diǎn)169(+)GCCACS0RLIP1AT位點(diǎn)901(+)GCCACS0RLIP1AT位點(diǎn)273(-)GCCACSV40COREENHAN位點(diǎn)1193(+)GTGGWWHGSV40C0REE隠N位點(diǎn)237(-)GTGGWWHGT/GB0XATP1N2.'位點(diǎn)171(-)AACGTGTAAAGSTKST1".位點(diǎn)364(+)TAAAGTAAAGSTKST1位點(diǎn)462(+)TAAAGTAAAGSTKST1位點(diǎn)663(+)TAAAG'「AAAGSTKST1位點(diǎn)917(+〉TAAAGTAAAGSTKST1位點(diǎn)1332(+)TAAAGTAAAGSTKST1位點(diǎn)563(-)TAAAGTATAB0X2位點(diǎn)1279wTATAAATTATAB0X4位點(diǎn)93(+)TATATAATATAB0X4位點(diǎn)92(-)TATATAATA'!'AB0X5位點(diǎn)596(+)TTATTTTATAB0X5位點(diǎn)991(-)TTATTTTBOXATGAPB位點(diǎn)1245(+)ACTTTGTGACGTVMAMY位點(diǎn)1202(-)TGACGTU1，0T1F11AT位點(diǎn)156(+)CCN關(guān)NN麵,CCACGVSF1PVG蹈8位點(diǎn)211(+)GCTCCGTTGWB0XATNPR1位點(diǎn)611(+)TTGACWB0XATNPR1位點(diǎn)1204(-)TTGACWB0XHVIS01位點(diǎn)38(-)TGACTWB0XNTERP3位點(diǎn)612(+)TGACYWB0XNTERF3位點(diǎn)38(-)TGACYWB0XNTERF3位點(diǎn)308(-)TGACYWB0XNTERF3位點(diǎn)446(_)TGACYWRKY710S位點(diǎn)612(+)TGACWRKY710S位點(diǎn)臓(+)TGACWRKY710S位點(diǎn)1099(+)TGAC麗Y710S位點(diǎn)1363(+)TGACWRKY710S位點(diǎn)39(-)TGACWRKY710S位點(diǎn)135(_)TGACWRKY710S位點(diǎn)309(-)TGACWRKY710S位點(diǎn)387(-)TGACWRKY710S位點(diǎn)447(-)TGACWRKY710S位點(diǎn)590(-)TGACWRKY710S位點(diǎn)1204(-)TGAC4權(quán)利要求1.一種分離的核酸，其包含對(duì)應(yīng)于基因的啟動(dòng)子活性區(qū)的核苷酸序列，所述基因包含編碼SEQIDNO28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列。2.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述啟動(dòng)子活性區(qū)包含SEQIDNO:l中所示的核苦酸序列，或其變體。3.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中所述變體包含與SEQIDNO:1中所示核香酸序列具有至少50%序列同一性的核苷酸序列。4.權(quán)利要求2的分離的核酸，其中所述變體包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;SEQIDNO:8;SEQIDNO:9;SEQIDNO:10;SEQIDNO:ll;SEQIDNO:12;SEQIDNO:13;SEQIDNO:14;和SEQIDNO:15。5.—種分離的核酸，其包含SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列，或其變體。6.權(quán)利要求5的分離的核酸，其中所述變體包含選自下組的核苷酸序列SEQIDNO:2;SEQIDNO:3;SEQIDNO:4;SEQIDNO:5;SEQIDNO:6;SEQIDNO:7;SEQIDNO:8;SEQIDNO:9;SEQIDNO:10;SEQIDNO:11;SEQIDNO:12;SEQIDNO:13;SEQIDNO:14;和SEQIDNO:15。7.權(quán)利要求5的分離的核酸，其中所述變體與SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列具有至少50%序列同一性。8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的分離的核酸，所述分離的核酸包含SEQIDNO:l中所示的核香酸序列的生物學(xué)活性片段，或其變體。9.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述生物學(xué)活性片段是啟動(dòng)子活性片段。10.—種分離的基因，其包含權(quán)利要求l、2、5或8中任一項(xiàng)的分離的核酸，所述分離的核酸與編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列可搡作地連接。11.一種嵌合基因，其包含權(quán)利要求l、2、5或8中任一項(xiàng)的分離的核酸，所述分離的核酸與異源核酸可操作地連接。12.權(quán)利要求ll的嵌合基因，其中所述異源核酸編碼生物學(xué)活性蛋白。13.—種遺傳構(gòu)建體，其包含選自下組的分離的核酸以及一種或多種其它核芬酸序列權(quán)利要求l、2、5或8中任一項(xiàng)的分離的核酸；權(quán)利要求10的分離的基因；編碼SEQIDNO:28的可轉(zhuǎn)錄DNA序列和權(quán)利要求11的嵌合基因。14.權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體，其中所述一種或多種其它核苷酸選自下組轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯增強(qiáng)子、用于在原核生物中自主復(fù)制的核苷酸序列、用于mRNA加工的調(diào)節(jié)元件、選擇性標(biāo)記和可篩選標(biāo)記。15.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的遺傳構(gòu)建體，其是表達(dá)載體。16.權(quán)利要求15的遺傳構(gòu)建體，其中所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求1、2、5或8中任一項(xiàng)的分離的核酸。17.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的遺傳構(gòu)建體，其是表達(dá)構(gòu)建體。18.權(quán)利要求17的遺傳構(gòu)建體，其中所述表達(dá)構(gòu)建體包含權(quán)利要求10的分離的基因或權(quán)利要求11的嵌合基因。19.權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體，其特征在于所述分離的核酸能夠指導(dǎo)在小麥胚乳中的轉(zhuǎn)錄。20.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體。21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其源自植物。22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述植物是谷類(lèi)。23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其中所述谷類(lèi)是小麥。24.—種產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法包括向植物宿主細(xì)胞或組織引入權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體的步驟，其中所述遺傳構(gòu)建體能夠產(chǎn)生所述重組蛋白。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述植物宿主細(xì)胞或組織源自谷類(lèi)。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述谷類(lèi)是小麥。27.—種促進(jìn)表達(dá)耙向于植物胚乳的方法，其中所述方法包括在植物胚乳中表達(dá)權(quán)利要求11的嵌合基因的步驟。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述植物是谷類(lèi)。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述植物是小麥。30.—種經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，其包含權(quán)利要求l、2、5或權(quán)利要求8中任一項(xiàng)的分離的核酸。31.權(quán)利要求30的經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，其中所述經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物與相應(yīng)的未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物相比具有改變的表型。32.權(quán)利要求31的經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，其中所述改變的表型由異源核酸的表達(dá)產(chǎn)生。33.權(quán)利要求30的經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，所述植物是谷類(lèi)。34.權(quán)利要求33的經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物，其中所述谷類(lèi)是小麥。35.—種分離的核酸，其編碼包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)。36.—種分離的多肽，其由權(quán)利要求35的分離的核酸編碼。37.—種抗體或其片段，其結(jié)合權(quán)利要求36的分離的多肽或其片段。全文摘要本發(fā)明提供分離的核酸序列，其包含對(duì)應(yīng)于DNA序列的啟動(dòng)子活性區(qū)的核苷酸序列，其中所述分離的核酸序列源自谷類(lèi)種子。分離的核酸序列可用于在谷類(lèi)種子的特定組織內(nèi)調(diào)控高水平的基因表達(dá)。還提供包含所述分離的核酸序列(或其變體)與可轉(zhuǎn)錄序列可操作地連接的遺傳構(gòu)建體，使用所述遺傳構(gòu)建體產(chǎn)生重組蛋白的方法和促進(jìn)靶物表達(dá)至植物胚乳的方法。文檔編號(hào)C12N15/05GK101541958SQ200780044161公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年10月4日優(yōu)先權(quán)日2006年10月4日發(fā)明者彼得·C·邦多克,羅伯特·J·亨利,艾利森·C·克勞福德申請(qǐng)人:谷物食品Crc有限公司