選擇性核酸片段回收的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于核酸純化以及片段選擇與回收的方法和試劑盒。通過調(diào)節(jié)結(jié)合緩沖液的鹽濃度和/或pH，只有具有所需尺寸范圍的核酸片段能夠在某些鹽濃度和/或pH條件下可逆地并且非特異性地結(jié)合到固體表面，并且可以隨后在水和/或低鹽洗脫緩沖液中從所述固體表面洗脫和/或回收。
【專利說明】選擇性核酸片段回收
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年6月1日提交的美國臨時申請序列號61/689,221的優(yōu)先權(quán)， 這個臨時申請以其全文引用的方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及用于核酸純化以及片段尺寸選擇與回收的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 許多分子生物學(xué)應(yīng)用，如毛細(xì)管電泳、核苷酸測序，需要分離高質(zhì)量的核酸制劑。 質(zhì)量是用于所有測序方法以及用于基因治療方案的毛細(xì)管電泳的特別重要的因素。數(shù)量也 是用于一些應(yīng)用的同等重要的考慮因素，例如，大規(guī)模基因組作圖和測序計劃，其需要產(chǎn)生 成千上萬個高質(zhì)量的DNA模板。
[0006] 如下一代測序（Next Generation Sequencing ;NGS)的新型技術(shù)的出現(xiàn)需要在 DNA片段的某些群組的精確尺寸控制下的高質(zhì)量的DNA樣品制備。在DNA片段化或剪切之 后，用于下一代測序的文庫構(gòu)建過程主要需要與平臺無關(guān)的片段選擇。片段選擇后獲得高 回收率正成為用于減小測序偏差的重要的貢獻(xiàn)因素。舉例來說，為了制備用于Illumina NGS平臺的DNA文庫，在150-500bp范圍內(nèi)的DNA片段的回收對于較好的測序結(jié)果來說是關(guān) 鍵的。其它NGS平臺需要范圍介于300-700bp之間的DNA片段。
[0007] 存在兩種常用方法來進(jìn)行尺寸選擇以用于NGS文庫制備。一種方法是將片段化的 DNA運行到瓊脂糖凝膠中，然后切割具有所選的DNA尺寸的凝膠，然后從凝膠回收DNA片段。 這種方法是精密的，但非常緩慢并且是勞動密集型的。
[0008] 用來準(zhǔn)備片段化的DNA的尺寸選擇的另一種通常使用的方法是通過調(diào)節(jié)聚乙二 醇（PEG)和鹽的濃度使DNA結(jié)合于涂布有官能團(tuán)（如羧基）的磁性小珠上。參看美國專利 號6, 534, 262。這種方法有效地使DNA片段化并且可以在自動化平臺中容易地適應(yīng)以一次 性處理大量樣品。然而，當(dāng)DNA片段大于400bp時，這種方法不會很好地工作以使DNA片段 化。不需要的大DNA片段降低了后續(xù)NGS結(jié)果的數(shù)據(jù)質(zhì)量并且浪費了儀器的能力。對于需 要大DNA片段的NGS平臺，例如用于Roche 454 Genome Sequencer的NGS平臺，這種方法 并不適合。
[0009] 美國專利號5, 234, 809描述了一種使用固相粒子以在離液鹽存在下特異性地和/ 或非特異性地結(jié)合來自樣品的核酸的方法，這些離液鹽如胍鹽、碘化鈉和碘化鉀。然而，這 種方法并未提供對核酸片段的任何尺寸控制。
[0010] 因此，下一代測序（NGS)的不斷增長的應(yīng)用需要新的核酸純化與片段尺寸選擇方 法，這些方法提供了高的核酸回收率和精確的片段尺寸控制。 發(fā)明概要
[0011] 本發(fā)明提供了用于核酸純化與片段尺寸選擇的方法和試劑盒。在某些實施方案 中，本發(fā)明提供了一種選擇性地回收核酸片段的方法，其包括：a)將目標(biāo)核酸與具有選定 pH和鹽濃度的結(jié)合緩沖液混合以允許具有所需尺寸范圍的核酸片段結(jié)合到固體表面；b) 將來自步驟a)的混合物施加到固體表面以使得只有具有所需尺寸范圍的核酸片段可逆地 并且非特異性地結(jié)合到固體表面；以及c)通過用洗脫緩沖液從固體表面洗脫結(jié)合的核酸 片段來選擇性地回收具有所需尺寸范圍的結(jié)合的核酸片段。
[0012] 在某些實施方案中，本發(fā)明方法中所用的結(jié)合緩沖液包含離液鹽。離液鹽的實例 包括（但不限于）鹽酸胍（GHCl)、硫氰酸胍（GITC)、碘化鈉（NaI)和高氯酸鈉，以及其混合 物。在某些實施方案中，結(jié)合緩沖液的離液鹽的濃度經(jīng)過調(diào)節(jié)以使得只有具有所需尺寸范 圍的某些核酸片段能夠可逆地并且非特異性地結(jié)合到固體表面，并且隨后用洗脫緩沖液從 固體表面洗脫。在某些實施方案中，鹽酸胍（GHCl)或硫氰酸胍（GITC)的濃度介于0. 8-5. OM 之間；碘化鈉（NaI)的濃度介于0. 8-7. OM之間；并且高氯酸鈉的濃度介于I. 0-7. OM之間。 在某些實施方案中，結(jié)合緩沖液中的離液鹽濃度是通過用水稀釋結(jié)合緩沖液來調(diào)節(jié)。
[0013] 本發(fā)明提供了，通過調(diào)節(jié)結(jié)合緩沖液中的離液鹽濃度，只有具有所需尺寸范圍的 某些核酸片段能夠結(jié)合到固體表面，不需要的核酸片段與結(jié)合緩沖液一起保留在樣品混合 物中，并且在離心后被棄去。在某些實施方案中，固體表面包括（但不限于）二氧化硅膜濾 柱或二氧化硅涂布的磁性微粒（小珠）。在某些實施方案中，核酸片段包括（但不限于）DNA 片段、RNA片段或PNA片段。
[0014] 在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種從二氧化硅膜濾柱選擇性地回收具有小于 或等于100bp、小于或等于200bp或小于或等于300bp的所需尺寸范圍的DNA片段的方法。 本發(fā)明方法包括將目標(biāo)DNA樣品（例如，100 μ 1)與包含4M硫氰酸胍（GITC，pH 7.0)的結(jié) 合緩沖液（例如，100 μ 1)混合，其中在將每種混合物獨立地施加到二氧化硅膜柱中之前， 用200 μ 1、300 μ 1或400 μ 1水進(jìn)一步稀釋每種DNA樣品混合物（總共200 μ 1)。只有小于 或等于IOObp的DNA片段當(dāng)用200 μ 1水稀釋時在約I. OM的GITC的最終濃度下、小于或等 于200bp的DNA片段當(dāng)用300 μ 1水稀釋時在約0. 8Μ的GITC的最終濃度下、以及小于或等 于300bp的DNA片段當(dāng)用400 μ 1水稀釋時在約0. 7Μ的GITC的最終濃度下，能夠結(jié)合到二 氧化硅膜柱，并且隨后從二氧化硅膜柱洗脫并在水和/或含有低鹽的洗脫緩沖液中回收。 每種混合物的PH為約7. 0并且由于與DNA樣品混合的結(jié)合緩沖液而可能稍有變化。
[0015] 在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種從二氧化硅涂布的微粒選擇性地回收具有 小于或等于200bp、小于或等于300bp或小于或等于400bp的所需尺寸范圍的DNA片段的方 法。本發(fā)明方法包括將目標(biāo)DNA樣品與包含4M硫氰酸胍（GITC)的結(jié)合緩沖液混合，其中 在將每種混合物進(jìn)一步與二氧化硅涂布的微粒組合之前，用200 μ 1、300 μ 1或400 μ 1水進(jìn) 一步稀釋每種DNA樣品混合物。只有小于或等于200bp的DNA片段當(dāng)用200 μ 1水稀釋時 在約I. OM的GITC的最終濃度下、小于或等于300bp的DNA片段當(dāng)用300 μ 1水稀釋時在約 0. 8Μ的GITC的最終濃度下、以及小于或等于400bp的DNA片段當(dāng)用400 μ 1水稀釋時在約 0. 7Μ的GITC的最終濃度下，能夠結(jié)合到二氧化硅涂布的微粒，并且隨后從微粒洗脫并在水 和/或含有低鹽的洗脫緩沖液中回收。類似地，每種混合物的PH為約7. 0并且由于與DNA 樣品混合的結(jié)合緩沖液而可能稍有變化。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種通過調(diào)節(jié)過程中所用的結(jié)合緩沖液的鹽濃度或pH或兩 者來選擇性地回收具有所需尺寸范圍的核酸片段的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明提供 了一種選擇性地回收具有所需尺寸范圍的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段的方法。本 發(fā)明方法包括以下步驟：a)通過將目標(biāo)核酸與第一結(jié)合緩沖液混合來提供第一樣品混合 物，其中所述第一結(jié)合緩沖液的鹽濃度或PH經(jīng)過調(diào)節(jié)以只允許較大的核酸片段，例如大于 700bp的DNA片段結(jié)合到固體表面；b)將來自步驟a)的所述第一樣品混合物施加到第一固 體表面；c)收集從第一固體表面與第一樣品混合物離心而得的流通溶液；d)通過將流通溶 液與第二結(jié)合緩沖液混合來提供第二樣品混合物，其中所述第二結(jié)合緩沖液的鹽濃度或pH 經(jīng)過調(diào)節(jié)以只允許具有較小的所需尺寸范圍的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段結(jié)合 到固體表面；e)將來自步驟d)的第二樣品混合物施加到第二固體表面；以及e)通過從所 述第二固體表面洗脫結(jié)合的核酸片段并在水和/或包含低鹽的洗脫緩沖液中將其回收來 選擇性地洗脫并回收具有較小的所需尺寸范圍的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段。
[0017] 本發(fā)明提供了，DNA結(jié)合能力隨著結(jié)合緩沖液中的離液鹽濃度與pH的組合而變 化。在某些實施方案中，當(dāng)結(jié)合緩沖液含有最終濃度為約I. OM的GITC時，在約5. 33的pH 下，具有500bp或更高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約4. 92的pH下，具有 400bp或更高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約3. 44的pH下，具有300bp或更 高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約2. 57的pH下，具有250bp或更高的大多數(shù) DNA片段能夠結(jié)合到固體表面（參看下表的說明）。
[0018] 在其它實施方案中，當(dāng)結(jié)合緩沖液含有最終濃度為約2. 5M的GITC時，在約5. 67 的pH下，具有IOObp或更高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約5. 75的pH下，具 有IlObp或更高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約5. 83的pH下，具有120bp或 更高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約5. 90的pH下，具有130bp或更高的大多 數(shù)DNA片段能夠結(jié)合到固體表面；在約5. 96的pH下，具有HObp或更高的大多數(shù)DNA片段 能夠結(jié)合到固體表面；并且在約6. 02的pH下，具有150bp或更高的大多數(shù)DNA片段能夠結(jié) 合到固體表面（參看下表的說明）。
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種選擇性地回收具有所需尺寸范圍的核酸片段的方法，其包括： a) 將目標(biāo)核酸與具有選定pH和鹽濃度的結(jié)合緩沖液混合以允許具有所述所需尺寸范 圍的所述核酸片段結(jié)合到固體表面； b) 將來自步驟a)的混合物施加到所述固體表面以使得具有所述所需尺寸范圍的所述 核酸片段可逆地并且非特異性地結(jié)合到所述固體表面；以及 c) 通過用洗脫緩沖液從所述固體表面洗脫所述結(jié)合的核酸片段來選擇性地回收具有 所述所需尺寸范圍的所述核酸片段。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述結(jié)合緩沖液包含選自由以下組成的群組的離液 鹽：濃度介于〇. 8-5. 0M之間的鹽酸胍（GHC1)、濃度介于0. 8-5. 0M之間的硫氰酸胍（GITC)、 濃度介于〇. 8-7. 0M之間的碘化鈉（Nal)、濃度介于1. 0-7. 0M之間的高氯酸鈉，以及其混合 物。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述結(jié)合緩沖液的所述離液鹽濃度是用一定量的水 來調(diào)節(jié)，這允許具有所述所需尺寸范圍的所述核酸片段結(jié)合到所述固體表面并且隨后從所 述固體表面洗脫。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述固體表面是二氧化硅膜濾柱或二氧化硅涂布的 磁性微粒。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述核酸片段是DNA片段、RNA片段或PNA片段。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中當(dāng)所述結(jié)合緩沖液中GITC的最終濃度為約1. 0M時， 具有小于或等于l〇〇bp的所需尺寸范圍的DNA片段結(jié)合到二氧化硅膜濾柱并且隨后從二氧 化硅膜濾柱洗脫。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中當(dāng)所述結(jié)合緩沖液中GITC的最終濃度為約0. 8M時， 具有小于或等于200bp的所需尺寸范圍的DNA片段結(jié)合到二氧化硅膜濾柱并且隨后從二氧 化硅膜濾柱洗脫。
8. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中當(dāng)GITC的最終濃度為約0. 7M時，具有小于或等于 300bp的所需尺寸范圍的DNA片段結(jié)合到二氧化硅膜濾柱并且隨后從二氧化硅膜濾柱洗 脫。
9. 一種選擇性地回收具有所需尺寸范圍的核酸片段的方法，其包括： a) 通過將目標(biāo)核酸與第一結(jié)合緩沖液混合來提供第一樣品混合物，其中所述第一結(jié)合 緩沖液的鹽濃度或pH經(jīng)過調(diào)節(jié)以允許較大的核酸片段結(jié)合到固體表面； b) 將來自步驟a)的所述第一樣品混合物施加到第一固體表面； c) 收集從所述第一固體表面與所述第一樣品混合物離心而得的流通溶液； d) 通過將所述流通溶液與第二結(jié)合緩沖液混合來提供第二樣品混合物，其中所述第二 結(jié)合緩沖液的鹽濃度或pH經(jīng)過調(diào)節(jié)以允許具有較小的所需尺寸范圍的核酸片段結(jié)合到固 體表面； e) 將來自步驟d)的所述第二樣品混合物施加到第二固體表面；以及 f) 通過用洗脫緩沖液從所述第二固體表面獨立地洗脫所述結(jié)合的核酸片段來選擇性 地回收具有所述較小的所需尺寸范圍的所述核酸片段。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一或第二結(jié)合緩沖液包含選自由以下組成 的群組的離液鹽：濃度介于0. 8-5. 0M之間的鹽酸胍（GHC1)、濃度介于0. 8-5. 0M之間的硫 氰酸胍（GITC)、濃度介于0. 8-7. 0M之間的碘化鈉（Nal)，以及濃度介于1. 0-7. 0M之間的高 氯酸鈉。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一結(jié)合緩沖液包含酸或其酸性鹽，以降低所 述結(jié)合緩沖液的pH以便促進(jìn)較大的核酸片段結(jié)合到所述固體表面。
12. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第二結(jié)合緩沖液包含堿或其堿性鹽，以提高所 述結(jié)合緩沖液的pH以便去除較小的核酸片段。
13. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中具有較小的所需尺寸范圍的所述核酸片段介于 150bp 與 700bp 之間。
14. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述結(jié)合緩沖液的pH范圍介于5. 5與7. 5之間。
15. -種用于核酸片段選擇與回收的試劑盒，其包含： a) 用于核酸片段選擇性地結(jié)合到固相的一種或多種結(jié)合緩沖液； b) 涂布有官能團(tuán)的一種或多種固相； c) 用于核酸純化與回收的其它試劑；以及 d) 提供用于核酸片段選擇與回收的方案的說明書。
16. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述固相是二氧化硅膜濾柱或二氧化硅涂布的 磁性微粒。
17. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述用于核酸純化與回收的試劑包含洗滌緩沖 液、洗脫緩沖液或水。
【文檔編號】C12N15/10GK104350152SQ201380030305
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月1日
【發(fā)明者】奇·郭 申請人:歐米伽生物技術(shù)公司