一株超高放氫藻株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株放氫藻株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供重組萊茵衣藻，為將質(zhì)粒pChlamiRNA3導(dǎo)入萊茵衣藻中，得到重組萊茵衣藻。所述萊茵衣藻為萊茵衣藻CC400。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將pChlamiRNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入萊茵衣藻藻種CC400（mt+）中，得到重組萊茵衣藻，且在重組萊茵衣藻中篩選得到突變?cè)逯?1號(hào)，在用氣相色譜測(cè)定其產(chǎn)氫量時(shí)，突變?cè)逯?1號(hào)與野生型相比，持續(xù)產(chǎn)氫時(shí)間更長(zhǎng)，達(dá)到600小時(shí)（野生型產(chǎn)氫時(shí)間可達(dá)到200小時(shí)）；總產(chǎn)氫量更高，達(dá)到13349毫升/升培養(yǎng)物（野生型可達(dá)到300毫升/升培養(yǎng)物）,是野生型的44.5倍。
【專利說明】一株超高放氫藻株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一株超高放氫藻株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由于礦物資源的日益枯竭，尋找清潔的替代能源已成為一項(xiàng)迫切的課題。氫是宇宙間最簡(jiǎn)單同時(shí)也是最為豐富的元素，被普遍認(rèn)為是一種最有吸引力的替代能源。傳統(tǒng)的化學(xué)產(chǎn)氫方法采用電解水或熱解石油、天然氣，生產(chǎn)成本也普遍較高。藻類光合制氫是微藻利用太陽能裂解水釋放氫氣的生物過程，是實(shí)現(xiàn)氫能可持續(xù)生產(chǎn)的重要途徑之一。
[0003]萊茵衣藻是古老的單細(xì)胞真核綠藻，廣泛用于光合作用與產(chǎn)氫機(jī)理研究。其遺傳轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單，基因組測(cè)序已于2007年完成，這為工程藻株的獲得奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。高放氫藻株的篩選一直是國際前沿?zé)狳c(diǎn)，主要是圍繞著降低天線色素含量，提高光能利用率等方面開展相關(guān)研究工作。高放氫藻株的獲得，不僅對(duì)于科學(xué)研究有重要意義，而且在氫能源的開發(fā)應(yīng)用方面也有廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組萊茵衣藻。
[0005]本發(fā)明提供的重 組萊茵衣藻，為將質(zhì)粒pChlamiRNA3導(dǎo)入萊茵衣藻中，得到重組萊茵衣藻。
[0006]上述重組萊茵衣藻中，所述萊茵衣藻為萊茵衣藻CC400。
[0007]上述重組萊茵衣藻中，所述重組萊茵衣藻為萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突變?cè)逯?1號(hào)，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8706。
[0008]上述的重組萊茵衣藻在產(chǎn)氫中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種獲得氫的方法。
[0010]本發(fā)明提供的獲得氫的方法，為發(fā)酵上述的重組萊茵衣藻，得到氫。
[0011 ] 上述方法中，所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為缺硫TAP培養(yǎng)液。
[0012]上述方法中，所述發(fā)酵條件為25°C、連續(xù)光照、持續(xù)攪拌，所述發(fā)酵時(shí)間為0-600小時(shí)，且不為O。
[0013]上述方法中，所述光照的強(qiáng)度為110 μ Es-lm-2,所述攪拌的轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0014]本發(fā)明中萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)突變?cè)逯?1號(hào)，于2013年12月31日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8706，分類命名為萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
[0015]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將pChlamiRNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入萊茵衣藻藻種CC400 (mt+)中，得到重組藻株，且在重組藻株中篩選得到突變?cè)逯?1號(hào)，在用氣相色譜測(cè)定其產(chǎn)氫量時(shí)，突變?cè)逯?1號(hào)與野生型相比，持續(xù)產(chǎn)氫時(shí)間更長(zhǎng)，達(dá)到600小時(shí)(野生型產(chǎn)氫時(shí)間可達(dá)到200小時(shí));總產(chǎn)氫量更高，達(dá)到13349毫升/升培養(yǎng)物(野生型可達(dá)到300毫升/升培養(yǎng)物)，是野生型的44.5倍。與已有報(bào)道相比，本發(fā)明中所述藻株產(chǎn)氫時(shí)間更持久，產(chǎn)氫量更高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為重組藻株的產(chǎn)氫量檢測(cè)(0_120h)
[0017]圖2為突變?cè)逯甑漠a(chǎn)氫量檢測(cè)(0_600h)
【具體實(shí)施方式】
[0018]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，部分如下:
[0020]萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻種 CC400 (mt+)(以下也稱為野生型藻株)和質(zhì)粒pChlamiRNA3均購自杜克大學(xué)萊茵衣藻中心(Chlamy center, http://www.chlamy.0rg/);質(zhì)粒pChlamiRNA3中均含有巴龍霉素抗性基因。
[0021]下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基:
[0022]I) TAP 培養(yǎng)液:NH4Cl0.4g/L ;MgS04.7Η200.lg/L ;CaCl2.2Η200.05g/L ;K2HPO40.108g/L ；KH2PO40.056g/L ；Trisbase2.423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其余為水。
[0023]亨特微量兀素(Hunter，strace elements):H3BO4I1.4g/L、ZnSO4.7Η2022.0g/L、MnCl2.4H205.06g/L、CoCl2.6H201.61g/L、CuSO4.5H201.57g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.1Og/UFeSO4.7H204.99g/L，其余為水。
[0024]2)缺硫 TAP 培養(yǎng)液(g/L) =NH4Cl0.4g/L ；MgCl2.6H200.08g/L ；CaCl2.2H200.05g/L ；K2HP040.108g/L ；KH2PO40.056g/L ；Trisbase2.423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其余為水。
[0025]缺硫亨特微量兀素(Hunter，strace elements):H3BO4I1.4g/L> ZnCl2I0.42g/L>MnCl2.4H205.06g/L、CoCl2.6H201.61g/L、CuCl2.2H201.07g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.1Og/UFeCl2.4H203.57g/L，其余為水。
[0026]3)固體TAP培養(yǎng)基:在TAP培養(yǎng)液中加1.5% (質(zhì)量百分含量)的瓊脂粉。
[0027]4)含有巴龍霉素的培養(yǎng)基配方為:在固體TAP培養(yǎng)基中，加入100ug/ml巴龍霉素水溶液，使巴龍霉素在含有巴龍霉素的培養(yǎng)基中的終濃度為lOug/ml。
[0028]實(shí)施例1、產(chǎn)氫萊茵衣藻的獲得
[0029]1、培養(yǎng)
[0030]用TAP固體培養(yǎng)基培養(yǎng)萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC400藻株:配制TAP液體培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌20分鐘，待培養(yǎng)液溫度降到室溫后，用接種針從固體培養(yǎng)基上挑取萊茵衣藻單克隆到TAP培養(yǎng)液中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中的搖床上連續(xù)光照培養(yǎng)(25°C，60rpm，110 μ Es^iT2)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，得到 CC400 藻液。
[0031]固體培養(yǎng)時(shí)，將單克隆轉(zhuǎn)到TAP固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。
[0032]2、重組萊茵衣藻的獲得
[0033]將質(zhì)粒pChlamiRNA3線性化，并用玻璃珠法轉(zhuǎn)化藻種CC400，具體步驟如下:[0034]稱取0.1g玻璃珠(425-600um,Sigma)置于1.5ml離心管中，121°C滅菌20分鐘后，放于室溫待用。將IOOul CC400藻液和IOul pChlamiRNA3質(zhì)粒(Kpn I線性化)加入上述盛有玻璃珠的離心管中，在vortex (Genie2)上，7檔震動(dòng)15秒后，室溫25°C放置4分鐘。用移液器將藻液轉(zhuǎn)移到新鮮的TAP培養(yǎng)液中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中的搖床上連續(xù)光照培養(yǎng)24小時(shí)后(25°C，60rpm，110 μ Es—V2)，2500rpm離心，收集沉淀用TAP培養(yǎng)液懸起后，涂在含有巴龍霉素(10ug/ml)的培養(yǎng)基平板上，能夠生長(zhǎng)的藻株，為重組萊茵衣藻。
[0035]3、產(chǎn)氫突變?cè)逯甑暮Y選
[0036]I)藻株培養(yǎng)
[0037]將上述2得到的重組萊茵衣藻分別接到盛150ml正常TAP培養(yǎng)液的三角瓶中；當(dāng)0D750值達(dá)到1.5時(shí)，再將其轉(zhuǎn)到已加入磁轉(zhuǎn)子的500ml培養(yǎng)液中；待0D750值達(dá)到1.5左右時(shí)，收集培養(yǎng)物。
[0038]2)、產(chǎn)氫量的測(cè)定
[0039](I) 25°C，2500rpm，離心上述I)收集的培養(yǎng)物5分鐘；倒掉上清液，收集細(xì)胞；
[0040](2)用缺硫TAP培養(yǎng)液漂洗I)收集的細(xì)胞兩次；將漂洗過的細(xì)胞用20ml左右缺硫培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；
[0041](3)取20 μ I懸浮細(xì)胞， 加入980 μ I缺硫培養(yǎng)液，再加入4ml丙酮，混勻，5000rpm，5分鐘；
[0042](4)取離心后的上清液,測(cè)定663nm和645nm處的吸光值,根據(jù)下面的公式計(jì)算總
葉綠素含量:
[0043]Chl (a+b ) =8.02 X 0D663+20.21 X 0D645
[0044](5)采用Schott培養(yǎng)瓶做放氫瓶，培養(yǎng)體系為100ml (加入缺硫TAP培養(yǎng)基)，計(jì)算最終葉綠素濃度達(dá)到20 μ g/ml所需的(I)步驟中的細(xì)胞原液體積，加入細(xì)胞，用缺硫TAP培養(yǎng)液補(bǔ)足到100ml ；
[0045](6)用石臘封住瓶口，以防止氣體外漏；
[0046](7)將培養(yǎng)瓶置于25°C，110 μ Es-lm-2培養(yǎng)箱中的磁力攪拌器(轉(zhuǎn)速200rpm)上連續(xù)光照培養(yǎng)(光照強(qiáng)度:110 μ Es-lm-2)，分別取不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定放氫量。
[0047]采用SHIMADZU GC-2014氣相色譜測(cè)定氫氣含量，載氣為氮?dú)?。測(cè)定時(shí)用Iml注射器吸取放氫瓶氣體部分500μ 1，注入進(jìn)樣孔，甲烷外標(biāo)法計(jì)算氣體體積。
[0048]Υ(甲烷體積，ul) =0.0002χ (X，峰面積)+0.708，R2 (相關(guān)系數(shù))=0.9979)
[0049]結(jié)果如圖1所示，可以看出，對(duì)獲得的多個(gè)突變?cè)逯赀M(jìn)行放氫量測(cè)定，到缺硫密閉培養(yǎng)120小時(shí)時(shí)，突變?cè)逯?1號(hào)產(chǎn)氫量可達(dá)到816毫升/升培養(yǎng)物，是野生型的3.5倍(野生型可達(dá)到232毫升/升培養(yǎng)物)，其余突變?cè)逯戤a(chǎn)氫量均與野生型相當(dāng)。這說明，與野生型相比，突變?cè)逯?1號(hào)具有更高的產(chǎn)氫能力。
[0050]將萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii )突變?cè)逯?1 號(hào)，于 2013 年 12 月 31 日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8706，分類命名為萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。
[0051]實(shí)施例2、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )突變?cè)逯?91 號(hào)的 CGMCCN0.8706 應(yīng)用[0052]為了進(jìn)一步確定突變?cè)逯?1號(hào)的持續(xù)產(chǎn)氫能力與產(chǎn)氫時(shí)間，對(duì)其產(chǎn)氫過程進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)，具體如下:
[0053]將萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突變?cè)逯?91 號(hào) CGMCC N0.8706 按照實(shí)施例1中的3的方法進(jìn)行培養(yǎng)和產(chǎn)氫檢測(cè)。以野生型藻株為對(duì)照。
[0054]結(jié)果如圖2所示，可以看出，到缺硫密閉培養(yǎng)200小時(shí)時(shí)，野生型藻株的產(chǎn)氫量達(dá)到最大值(300毫升/升培養(yǎng)物)，突變?cè)逯?1號(hào)的產(chǎn)氫量達(dá)到5744毫升/升培養(yǎng)物；且突變?cè)逯?1號(hào)產(chǎn)氫可一直持續(xù)到600小時(shí)，總產(chǎn)氫量達(dá)到13349毫升/升培養(yǎng)物，是野生型的44.5倍。 [0055]總之，突變?cè)逯?1號(hào)的持續(xù)產(chǎn)氫時(shí)間(600小時(shí))和產(chǎn)氫量(13349毫升/升培養(yǎng)物)均高于野生型(200小時(shí)，300毫升/升培養(yǎng)物)，高于已報(bào)道藻株，具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【權(quán)利要求】
1.重組萊茵衣藻,為將質(zhì)粒pChlamiRNA3導(dǎo)入萊茵衣藻中，得到重組萊茵衣藻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組萊茵衣藻，其特征在于:所述萊茵衣藻為萊茵衣藻CC400。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組萊茵衣藻，其特征在于:所述重組萊茵衣藻為萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )突變?cè)逯?91 號(hào)，其保藏號(hào)為 CGMCC N0.8706。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述的重組萊茵衣藻在產(chǎn)氫中的應(yīng)用。
5.一種獲得氫的方法，為發(fā)酵權(quán)利要求1-3中任一所述的重組萊茵衣藻，得到氫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵采用的培養(yǎng)基為缺硫TAP培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵條件為25°C、連續(xù)光照、持續(xù)攪拌，所述發(fā)酵時(shí)間為0-600小時(shí)，且不為O。
8.根據(jù)權(quán)利要求 7所述的方法，其特征在于:所述光照的強(qiáng)度為110yEs-lm-2，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為200rpm。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103710266SQ201410014492
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】黃芳, 趙磊, 陳梅, 張錦 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所