一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，涉及用DNA重組技術(shù)制備微生物，是一種運(yùn)用分子生物學(xué)和基因重組技術(shù)改造釀酒酵母細(xì)胞，構(gòu)建異丁醇產(chǎn)量高的釀酒酵母菌株的方法，步驟是：第一步，過(guò)量表達(dá)釀酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWF1基因質(zhì)粒的構(gòu)建；第二步，高產(chǎn)異丁醇的釀酒酵母菌株HBGDAL-103的構(gòu)建。本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的產(chǎn)異丁醇釀酒酵母細(xì)胞中由于過(guò)量表達(dá)ILV2、ILV3和ILV5基因?qū)е聫谋岬?-酮異戊酸中輔酶NADPH/NADP+的不平衡等因素而制約異丁醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高的缺陷。
【專利說(shuō)明】一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的技術(shù)方案涉及用DNA重組技術(shù)制備微生物，具體地說(shuō)是一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]異丁醇具有較小的揮發(fā)性、腐蝕性、較高的辛烷值和能量密度，且易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，是一種新型的具有巨大市場(chǎng)潛力的生物燃料。釀酒酵母由于其對(duì)異丁醇的耐受性較好、具有利用纖維素水解物的優(yōu)勢(shì)和自身具有合成異丁醇的優(yōu)勢(shì)基因的優(yōu)勢(shì)，可以作為生產(chǎn)異丁醇的優(yōu)勢(shì)宿主菌株。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中，產(chǎn)異丁醇釀酒酵母細(xì)胞中由于過(guò)量表達(dá)ILV2、ILV3和ILV5基因?qū)е聫谋岬?-酮異戊酸中輔酶NADPH/NADP+的不平衡，制約了異丁醇產(chǎn)量進(jìn)一步的提高，這些缺陷在圖6中顯示出來(lái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，是一種運(yùn)用分子生物學(xué)和基因重組技術(shù)改造釀酒酵母細(xì)胞，構(gòu)建異丁醇產(chǎn)量高的釀酒酵母菌株的方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的產(chǎn)異丁醇釀酒酵母細(xì)胞中由于過(guò)量表達(dá)ILV2、ILV3和ILV5基因?qū)е聫谋岬?-酮異戊酸中輔酶NADPH/NADP+的不平衡等因素而制約異丁醇廣量進(jìn)一步提聞的缺陷。 [0005]本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，宿主菌為釀酒酵母菌，同時(shí)轉(zhuǎn)入過(guò)量表達(dá)ILV2、ILV3、ILV5、ZffFl基因的質(zhì)粒YEplacl95-PGKlp-1LV2、YEplacl81_PGKlp_ILV3 和 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl_PGKlp-1LV5，其具體步驟是:
[0006]第一步，過(guò)量表達(dá)釀酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWFl基因質(zhì)粒的構(gòu)建
[0007](1.1)酵母W303-1A染色體的制備:將酵母菌W303-1A接種于5mL的YPD培養(yǎng)基中，在30°C振培過(guò)夜得培養(yǎng)液，將該培養(yǎng)液分裝到2個(gè)1.5mL的離心管中，用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心30s，取上清，加0.5mL水重懸，槍頭反復(fù)抽吸以分散菌體沉淀，然后用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心30s，收集菌體，于每支離心管中加入200 μ L破菌緩沖液重懸細(xì)胞，再于每支離心管中加入200 μ L體積的玻璃珠和ρΗ>7的200 μ L酚/氯仿液體，用6000rpm的速度振蕩4min，再加200 μ L緩沖液TE，快速振蕩，用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心5min，取上清，重復(fù)酚抽提至無(wú)中間沉淀相，然后加入ImL無(wú)水乙醇，顛倒混勻，用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心3min,棄上清，沉淀用0.4mL TE緩沖液溶解，然后加3 μ L的lmg/mL的RNA酶混合，于37°C溫育5min,再加入10 μ L的4mol/L的NaAc溶液及ImL的無(wú)水乙醇,顛倒混勻，于室溫下離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心3min，棄上清，干燥沉淀DNA，再用100 μ L的TE緩沖液溶解，得到酵母W303-1A染色體；
[0008](1.2)質(zhì)粒 YEplacl95-PGKlp'YEplacl81-PGKlp 和 YEplacl l2_PGKlp 的構(gòu)建[0009]擴(kuò)增PGKlpromoter基因:根據(jù)酵母W303-1A染色體上PGKl基因序列設(shè)計(jì)引物，引物 PGKlpromoter-U (BamH I )的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’，引物PGKlpromoter-D (Sal I )的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTMA AAGTAG3PCR反應(yīng)體系為:引物PGKlpromoter-U (BamH I )和PGKlpromoter-D (Sal I )為各I μ L、200 μ M的dNTP為4 μ L、10 X聚合酶緩沖液為5 μ L、酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L、雙蒸水38.25 μ L和聚合酶0.25 μ L ；PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min, 94°C變性30s, 58°C退火 30s, 72°C 延伸 lmin,得到 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 PGKlpromoter 基因；將 YEplacl95、YEplacl81、YEplacll2和擴(kuò)增的PGKlpromotor基因分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和BamH I消化，消化體系為:DNA5 μ L，Sal I和BamH I為各0.25 μ L，10X酶緩沖液2 μ L，加無(wú)菌水 12.5μ L，在 37°C條件下消化 IOmin ;用 T4 連接酶將 YEplacl95、YEplacl81、YEplacll2和PGKlpromotor基因的連接:在三個(gè)1.5mL離心管中分別加入YEplacl95、YEplacl81和YEplacl 12各(λ 5μ L~I μ L，再分別加入10 X T4連接酶緩沖液2 μ L、T4連接酶0.2 μ L、PGKlpromotor基因片段8 μ L,最后分別加無(wú)菌水至20 μ L總體積,在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到 YEplacl95-PGKlp、YEplacl81_PGKlp 和 YEplacl 12-PGKlp 質(zhì)粒;
[0010](1.3)質(zhì)粒 YEplacl95-PGKlp-1LV2 的構(gòu)建
[0011]根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ILV5基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ILV20RF-U的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’，引物 ILV20RF-D 的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3’ ；PCR 反應(yīng)體系為:引物 ILV20RF-U和ILV20RF-D各為1μ?，200μΜ的dNTP為4 μ L，IOX聚合酶緩沖液為5 μ L，釀酒酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L，雙蒸水為38.25 μ L,聚合酶為0.25 μ L ；PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ILV20RF基因dfYEplacl95-PGKlp和擴(kuò)增的ILV20RF基因片段分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I消化，消化體系為:DNA為5 μ L，用Sal I和Pst I各0.25 μ L，10 X酶緩沖液為2 μ L，加無(wú)菌水12.5μ L，在37°C條件下消化IOmin ;用T4連接酶將YEplacl95_PGKlp和ILV20RF基因連接:在1.5mL離心管中，加入10XT4連接酶緩沖液2μL、T4連接酶0.2μL、YEplacl95-PGKlp和ILV20RF基因片段的加入量分別為0.5 μ L~8 μ L，再用無(wú)菌水將總體積補(bǔ)至20 μ L，在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物，取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Eplacl95-PGKlp-1LV2 ；
[0012](1.4)質(zhì)粒 YEplacl81-PGKlp_ILV3 的構(gòu)建
[0013]根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ILV5基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ILV30RF-U的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’，引物 ILV30RF-D 的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3’ ；PCR 反應(yīng)體系為:引物 ILV30RF-U和ILV30RF-D各為1μ?，200μΜ的dNTP為4 μ L，IOX聚合酶緩沖液為5 μ L，釀酒酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L，雙蒸水為38.25 μ L,聚合酶為0.25 μ L ；PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ILV30RF基因dfYEplacl81-PGKlp和ILV30RF基因片段分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I消化，消化體系為:DNA為5 μ L，Sal I和Pst I各0.25 μ L，10 X酶緩沖液2 μ L，加無(wú)菌水12.5 μ L，在37°C條件下消化IOmin ;用T4連接酶將YEplacl81_PGKlp和ILV30RF基因連接:在1.5mL離心管中，加入IOXT4連接酶緩沖液2 μ L、T4連接酶0.2μ L、YEplacl81-PGKlp和ILV30RF基因片段的加入量分別為0.5μ L~8μ L，再加無(wú)菌水至總體積為20μ L，在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Eplacl81-PGKlp-1LV3 ；
[0014](1.5)質(zhì)粒 YEplacll2-PGKlp-1LV5 的構(gòu)建
[0015]根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ILV5基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ILV50RF-U的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’，引物 ILV50RF-D 的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’ ；PCR 反應(yīng)體系為:引物 ILV50RF-U 和ILV50RF-D各為1 μ L, 200 μ M的dNTP為4 μ L, 10 X聚合酶緩沖液為5 μ L，釀酒酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L，雙蒸水為38.25 μ L，聚合酶為0.25 μ L ;PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ILV50RF基因；將YEplacl 12-PGKlp和ILV50RF基因片段用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I消化，消化體系為:DNA為5yL，Sal I和Pst I各為0.25 μ L，10X酶緩沖液為2 μ L，加無(wú)菌水12.5 μ L，在37°C條件下消化IOmin ;用T4連接酶將YEplacl 12-PGKlp和ILV50RF基因連接:在1.5mL離心管中，加入IOXT4連接酶緩沖液2 μ L、T4連接酶0.2μ L、YEplacll2-PGKlp和ILV50RF基因片段的加入量分別為0.5μ L~8μ L，再加無(wú)菌水至總體積為20μ L，在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Eplacl 12-PGKlp-1LV5 ；
[0016](1.6)質(zhì)粒 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5 的構(gòu)建
[0017]質(zhì)粒YIplac211_PGKlp (Sal I /Xba I )的構(gòu)建:擴(kuò)增 PGKlpromoter 基因:根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上PGKl基因序列設(shè)計(jì)引物，引物PGKlpromoter-U (Sal I )的寡核苷酸序列為 5’ GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，引物 PGKlpromoter-D (Xba I )的寡核苷酸序列為 5’GGGCCCTCTAGATGTTTTATATTTGTTGTAAA AAGTAG3’;用釀酒酵母 W303-1A染色體為模版，用引物 PGKlpromoter-U(Sal I )和 PGKlpromoter-D (Xba I )做 PCR,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PGKlpromoter基因片段；將YIplac211和PGKlpromotor基因用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xba I在37°C條件下消化IOmin后失活；用1；連接酶將YIplac211和PGKlpromotor在16 °C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Iplac211-PGKlp(Sal I /Xba I );擴(kuò)增ZWFl-ORF基因:根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ZWFl基因序列設(shè)計(jì)引物，引物 ZWFIORF-U 的寡核苷酸序列為 5’ GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’，引物 ZWF10RF-D 的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’ ；用釀酒酵母W303-1A染色體為模版，用引物ZWF10RF-U和引物ZWF10RF-D做PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ZffFl-ORF 基因片段；將 YIplac211-PGKlp 和 ZffFlORF 基因片段用 Xba I 和 BamH I 在 37°C條件下消化IOmin后失活；用T4連接酶將Hplac211-PGKlp和ZWF10RF基因片在16°C條件下連接I~2h，把10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證得到質(zhì)粒nplac211-PGKlp-ZWFl ;以質(zhì)粒Hplac211-PGKlp-ZWFl為模板，用引物序列為 5’GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’的 PGKlpromoter-U (BamH I )和序列為5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’ 的 ZWF10RF-D 做 PCR，得到兩端都含有 BamH I 酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，將此PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YEplacll2-PGKlp-1LV5同時(shí)用BamH I消化IOmin后失活，用T4連接酶將兩片段在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物，取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到質(zhì)粒YEplacll2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV50
[0018]第二步，高產(chǎn)異丁醇的釀酒酵母菌株HBGDAL-103的構(gòu)建
[0019]將第一步中構(gòu)建的質(zhì)粒YEplacl95-PGKlp_ILV2、YEplacl81_PGKlp_ILV3 和YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5共同轉(zhuǎn)化入釀酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uraci 1/Tryptophan/Leucine固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3天后,篩選同時(shí)帶有這三個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建得到高產(chǎn)異丁醇的釀酒酵母菌株HBGDAL-103 (MATa leu2-3, 112ura3-ltrpl-92his3-ll, 15ade2-lcanl-100YEplacl95-PGKlp-1LV2YEplacl81-PGKlp-1LV3YEplaclI
2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5)0
[0020]大量實(shí)驗(yàn)證明:經(jīng)上述方法一定能構(gòu)建出一種高產(chǎn)異丁醇的釀酒酵母菌株HBGDAL-103ο
[0021]上述一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，所用的原料物均是公知的并從商購(gòu)獲得，其中:
[0022]大腸桿菌E.coli ToplO購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。
[0023]宿主菌釀酒酵母菌為釀酒酵母菌株W303-1A (MATa leu2_3, 112ura3-ltrpl_92his
3-11，15ade2-lcanl_10 0(Thomasand Rothstein, 1989))。
[0024]質(zhì)粒Hplac211、YEplacl95、YEplacl81:YEplacll2 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。
[0025]引物來(lái)自北京奧科鼎盛生物科技有限公司。
[0026]擔(dān)體DNA (Single-stranded DNA)來(lái)自 Sigma-Aldrich 公司。
[0027]PEG400 為 50%PEG80% (v/v)UOxTE (ρΗ7.5) 10% 和 IOx 乙酸鋰貯存液 10%
[0028]LB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基:1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物和l%NaCl，用NAOH調(diào)pH=7.5，于121°C下滅菌15min，冷卻至室溫加入氨芐青霉素，至終濃度為Ig氨芐青霉素/L，得到LB液體培養(yǎng)基。
[0029]LB固體培養(yǎng)基:在調(diào)好pH值為7.5的LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉，于121 °C下滅菌15min，冷卻至室溫加入氨芐青霉素，至終濃度為Ig氨芐青霉素/L，得到LB固
體培養(yǎng)基。
[0030]YPD液體培養(yǎng)基:1%酵母提取物和2%蛋白胨，在pH自然條件下，于121°C下滅菌15min,再加入單獨(dú)滅菌的40%葡萄糖至終濃度為2%。
[0031]YPD固體培養(yǎng)基:在YPD液體培養(yǎng)基中加入1.5% (w/v)瓊脂粉，于121°C下滅菌15min。
[0032]完全極限培養(yǎng)基(CM):0.67%YNB(Bacto Yeast Nitrogen Base without AminoAcids (Difco))和 0.83g/L Dropout Power，其中 Dropout Power 由以下成分構(gòu)成:腺票呤50mg/L、亮氨酸100m/L、精氨酸20mg/L、賴氨酸30mg/L、天冬氨酸100mg/L、甲硫氨酸20mg/L、谷氨酸100mg/L、苯丙氨酸50mg/L、組氨酸100mg/L、絲氨酸150mg/L、異亮氨酸30mg/L、蘇氨酸150mg/L、色氨酸100mg/L、酪氨酸30mg/L、尿嘧唳50mg/L、繳氨酸150mg/L。
[0033]省卻特定的氨基酸成分，可做成選擇培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為5.6，固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為6.5，再加入1.5%的瓊脂，于121°C滅菌15min。
[0034]上述涉及的％，除特別注明的之外，均為質(zhì)量百分比。
[0035]上述一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，所述釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法是:
[0036](I)將平板上的釀酒酵母菌株接入5ml液體YPD中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
[0037](2 )將擔(dān)體DNA (2mg/ml)于沸水浴煮5分鐘后，置于冰上；
[0038](3)取1.5ml釀酒酵母培養(yǎng)液，13000rpm離心30sec,收集菌體,棄上清；
[0039](4)往離心管中加入360 μ I的轉(zhuǎn)化混合物，在漩渦分離器上高速振蕩混勻。轉(zhuǎn)化混合物的配置如下:
【權(quán)利要求】
1.一種釀酒酵母異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:宿主菌為釀酒酵母菌，同時(shí)轉(zhuǎn)入過(guò)量表達(dá)ILV2、ILV3、ILV5、ZffFl基因的質(zhì)粒YEplacl95_PGKlp_ILV2、YEplacl81-PGKlp-1LV3 和 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl_PGKlp-1LV5，其具體步驟是: 第一步，過(guò)量表達(dá)釀酒酵母ILV2、ILV3、ILV5和ZWFl基因質(zhì)粒的構(gòu)建(1.0酵母W303-1A染色體的制備:將酵母菌W303-1A接種于5mL的YPD培養(yǎng)基中，在30°C振培過(guò)夜得培養(yǎng)液，將該培養(yǎng)液分裝到2個(gè)1.5mL的離心管中，用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心30s，取上清，加0.5mL水重懸，槍頭反復(fù)抽吸以分散菌體沉淀，然后用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心30s，收集菌體，于每支離心管中加入200 μ L破菌緩沖液重懸細(xì)胞，再于每支離心管中加入200 μ L體積的玻璃珠和ρΗ>7的200 μ L酚/氯仿液體，用6000rpm的速度振蕩4min，再加200 μ L緩沖液TE，快速振蕩，用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心5min，取上清，重復(fù)酚抽提至無(wú)中間沉淀相，然后加入ImL無(wú)水乙醇，顛倒混勻，用離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心3min,棄上清，沉淀用0.4mL TE緩沖液溶解，然后加3 μ L的lmg/mL的RNA酶混合，于37°C溫育5min,再加入10 μ L的4mol/L的NaAc溶液及ImL的無(wú)水乙醇,顛倒混勻，于室溫下離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm離心3min，棄上清，干燥沉淀DNA，再用100 μ L的TE緩沖液溶解，得到酵母W303-1A染色體；
(1.2)質(zhì)粒 YEplacl95-PGKlp、YEplacl81_PGKlp 和 YEplacl 12-PGKlp 的構(gòu)建擴(kuò)增PGKlpromoter基因:根據(jù)酵母W303-1A染色體上PGKl基因序列設(shè)計(jì)引物，引物PGKlpromoter-U(BamH I )的寡核苷酸序列為:5’ GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’，引物PGKlpromoter-D (Sal I )的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTMA AAGTAG3PCR反應(yīng)體系為:引物PGKlpromoter-U (BamH I )和PGKlpromoter-D (Sal I )為各I μ L、200 μ M的dNTP為4 μ L、10 X聚合酶緩沖液為5 μ L、酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L、雙蒸水38.25 μ L和聚合酶0.25 μ L ；PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min, 94°C變性30s, 58°C退火 30s, 72°C 延伸 lmin,得到 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 PGKlpromoter 基因；將 YEplacl95、YEplacl81、YEplacll2和擴(kuò)增的PGKlpromotor基因分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和BamH I消化，消化體系為:DNA5 μ L，Sal I和BamH I為各0.25 μ L，10X酶緩沖液2 μ L，加無(wú)菌水 12.5 μ L，在 37°C條件下消化 IOmin ;用 T4 連接酶將 YEplacl95、YEplacl81、YEplacl 12和PGKlpromotor基因的連接:在三個(gè)1.5mL離心管中分別加入YEplacl95、YEplacl81和YEplacl 12各(λ 5μ L~I μ L，再分別加入10 X T4連接酶緩沖液2 μ L、T4連接酶0.2 μ L、PGKlpromotor基因片段8 μ L,最后分別加無(wú)菌水至20 μ L總體積,在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到 YEplacl95-PGKlp、YEplacl81_PGKlp 和 YEplacl 12-PGKlp 質(zhì)粒; (1.3)質(zhì)粒 YEplacl95-PGKlp-1LV2 的構(gòu)建 根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ILV5基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ILV20RF-U的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCGTCGACATGATCAGACAATCTACGCT3’，引物 ILV20RF-D 的寡核苷酸序列為:5，GGGCCCCTGCAGCGTTTAGCTGGCTCCTGATG3，；PCR反應(yīng)體系為:引物 ILV20RF-U和 ILV20RF-D各為IyLJOOyM的dNTP為4yL，IOX聚合酶緩沖液為5 μ L，釀酒酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L，雙蒸水為38.25 μ L，聚合酶為0.25 μ L ;PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min，94°C變性 30s，58°C退火30s，72°C延伸 2min，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ILV20RF基因；將 YEplacl95_PGKlp和擴(kuò)增的ILV20RF基因片段分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I消化，消化體系為:DNA為5 μ L，用Sal I和Pst I各0.25 μ L，10 X酶緩沖液為2 μ L，加無(wú)菌水12.5 μ L，在37°C條件下消化IOmin ;用T4連接酶將YEplacl95-PGKlp和ILV20RF基因連接:在1.5mL離心管中，加入IOXT4連接酶緩沖液2 μ L、T4連接酶0.2μ L、YEplacl95-PGKlp和ILV20RF基因片段的加入量分別為0.5μ L~8μ L，再用無(wú)菌水將總體積補(bǔ)至20μ L，在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物，取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Eplacl95-PGKlp-1LV2 ； (1.4)質(zhì)粒 YEplacl81-PGKlp-1LV3 的構(gòu)建 根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ILV5基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ILV30RF-U的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCGTCGACATGGGCTTGTTAACGAAAGT3’，引物 ILV30RF-D 的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCCTGCAGGTAGAGGTGGCTTCGTCGTA3，；PCR反應(yīng)體系為:引物 ILV30RF-U和 ILV30RF-D各為IyLJOOyM的dNTP為4yL，IOX聚合酶緩沖液為5 μ L，釀酒酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L，雙蒸水為38.25 μ L，聚合酶為0.25 μ L ;PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min，94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ILV30RF基因；將 YEplacl81_PGKlp和ILV30RF基因片段分別用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I消化，消化體系為:DNA為5 μ L，Sal I和Pst I各0.25 μ L，IOX酶緩沖液2 μ L，加無(wú)菌水12.5 μ L，在37 °C條件下消化IOmin ;用1\連接酶將YEplacl81-PGKlp和ILV30RF基因連接:在1.5mL離心管中，加入IOXT4連接酶緩沖液2 μ L、T4連接酶0.2 μ L、YEplacl81_PGKlp和ILV30RF基因片段的加入量分別為0.5 μ L~8 μ L，再加無(wú)菌水至總體積為20 μ L，在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Eplacl81-PGKlp-1LV3 ； (1.5)質(zhì)粒 YEplacl 12-PGKlp-1LV5 的構(gòu)建 根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ILV5基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ILV50RF-U的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCGTCGACATGTTGAGAACTCAAGCCGC3’，引物 ILV50RF-D 的寡核苷酸序列為:5’GGGCCCCTGCAGACGTGACTTGACGAGTTG5’ ;PCR 反應(yīng)體系為:引物 ILV50RF-U和 ILV50RF-D 各為1 μ L, 200 μ M的dNTP為4 μ L，10 X聚合酶緩沖液為5 μ L，釀酒酵母W303-1A染色體為模版0.5 μ L,雙蒸水為38.25 μ L,聚合酶為0.25 μ L ；PCR反應(yīng)條件為:94°C變性4min, 94°C變性30s，58°C退火 30s，72°C延伸 2min，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ILV50RF基因 ^fYEplacl 12-PGKlp 和ILV50RF基因片段用限制性內(nèi)切酶Sal I和Pst I消化，消化體系為:DNA為5μ L，Sal I和Pst I各為0.25 μ L，IOX酶緩沖液為2 μ L，加無(wú)菌水12.5 μ L，在37°C條件下消化IOmin ；用T4連接酶將YEplacl 12-PGKlp和ILV50RF基因連接:在1.5mL離心管中，加入10 X T4連接酶緩沖液2μL、T4連接酶0.2μL、YEplaC112-PGKlp和ILV50RF基因片段的加入量分別為0.5 μ L~8 μ L，再加無(wú)菌水至總體積為20 μ LA 16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到 YEplacl 12-PGKlp-1LV5 ； (1.6)質(zhì)粒 YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5 的構(gòu)建 質(zhì)粒YIplac211-PGKlp(Sal I /Xba I )的構(gòu)建:擴(kuò)增PGKlpromoter基因:根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上PGKl基因序列設(shè)計(jì)引物，引物PGKlpromoter-U (Sal I )的寡核苷酸序列為 5’GGGCCCGTCGACAGGCATTTGCAAGAATTACTC3’，引物 PGKlpromoter-D (Xba I )的寡核苷酸序列為 5’GGGCCCTCTAGATGTITTATAITTGTTGTAAA AAGTAG3’;用釀酒酵母W303-1A染色體為模版，用引物 PGKlpromoter-U (Sal I )和 PGKlpromoter-D (Xba I )做 PCR，得到 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物PGKlpromoter基因片段；將Hplac211和PGKlpromotor基因用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xba I在37°C條件下消化IOmin后失活；用T4連接酶將YIplac211和PGKlpromotor在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物；取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到Y(jié)Iplac211_PGKlp (Sal I /Xba I );擴(kuò)增ZffFl-ORF基因:根據(jù)釀酒酵母W303-1A染色體上ZWFl基因序列設(shè)計(jì)引物，引物ZWF10RF-U的寡核苷酸序列為 5’ GGGCCCTCTAGAATGAGTGAAGGCCCCGTCAA3’，引物 ZWF10RF-D 的寡核苷酸序列為:5 ’ GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3 ’ ；用釀酒酵母 W303-1A 染色體為模版，用引物ZWF10RF-U和引物ZWF10RF-D做PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ZWFl-ORF基因片段；將YIplac211-PGKlp和ZWF10RF基因片段用Xba I和BamH I在37°C條件下消化IOmin后失活；用T4連接酶將YIplac211-PGKlp和ZWF10RF基因片在16 °C條件下連接I~2h，把IOuL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證得到質(zhì)粒YIplac211-PGKlp-ZffFl ;以質(zhì)粒 Hplac211-PGKlp-ZWFl 為模板，用引物序列為 5’GGGCCCGGATCCAGGCAITTGCAAGAATTACTC3’的 PGKlpromoter-U (BamH I )和序列為 5’GGGCCCGGATCCACACGCAAGTAGAGAGGAGT3’的ZWF10RF-D做PCR，得到兩端都含有BamH I酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，將此PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒YEplacl 12-PGKlp-1LV5同時(shí)用BamH I消化IOmin后失活，用T4連接酶將兩片段在16°C條件下連接I~2h得到連接產(chǎn)物，取10 μ L該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建得到質(zhì)粒YEplacll2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV50 第二步，高產(chǎn)異丁醇的釀酒酵母菌株HBGDAL-103的構(gòu)建 將第一步中構(gòu)建的質(zhì)粒 YEplacl95-PGKlp-1LV2、YEplacl81_PGKlp_ILV3 和YEplacl 12-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5共同轉(zhuǎn)化入釀酒酵母野生型菌株W303-1A，在CM-uraci 1/Tryptopha n/Leucine固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3天后,篩選同時(shí)帶有這三個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建得到高產(chǎn)異丁醇的釀酒酵母菌株HBGDAL-103 (MATa leu2-3, 112ura3-ltrpl-92his3-ll, 15ade2-lcanl-100YEplacl95-PGKlp-1LV2YEplacl81-PGKlp-1LV3YEplaclI2-PGKlp-ZWFl-PGKlp-1LV5)0
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103789341SQ201410033944
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】張愛利, 李楊, 高玉菡 申請(qǐng)人:河北工業(yè)大學(xué)