大豆逆境誘導基因啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個大豆逆境誘導啟動子GmNCED1，它涉及到以大豆（吉育72）基因組DNA為模板，利用染色體步移技術克隆GmNCED1基因啟動子。GmNCED1基因啟動子可以受鹽堿、干旱、植物激素ABA以及低溫脅迫所誘導，對鹽脅迫極為敏感，基因主要在植物的根部表達；更適合利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品種；為基因工程育種提供了優(yōu)質的啟動元件。
【專利說明】大豆逆境誘導基因啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一個大豆逆境誘導基因啟動子及其在轉基因植物中的應用。
【背景技術】
[0002]啟動子是基因的一個組成部分，控制基因表達的起始時間和表達程度。啟動子本身并不控制基因的功能，轉錄因子可以與基因的啟動子結合而調控基因的表達。高等植物基因啟動子主要可以分為三種類型:組成型啟動子、組織特異性啟動子與誘導型啟動子。組成型啟動子是應用最早、最廣泛的一類啟動子。其中應用最廣泛的CaMV35S啟動子為廣大植物學工作者所認可。該啟動子從花椰菜花葉病毒中克隆得到的，在植物的大部分組織中都具有高效的表達，dK?妨啟動子是基因功能鑒定的首選啟動子。組織特異性啟動子是一種只在特定組織中表達的啟動子，如:根特異性表達啟動子，種子特異性啟動子等。而誘導型啟動子在正常生長條件下幾乎不表達，在特定誘導條件下才可以驅動目的基因的表達。
[0003]隨著組成型啟動子(如dK?必啟動子)的廣泛應用，人們發(fā)現(xiàn)組成型啟動子并不適合通過基因工程手段改良作物性狀。因為組成型啟動子不僅可以驅動目的基因的超表達，而且這種超表達沒有時間與空間的限制，即:在任何時間、任何地點目的基因的表達量均很高。這將造成植物自身能量消耗變大，所以組成型超表達的轉基因植株多表現(xiàn)出植株矮小等形狀。為了避免這個問題，組織特異性啟動子與誘導型啟動子的開發(fā)利用成為基因工程研究的一個熱點。
[0004]植物誘導型啟動子是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。在沒有信號刺激時，該啟動子驅動的基因不表達或表達量很低。而在需要基因表`達(具有相應信號刺激)時該基因大量表達，從而合理利用植物自身能量，達到調節(jié)植物信號并使植物適應刺激因素所帶來的影響。植物逆境誘導啟動子為在逆境條件下誘導表達的一類啟動子，主要逆境脅迫為鹽、鹽堿、干旱及低溫等。近年來隨著氣候變化等因素，低溫、干旱與鹽等環(huán)境因素對農(nóng)作物的產(chǎn)量造成很大影響。為了提高作物的抗逆性以應對不良環(huán)境對農(nóng)作物的影響，人們分離并鑒定了大量逆境誘導啟動子。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供大豆逆境誘導基因啟動子。
[0006]大豆逆境誘導啟動子GmNCEDl基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 所述的逆境誘導，是受鹽堿、干旱、低溫或植物激素ABA脅迫誘導。
[0007]大豆逆境誘導啟動子GmNCEDl基因的制備方法，它是以“吉育72”基因組DNA為模板，用引物:
NCED-F:gttatacacgtagatgcatgc
NCED-R:catgtgatggtgttggaattgPCR擴增。
[0008]大豆逆境誘導啟動子GmNCEDl基因在培育轉基因植物中的應用。
[0009]本發(fā)明提供了一個大豆逆境誘導啟動子它涉及到以大豆(吉育72)基因組DNA為模板，利用染色體步移技術克隆基因啟動子。GmNCEDl基因啟動子可以受鹽堿、干旱、植物激素ABA以及低溫脅迫所誘導，對鹽脅迫極為敏感，基因主要在植物的根部表達；更適合利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品種；為基因工程育種提供了優(yōu)質的啟動元件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為大豆逆境誘導啟動子的PCR檢測，其中，M:DNA Marker DL2000 ；1:陰性對照；2:啟動子PCR產(chǎn)物。
[0011]圖2為GmNCEDl基因啟動子與⑶S融合表達載體圖。
[0012]圖3為⑶S組織化學染色結果?！揪唧w實施方式】
[0013]實施例1提取大豆基因組DNA
將大豆“吉育72”(購買于種子公司)種子播在液體營養(yǎng)缽中,放在培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。取生長大豆幼苗嫩葉，按照植物基因組DNA小量提取試劑盒進行提取大豆基因組DNA。提取步驟如下:
(1)在65°C水浴中預熱bufferSI，同時預熱洗脫緩沖液(EB);
(2)取適量鮮嫩的大豆葉片,在液氮中充分碾磨；
(3)轉移研磨成功的細粉(約IOOmg)到一個新的的1.5mlEP管中，加入550μ? 65°C預熱buffer SI和7PL RNA酶，渦旋震蕩至完全混合，室溫條件下靜止放置10分鐘；
(4)在離心管中加入130μ?的buffer S2，需要渦旋震蕩至完全混合，放入離心機內12000 rpm離心5分鐘；
(5)吸取上清置于藍色分離柱A中，12000rpm離心I分鐘，收集下液；
(6)加入1.5倍體積buffer S3后立即緩慢的上下顛倒數(shù)次至充分混合；
(7)將已得混合物(包括可能出現(xiàn)的白色絮狀沉淀)加入至白色吸附柱AC中，12000rpm離心I分鐘，棄廢液；
(8)加入700μ?漂洗液WB，12000 rpm離心I分鐘，棄廢液；
(9)重復步驟(8)—次；
(10)將吸附柱AC放回收集管中，12000rpm離心30秒；
(11)將吸附柱AC置于無核酸酶的EP管中，用事先預熱的洗脫緩沖液EB洗脫，室溫放置1-2分鐘，12000 rpm離心30秒，收集大豆基因組DNA。
[0014]實施例2大豆GmNCEDl基因啟動子的克隆
以大豆基因組DNA為模板，利用引物NCED-F (gTTATACACgTAgATgCATgC )與NCED-R(CATgTgATggTgTTggAATTg)對基因啟動子進行克隆，PCR體系見表1，PCR程序為94°C預變性10分鐘，94°C變性I分鐘，60°C退火I分鐘，延伸2分鐘，共進行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，連接克隆載體PEASY-Tl (購自全式金生物技術有限公司)生依雜切-GmNCEDl后進行測序，測序結果見SEQ ID N0.1。
【權利要求】
1.大豆逆境誘導啟動子基因，其核苷酸序列如序列表SEQID N0.1所示。
2.權利要求1所述的大豆逆境誘導啟動子基因，其特征在于:所述的逆境誘導，是受鹽堿、干旱、低溫或植物激素ABA脅迫誘導。
3.大豆逆境誘導啟動子基因的制備方法，它是以“吉育72”基因組DNA為模板，用引物:
NCED-F:gttatacacgtagatgcatgc
NCED-R:catgtgatggtgttggaattg
PCR擴增。
4.權利要求 1所述的大豆逆境誘導啟動子基因在培育轉基因植物中的應用。
【文檔編號】C12N15/113GK103820451SQ201410045503
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月8日 優(yōu)先權日:2014年2月8日
【發(fā)明者】李海燕, 王法微, 張潔, 王南, 李瓊瓊, 董園園, 陳歡 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學