一株用于生產(chǎn)meso-2,3-丁二醇的基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株用于生產(chǎn)meso-2,3-丁二醇的基因工程菌，該菌是含有陰溝腸桿菌（Enterobacter?cloacae?subsp.dissolvens）SDM?CGMCC?No.4230的2,3-丁二醇合成基因簇budRABC的大腸埃希氏菌，已于2013年12月31日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為：CCTCC?NO：M2013733。利用本發(fā)明的工程菌以葡萄糖為底物，meso-2,3-丁二醇最高產(chǎn)量可達(dá)到85克/升以上，純度大于96%，且生產(chǎn)過程簡便，成本低，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】—株用于生產(chǎn)meso-2, 3_ 丁二醇的基因工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株基因工程菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株用于生產(chǎn)meso-2，3_ 丁二醇的基因工程菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2，3-丁二醇可以廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航天航空等多個(gè)領(lǐng)域(SyuM J.，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2001，55:10-18)。2，3-丁二醇在常溫下是一種無色無味透明的液體，有三種同分異構(gòu)體:meso-2, 3- 丁二醇、(2R, 3R) -2，3- 丁二醇和(2S，3S)-2，3-丁二醇；其中meso-2，3-丁二醇可以和2，5-呋喃二甲酸發(fā)生酯化反應(yīng)，生成的聚合物可用于服裝和合成材料等領(lǐng)域(Gubbels et al., J.Polym.Sc1.，2012，51:890-898)。
[0003]在2，3-丁二醇的生產(chǎn)菌種中,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)以meso-2，3_ 丁二醇為主要代謝產(chǎn)物,但是其純度較低(Celinska E.&Grajek ff., Biotechnol.Adv., 2009, 27:715-725;Ji et al., Biotechnol.Adv.，2011, 29:351-364)。
[0004]1997年，Ui等克隆來源于肺炎克雷伯氏菌的2，3_ 丁二醇合成基因簇，利用大腸桿菌工程菌生產(chǎn)meso-2，3- 丁二醇， 其產(chǎn)量能達(dá)到17.7克/升，生產(chǎn)速率0.31克/升/小時(shí)(Ui et al.，J.Ferment.Bioeng.1997，84:185-189)。之后，有研究嘗試不同菌株來源的2，3-丁二醇合成基因簇以及不同的宿主，均實(shí)現(xiàn)了 meso-2，3_ 丁二醇的生產(chǎn)(Leeet al., Appl.Biochem.Biotechnol.2012, 166:1801-1813; Li et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.2010，87:2001-2009;Nielsen et al.，Biotechnol.J.2010，5:274-284)。但由于受產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)速率的限制，上述方法無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，只處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。基于此，迫切需要尋找更好的方法或生產(chǎn)meso-2，3- 丁二醇的基因工程菌，以實(shí)現(xiàn)meso-2, 3- 丁二醇的高效生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中，meso-2, 3_ 丁二醇的產(chǎn)量低，難以大規(guī)模生產(chǎn)的不足，本發(fā)明要解決的問題是構(gòu)建一株表達(dá)來源于陰溝腸桿菌SDM的2，3- 丁二醇合成基因簇的大腸桿菌，并應(yīng)用該工程菌發(fā)酵葡萄糖高效生產(chǎn)meso-2，3- 丁二醇。
[0006]進(jìn)一步的，本發(fā)明所述用于生產(chǎn)meso-2，3-丁二醇的基因工程菌，是含有陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens) SDM CGMCC N0.4230 的 2，3_ 丁二醇合成基因簇budRABC的大腸埃希氏菌，其中，budRABC的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；該菌株命名為大腸埃希氏菌BL21/pET-RABC (Escherichia coli BL21/pET_RABC)，菌株已于2013年12月31日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”(中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏號(hào)為:CCTCCN0:M2013733o
[0007]上述2，3- 丁二醇合成基因簇budRABC包括IysR (編碼2，3_ 丁二醇合成調(diào)控因子)、Pabc (2，3- 丁二醇合成啟動(dòng)子)、budA/budB/budC (編碼 ALS/ALDC/BDH)，序列長度為4248個(gè)堿基。
[0008]上述用于生產(chǎn)meso-2, 3_ 丁二醇的基因工程菌的制備:克隆Enterobactercloacae subsp.dissolvens SDM來源的2，3_ 丁二醇合成基因簇；將獲得的基因簇使用Bgl II/Hindl 11雙酶切和表達(dá)載體pET28a連接，得到重組質(zhì)粒pETRABC，將質(zhì)粒pETRABC轉(zhuǎn)化到E.coli(優(yōu)選E.coli BL21)中，獲得重組基因工程菌株，命名為E.coli(E.coli BL21)/pETRABCο
[0009]上述基因工程菌大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長，該菌的較佳培養(yǎng)溫度為37±1°C，可以在含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長。
[0010]本發(fā)明所述用于生產(chǎn)meso-2，3-丁二醇的基因工程菌在發(fā)酵底物葡萄糖生產(chǎn)meso-2, 3- 丁二醇中的應(yīng)用。
[0011]其中:上述發(fā)酵培養(yǎng)的方法是:在無菌條件下，取活化好的大腸埃希氏菌E.COliBL21/pETRABC菌液，以體積比為5~10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37 土 1°C，pH5.0~8.0、攪拌轉(zhuǎn)速100~500rpm、通氣量0.5~2.5vvm條件下培養(yǎng)36~72小時(shí)，其間，待檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度降至20克/升以下時(shí)，補(bǔ)加800克/升的葡萄糖母液至培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為20~50克/升，當(dāng)檢測(cè)發(fā)酵液中meso-2，3- 丁二醇的濃度不再增加時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，分離出培養(yǎng)液，按常規(guī)方式提取meso-2，3- 丁二醇；
[0012]其中，上述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:1升蒸餾水中含:酵母粉4克，玉米漿干粉8克，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉6克 ，氯化鉀2克，硫酸鎂0.2克，IM MgSO4溶液I毫升，IM CaCl2溶液0.3毫升。
[0013]上述應(yīng)用中:所述pH范圍優(yōu)選6.0~7.5。
[0014]上述應(yīng)用中:所述攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)選300~450rpm。
[0015]上述應(yīng)用中:所述通氣量優(yōu)選1.0~2.0vvm。
[0016]上述應(yīng)用中:所述大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC菌液的活化方法是:
[0017](I)平板培養(yǎng):將基因工程菌大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC菌株劃線到含有質(zhì)量體積比為1.5~1.8%瓊脂的并含有50毫克/升硫酸卡納霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37±1°C培養(yǎng)12±2小時(shí)；
[0018](2)種子培養(yǎng):無菌條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，37 土 1°C搖床震蕩培養(yǎng)12±2小時(shí)，得到大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC活化菌液；
[0019]其中，上述步驟(1)中所述的LB培養(yǎng)基配方為:1升蒸餾水中含:酵母粉5克，蛋白胨10克，氯化鈉10克，121°C滅菌15分鐘。
[0020]上述步驟(2)中所述的M9培養(yǎng)基配方為:1升蒸餾水中含=Na2HPO4.12H2012.069克，KH2P043 克，NaCl0.5 克,NH4Cl0.5 克，IM MgSO4 溶液 I 毫升，IM CaCl2 溶液 0.3 毫升，微量元素溶液(100 X ) 10毫升，調(diào)節(jié)pH為7.5，121°C滅菌20分鐘。其中，微量元素溶液(100X)配方為:1升蒸餾水中含:EDTA5克，F(xiàn)eCl3.6Η200.83克，ZnCl284毫克，CuCl2.2H2013毫克，CoCl2.2H2010 毫克，H3BO3IO 毫克，MnCl2.4Η201.6 毫克。
[0021]上述應(yīng)用中:底物葡萄糖的檢測(cè)方法是:[0022]樣品進(jìn)行設(shè)定的稀釋后，采用生物傳感分析儀SBA-40C (山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定。測(cè)定原理為利用固定化葡萄糖氧化酶膜專一性測(cè)定葡萄糖含量。
[0023]上述應(yīng)用中:發(fā)酵產(chǎn)物meso-2, 3_ 丁二醇的檢測(cè)方法是:
[0024]每500毫升乙酸乙酯中加入0.4毫升異戊醇，作為萃取劑；利用該萃取劑，對(duì)發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物樣品進(jìn)行等體積萃取，利用渦旋振蕩器對(duì)萃取的樣品震蕩30秒鐘，然后靜置，取上層樣品進(jìn)行氣相檢測(cè)。具體的氣相檢測(cè)條件如下:
[0025]所用氣相色譜儀的型號(hào)為Agilent6820，氮?dú)庾鳛檩d氣，進(jìn)樣器和檢測(cè)器的溫度均設(shè)為280°C，檢測(cè)過程的柱溫設(shè)定為:40°C保持3分鐘；然后以每分鐘1.5°C的速率升溫到800C ；以每分鐘0.50C的速率升溫到86°C ；以每分鐘30°C的速率升溫到200°C。進(jìn)樣量1.5微升，進(jìn)行氣相檢測(cè)。
[0026]本發(fā)明成功的實(shí)現(xiàn)了將2，3-丁二醇合成基因簇在E.coli BL21中表達(dá)，并以此重組菌株E.coli BL21/pETRABC發(fā)酵葡萄糖高效生產(chǎn)meso-2，3- 丁二醇，具有培養(yǎng)基簡單，成本低，產(chǎn)物分離方便等特點(diǎn)。
[0027]本發(fā)明具有的突出特點(diǎn)是:
[0028](I)應(yīng)用表達(dá)2，3- 丁二醇合成基因簇的重組菌株E.coliBL21/pETRABC發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)meso-2, 3- 丁二醇。
[0029](2)本發(fā)明方法構(gòu)建的工程菌株要求的培養(yǎng)基簡單、成本低。
[0030](3)本發(fā)明生產(chǎn)meso-2, 3_ 丁二醇操作過程簡單，產(chǎn)物分離方便。
[0031](4)本發(fā)明的重組菌能發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)meso-2，3_ 丁二醇，最高產(chǎn)量可達(dá)到85克/升以上，純度大于96%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1 載體 pET-RABC 圖譜。
[0033]其中:lacl:編碼Iac啟動(dòng)子的調(diào)控因子；or1:復(fù)制起始位點(diǎn)；Kan:編碼卡那霉素抗性基因;BglII, HindII1:核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)；lysR:編碼2，3- 丁二醇合成調(diào)控因子；Pabc:2，3- 丁二醇合成啟動(dòng)子；budA/budB/budC:編碼 ALS/ALDC/BDH。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面通過實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但不僅限于此。
[0035]實(shí)施例1:基因工程菌株E.coli BL21/pETRABC的構(gòu)建
[0036]1、2，3- 丁二醇合成基因簇的克隆
[0037]米用常規(guī)的方法制備菌株Enterobactercloacae subsp.dissolvens SDM的基因組DNA，該過程可參考科學(xué)出版社出版的《精編分子生物學(xué)指南》中細(xì)菌基因組的小量制備的方法，提取Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的基因組DNA ;使用合成的引物從 Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM 基因組 DNA 中 PCR 擴(kuò)增得到 2，3_ 丁
二醇合成基因簇。
[0038]2, 3_丁二醇合成基因族的來源菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM(CGMCC N0.4230)為 申請(qǐng)人:實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的高產(chǎn)2，3-丁二醇菌株，其已進(jìn)行了保藏和基因組測(cè)序。[0039]通過PCR 擴(kuò)增 Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM 來源的 2，3_ 丁二醇合成基因簇，引物設(shè)計(jì)如下:
[0040]上游引物5，-CGGTAGATCTCTACTCCTCGCTTATCATCG-3，，攜帶一個(gè) Bgl 11 位點(diǎn)；
[0041]下游引物5’ -GCCTAAGCTTTTAGTTGAACACCATCCCA-3’，攜帶一個(gè) HindIII 位點(diǎn)。
[0042]上述基因簇序列長度為4248個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0043]2、將PCR擴(kuò)增得到的DNA片段使用Bglll/Hindlll雙酶切，和表達(dá)載體pET28a連接，得到重組質(zhì)粒pETRABC，見圖1。
[0044]3、將上述重組質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主E.coli BL21，得到工程菌株E.coliBL21/pETRABCο
[0045]上述得到的工程菌菌株E.coli BL21/pETRABC已于2013年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國武漢)，保藏中心編號(hào)為=CCTCC NO:M2013733。
[0046]上述重組大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC CCTCC NO:M2013733為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長，可以用于發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)手性純meso-2，3- 丁二醇。
[0047]上述重組大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC CCTCC NO:M2013733的較佳培養(yǎng)溫度為37±1°C，可以在含有50毫克/升硫酸卡納霉素的LB培養(yǎng)基上生長。
[0048]實(shí)施例2:制備E.coli BL21/pETRABC CCTCC M2013733菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物
[0049]1、平板培養(yǎng):將E.`coli BL21/pETRABC CCTCC M2013733劃線到含有質(zhì)量體積比為
1.5%瓊脂的并含有50毫克/升硫酸卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；
[0050]2、種子:在無菌的條件下，用無菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個(gè)單菌落，然后接種到5毫升的含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)12小時(shí)；
[0051]3、搖瓶:在無菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的菌液以體積比I~3%的接種量，接種到30~150毫升含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，37 ± I °C搖床震蕩培養(yǎng)24± I小時(shí)；
[0052]其中，上述步驟I中所述的LB培養(yǎng)基配方為:1升蒸餾水中含:蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化鈉10克，121°C滅菌15分鐘。上述步驟2~3中所述的M9培養(yǎng)基配方為:1升蒸餾水中含:Na2HP04.12Η2012.069 克，ΚΗ2Ρ043 克，NaCl0.5 克，NH4Cl0.5 克，IM MgSO4 溶液I毫升，IM CaCl2溶液0.3毫升，微量元素溶液(IOOX)IO毫升。調(diào)節(jié)pH為7.5，121°C滅菌20min。其中，微量元素溶液(100X)配方為:1升蒸餾水中含:EDTA5克，F(xiàn)eCl3.6Η200.83克，ZnCl284 毫克，CuCl2.2H2013 毫克，CoCl2.2H2010 毫克，H3BO3IO 毫克，MnCl2.4Η201.6毫克。
[0053]實(shí)施例3:重組Ε.coli在發(fā)酵培養(yǎng)基I中發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)meso-2，3_ 丁二醇
[0054]將通過實(shí)施例2的方法獲得的E.coli BL21/pETRABC CCTCC M2013733菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，以體積比為10%的接種量接種到含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基1中，在37°〇、？冊(cè).5、300印111、1.0^^111通氣量條件下發(fā)酵。發(fā)酵中每隔4小時(shí)取樣，樣品以8，000 X g離心10分鐘，檢測(cè)上清中meso-2，3- 丁二醇和葡萄糖的濃度，根據(jù)葡萄糖濃度補(bǔ)加800克/升葡萄糖母液，使葡萄糖濃度維持在20~50克/升；對(duì)上清進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定發(fā)酵液中meso-2，3- 丁二醇的濃度，當(dāng)meso-2，3- 丁二醇的濃度不再增加時(shí)，停止發(fā)酵。[0055]其中，上述步驟中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基I配方為:1升蒸餾水中含:Na2HPO4.12Η2012.069 克，ΚΗ2Ρ043 克，NaCl0.5 克，NH4Cl0.5 克，IM MgSO4溶液 I 毫升，IM CaCl2溶液0.3毫升，微量元素溶液(100Χ)10毫升。調(diào)節(jié)pH為7.5，121°C滅菌20分鐘。其中，微量元素溶液(100X )配方為:1升蒸餾水中含:EDTA5克，F(xiàn)eCl3.6Η200.83克，ZnCl284毫克，CuCl2.2H2013 毫克，CoCl2.2H2010 毫克，H3BO3IO 毫克，MnCl2.4Η201.6 毫克。
[0056]68小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果顯示:meso-2, 3_ 丁二醇的濃度為68.8克/升。
[0057]實(shí)施例4:重組E.coli在發(fā)酵培養(yǎng)基I中發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)meso-2，3_ 丁二醇
[0058]將通過實(shí)施例2的方法獲得的E.coli BL21/pETRABC CCTCC M2013733菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，以體積比為5%的接種量接種到含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基1中，在371:、？!17.0、400印111、1.5^^111通氣量條件下發(fā)酵。發(fā)酵中每隔4小時(shí)取樣，樣品以8，OOOXg離心10分鐘，檢測(cè)上清中meso-2，3- 丁二醇和葡萄糖濃度，根據(jù)葡萄糖濃度補(bǔ)加葡萄糖，使葡萄糖濃度維持在20~50克/升；對(duì)上清進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定發(fā)酵液中meso-2，3-丁二醇的濃度，當(dāng)meso-2，3-丁二醇的濃度不再增加時(shí)，停止發(fā)酵。
[0059]60小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果顯示:meso-2, 3_ 丁二醇的濃度為73.8克/升。
[0060]實(shí)施例5:重組E.coli在發(fā)酵培養(yǎng)基2中發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)meso-2，3_ 丁二醇
[0061]將通過實(shí)施例2的方法獲得的E.coli BL21/pETRABC CCTCC M2013733菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，以體積比為1 0%的接種量接種到含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基2中，在37 °C、pH6.0、350rpm、2.0vvm通氣量條件下發(fā)酵。發(fā)酵中每隔4小時(shí)取樣，樣品以8，000 Xg離心10分鐘，檢測(cè)上清中meso-2，3-丁二醇和葡萄糖的濃度，根據(jù)葡萄糖濃度補(bǔ)加800克/升葡萄糖母液，使葡萄糖濃度維持在20~50克/升；對(duì)上清進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定發(fā)酵液中meso-2，3- 丁二醇的濃度，當(dāng)meso-2，3- 丁二醇的濃度不再增加時(shí)，停止發(fā)酵。
[0062]40小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果顯示:meso-2，3_ 丁二醇的濃度達(dá)到85.0克/升。
[0063]上述發(fā)酵培養(yǎng)基2配方如下:
[0064]酵母粉4克/升，玉米漿干粉8克/升，磷酸二氫鉀4克/升，乙酸鈉6克/升，氯化鉀2克/升，硫酸鎂0.2克/升，IM CaCl2溶液0.3毫升/升。
[0065]實(shí)施例6:重組E.coli在發(fā)酵培養(yǎng)基2中發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)meso-2，3_ 丁二醇
[0066]將通過實(shí)施例2的方法獲得的E.coli BL21/pETRABC CCTCC M2013733菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物，以體積比為10%的接種量接種到含有50克/升葡萄糖和50毫克/升硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基2中，在37°C、pH6.5、400rpm、1.0vvm通氣量條件下發(fā)酵。發(fā)酵中每隔4小時(shí)取樣，樣品以8，000 Xg離心10分鐘，檢測(cè)上清中meso-2，3-丁二醇和葡萄糖的濃度，根據(jù)葡萄糖濃度補(bǔ)加800克/升葡萄糖母液，使葡萄糖濃度維持在20~50克/升；對(duì)上清進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定發(fā)酵液中meso-2，3- 丁二醇的濃度，當(dāng)meso-2，3- 丁二醇的濃度不再增加時(shí)，停止發(fā)酵。
[0067]36小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果顯示:meso-2, 3_ 丁二醇的濃度達(dá)到80.5克/升。
【權(quán)利要求】
1.一株用于生產(chǎn)meso-2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于:所述基因工程菌是含有陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)SDM CGMCC N0.4230 的 2，3_ 丁二醇合成基因簇budRABC的大腸埃希氏菌，其中，budRABC的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；該菌株命名為大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC，菌株已于2013年12月31日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為:CCTCC NO:M2013733。
2.權(quán)利要求1所述用于生產(chǎn)meso-2，3-丁二醇的基因工程菌在發(fā)酵底物葡萄糖生產(chǎn)meso-2, 3- 丁二醇中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的方法是:在無菌條件下，取活化好的大腸埃希氏菌E.coli BL21/pETRABC菌液，以體積比為5~10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37±1°C，pH5.0~8.0、攪拌轉(zhuǎn)速100~500rpm、通氣量0.5~2.5vvm條件下培養(yǎng)36~72小時(shí)，其間，待檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度降至20克/升以下時(shí)，補(bǔ)加800克/升的葡萄糖母液至培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為20~50克/升，當(dāng)檢測(cè)發(fā)酵液中meso-2，3- 丁二醇的濃度不再增加時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，分離出培養(yǎng)液，按常規(guī)方式提取meso-2, 3- 丁二醇； 其中，上述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:1升蒸餾水中含:酵母粉4克，玉米漿干粉8克，磷酸二氫鉀4克，乙酸鈉6克，氯化鉀2克，硫酸鎂0.2克，IM MgSO4溶液I毫升，IMCaCl2溶液0.3毫升。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述pH范圍選6.0~7.5。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述攪拌轉(zhuǎn)速為300~450rpm。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述通氣量為1.0~2.0vvm。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103805551SQ201410051821
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】馬翠卿, 高超, 徐友強(qiáng), 許平 申請(qǐng)人:山東大學(xué)