基因dna序列捕獲探針的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因DNA序列捕獲探針的制備方法，技術(shù)方案為：1）、設計兩條部分互補的引物，經(jīng)退火處理后形成一個部分雙鏈結(jié)構(gòu)的開叉形接頭，與目標基因的普通PCR擴增產(chǎn)物（A1）進行連接反應，得到兩端帶有接頭的目標基因（A2）；2）、針對接頭序列設計相應的引物，對所述A2進行擴增，得到帶有T7啟動子的擴增產(chǎn)物（A3）；3）、對上述產(chǎn)物（A3）進行定量后，在一定的條件下，加入帶有生物素標記的NTP(其中UTP上標記生物素，其他ATP，CTP，GTP不標記)，進行體外轉(zhuǎn)錄反應，最終得到帶有生物素標記的RNA探針（基因DNA序列捕獲探針）。
【專利說明】基因DNA序列捕獲探針的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種可用于多個目標基因序列進行捕獲后進行二代測序的探針制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新一代測序技術(shù)的發(fā)展，為現(xiàn)代基因組學的研究打開了新的局面，使得普通實驗室對整個人類基因組進行測序成為可能，然而全基因組測序的實驗成本和對科研人員的分析能力的要求還是很高，而且由于大部分基因的功能還不是很清楚，對所產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)進行生物信息學分析將是一項巨大的挑戰(zhàn)。
[0003]在新一代測序技術(shù)以前，人們對基因組大片段特定區(qū)域的研究主要通過PCRwalking后進行傳統(tǒng)毛細管測序的方法。這種方法的問題是目標片段大于500kb時PCR和測序的成本會變得讓研究人員難以承受。而傳統(tǒng)的單基因疾病的解決方案是家系連鎖定位，最后定位的區(qū)域往往是以兆(M) bp來計算的，這就為后續(xù)的研究工作帶來了困難。
[0004]隨著新的研究方法的產(chǎn)生，目標序列捕獲、全外顯子捕獲等方法能更加經(jīng)濟有效的靶定基因組的相應區(qū)域。而且這些方法產(chǎn)生的大量DNA片段非常適合使用新一代測序平臺進行測序。通過這些技術(shù)的組合，人們對于遺傳疾病的研究的效率大大的提高。
[0005]分子診斷市場無比廣大，但是診斷市場對成本的要求更為苛刻，至少全基因組測序在很長的一段時間內(nèi)無法進入分子診斷市場，這就是目標序列捕獲測序的機會。例如DMD基因，長度2500kb，由79個外顯子和78個內(nèi)含子構(gòu)成，其突變是引起杜氏進行性肌營養(yǎng)不良病的原因，非常適合采用靶向測序。還有一些遺傳病在表型上非常相似，但可能是目前已知基因變異的一種，這樣我們也可以把這些變異區(qū)域并在一起，設計目標序列探針并捕獲測序，這比傳統(tǒng)的PCR后毛細管測序通量高，速度快，深度深。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種對目標基因進行有效捕獲的探針的制作方法。應用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對多個靶基因區(qū)域同時進行快速高效地捕獲，以更快更有效地鎖定致病位點。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基因DNA序列捕獲探針的制備方法，包括以下步驟:
[0008]一、制備接頭:
[0009]1)、設計兩條部分互補的引物，所述兩條引物之間的互補度為30~50% (較佳為35~45%，進一步較佳為40%);其中一條引物中含有T7啟動子序列
-...TAATACGACTCACTATAGC^,且該條弓丨物的5’末端有一個突出的T ；
[0010]2)、配制反應液進行反應:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是包括以下步驟: 一、制備接頭: 1)、設計兩條部分互補的引物，所述兩條引物之間的互補度為30~50%;其中一條引物中含有T7啟動子序列—
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是: 所述步驟四中: 將擴增產(chǎn)物(A3)定量至濃度為22.6ng/ μ l ； 體外轉(zhuǎn)錄體系為:

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是: 所述步驟一中:
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因DNA序列捕獲探針的制備方法，其特征是: 所述步驟三中: 通用引物 1: ACTCTTAATACGACTCACTATAGGGATCGCT 通用引物 2:CGGCTTAATA CGACTCACTA TAGGGATCGC。
【文檔編號】C12N15/10GK103898210SQ201410064762
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】譚海芹, 洪旭濤, 余文菁, 張珊珊, 余科, 宓婭娜 申請人:紹興銳創(chuàng)生物科技有限公司