一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片及其應(yīng)用，芯片包括基體和基片；基體分上下兩層，其間集成有稀有細(xì)胞篩選膜。在上下兩層均設(shè)置有樣品進(jìn)口、樣品出口及樣品通道，適用于血液樣品、緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液和其它生物化學(xué)試劑等微量流體的操控。當(dāng)樣品由上層樣品入口輸入而由下層樣品出口輸出時(shí)，樣品中稀有細(xì)胞被選擇性阻隔在細(xì)胞篩選膜的上端。根據(jù)需要將緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液或其它生物化學(xué)試劑由上層樣品入口或下層樣品入口輸入，由上層樣品出口或下層樣品出口輸出，從而實(shí)現(xiàn)各種細(xì)胞操作和分析以及相應(yīng)生物分子學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明解決了捕獲稀有細(xì)胞選擇性及靈敏度差的問題，適用于人體外周血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞及胎兒循環(huán)細(xì)胞的高效捕獲、培養(yǎng)及分析。
【專利說明】—種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，適用于人體外周血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞及胎兒循環(huán)細(xì)胞的捕獲及與之相關(guān)的體外早期診斷、輔助診斷、個(gè)體化治療、化療藥物評(píng)估、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及藥物開發(fā)等。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是當(dāng)影響人類健康的頭號(hào)大敵和最常見的致死因素。雖然人們對(duì)癌癥的診斷和治療已有大量的研究和實(shí)踐，也發(fā)展了很多有效的技術(shù)和方法，但這些技術(shù)和方法對(duì)診斷和治療兩個(gè)方面的需求還有很大的不足。例如，我們還不能做到很好的早期診斷與化療評(píng)估。目前常用的影像技術(shù)，包括超聲(US )、計(jì)算機(jī)斷層顯像(CT )、核磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)對(duì)直徑小于2~3毫米的腫瘤難以確認(rèn)，且在很多情況下對(duì)所觀察到的腫瘤浸潤能力不易判斷。另外，影像技術(shù)所用射線對(duì)健康也有一定危害。目前常用的另一技術(shù)是對(duì)從活體組織上取下的病變組織進(jìn)行組織切片分析。這種方法局限性在于難以確定腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，且該方法是侵入性的，有可能對(duì)腫瘤組織造成刺激從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，因而不能作為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展、治療效果或復(fù)發(fā)的常規(guī)方法。第三種是基于血液學(xué)的檢查方法:當(dāng)原發(fā)腫瘤和/或轉(zhuǎn)移腫瘤釋放抗原或其它與癌變相關(guān)的標(biāo)志物在人體外周血液中可被檢測(cè)出時(shí)，便提示了腫瘤的存在，但有些其它的原因如炎癥等也可導(dǎo)致這些標(biāo)志物的增加，所以不能確診。另外，此類血液檢查也不能對(duì)化療療效做出準(zhǔn)確快速的判斷。研究表明，人體外周血液中癌癥細(xì)胞的數(shù)量、種類和特性可以作為癌癥的重要標(biāo)志物，如果能夠快速捕獲血液中的癌癥細(xì)胞，就有希望在早期發(fā)現(xiàn)癌癥并改變護(hù)理治療。
[0003]目前人體外周血液中稀有細(xì)胞的捕獲主要有兩種方案，第一種方案是基于磁珠或固體表面與稀有細(xì)胞表面的特異標(biāo)志物的相互作用來進(jìn)行捕獲的，其問題在于有一部分稀有細(xì)胞的表面可能沒有這種特異標(biāo)志物，所以不能保證捕獲的高效益；第二種方案是采用特殊的微孔過濾裝置將稀有細(xì)胞與其它細(xì)胞進(jìn)行分離，這種方法方便可相當(dāng)?shù)乇ＷC捕獲的高效益，但問題是目前所提出的方案選擇性不高，及在所捕獲細(xì)胞中除稀有細(xì)胞外還有大量的白血細(xì)胞。所以，如何同時(shí)提高稀有細(xì)胞捕獲的效率和選擇性是當(dāng)前亟待解決的問題。另外，已報(bào)道的用于稀有細(xì)胞捕獲的過濾裝置功能單一，不利于進(jìn)一步的細(xì)胞檢測(cè)和相關(guān)的生物分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片及其應(yīng)用，它可用于稀有細(xì)胞的捕獲、固定和染色，細(xì)胞的培養(yǎng)、成像和計(jì)數(shù)，細(xì)胞的驅(qū)化性及細(xì)胞凋亡的研究，也可用于人體外周血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞及胎兒循環(huán)細(xì)胞的捕獲及與之相關(guān)的體外早期診斷、輔助診斷、個(gè)體化治療、化療藥物評(píng)估、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及藥物開發(fā)等。本發(fā)明解決了在稀有細(xì)胞捕獲過程中選擇性及靈敏度差的問題，能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效和可靠地稀有細(xì)胞捕獲和檢測(cè)，同時(shí)芯片的制作工藝簡單、集成化程度高、結(jié)構(gòu)靈巧、操作簡便、應(yīng)用方便、可靠、且效率高。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，它包括一個(gè)基體和一個(gè)與基體平面吻合并密封粘合的基片，所述基體由上層、下層和集成在上層與下層之間的細(xì)胞篩選膜構(gòu)成，所述上層的一端設(shè)置有上層樣品入口，另一端設(shè)置有上層樣品出口，上層樣品入口通過上層樣品輸入通道與一帶有上層缺口的上層環(huán)形通道相連，而該上層環(huán)形通道通過若干條呈輻射狀設(shè)置的上層擴(kuò)散通道與一上層圓形樣品池相連，該上層圓形樣品池通過上層樣品輸出通道與上層樣品出口相連；同樣，所述上層的一端和下層的一端設(shè)置有一個(gè)連通的下層樣品入口，另一端設(shè)置有連通的下層樣品出口，下層樣品入口通過下層樣品輸入通道與一帶有下層缺口的下層環(huán)形通道相連，而該下層環(huán)形通道通過若干條呈輻射狀設(shè)置的下層擴(kuò)散通道與一下層圓形樣品池相連，該下層圓形樣品池通過下層樣品輸出通道與下層樣品出口相連。上層與下層的液體交換由分隔兩層的細(xì)胞篩選膜來實(shí)現(xiàn)，當(dāng)從上層樣品入口輸入時(shí)，樣品通過上層環(huán)形通道及上層擴(kuò)散通道進(jìn)入上層圓形樣品池。當(dāng)從下層樣品入口輸入時(shí)，樣品通過下層環(huán)形通道及下層擴(kuò)散輻射狀通道進(jìn)入下層圓形樣品池。通過調(diào)節(jié)上層樣品入口和上層樣品出口的壓強(qiáng)及下層樣品入口和下層樣品出口的壓強(qiáng)，可控制流體走向，即進(jìn)入上層圓形樣品池的樣品可以從上層樣品出口或下層樣品出口輸出，進(jìn)入下層圓形樣品池的樣品可以從下層樣品出口或上層樣品出口輸出。
[0006]進(jìn)一步的技術(shù)方案是:
[0007]所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，下層的上部設(shè)有用于安置細(xì)胞篩選膜的圓形凹口。
[0008]所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，細(xì)胞篩選膜由固定環(huán)和封裝在固定環(huán)上的微孔陣列濾膜構(gòu)成，所述微孔陣列濾膜為呈密集分布和規(guī)則排列的錐形微孔陣列濾膜或雙層微孔陣列濾膜。
[0009]所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，上層樣品輸入通道、上層樣品輸出通道、下層樣品輸入通道、下層樣品輸出通道、上層環(huán)形通道、下層環(huán)形通道、上層擴(kuò)散通道和下層擴(kuò)散通道的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，寬度大于等于20微米，小于等于2毫米。
[0010]所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，上層圓形樣品池和下層圓形樣品池的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直徑大于等于2毫米，小于等于30毫米。
[0011]所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述微孔陣列濾膜的厚度大于等于10微米，小于等于100微米，所述錐形微孔陣列或雙層微孔陣列的小孔徑直徑大于等于I微米，小于等于20微米，大孔徑直徑大于等于5微米，小于等于100微米，所述微孔陣列濾膜的兩個(gè)小孔間圓心距離大于等于2微米，小于等于500微米。
[0012]所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，圓形凹口的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直徑大于等于2毫米，小于等于30毫米。
[0013]本發(fā)明的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片在細(xì)胞捕獲、固定及染色、細(xì)胞成像及計(jì)數(shù)過程中的應(yīng)用，其特征在于:包括以下步驟:
[0014]I)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌；
[0015]2)細(xì)胞篩選膜的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入預(yù)先配好的蛋白溶液對(duì)細(xì)胞篩選膜表面進(jìn)行表面修飾，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；[0016]3)細(xì)胞捕獲:將含有癌細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液注入芯片中，使癌細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜所捕獲；
[0017]4)細(xì)胞固定:將多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕獲細(xì)胞的固定在細(xì)胞篩選膜上，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0018]5)細(xì)胞染色:依次注入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色前處理；再注入有熒光素標(biāo)記的抗體，并使之與細(xì)胞表面的特異抗原或稀有細(xì)胞的標(biāo)記物相結(jié)合；在每次注入新的溶劑之后，注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0019]6)成像與分析:將細(xì)胞篩選膜取出，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞篩選膜上的捕獲的細(xì)胞進(jìn)行成像并分析捕獲的細(xì)胞的數(shù)目以及對(duì)應(yīng)的捕獲效率。
[0020]本發(fā)明的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片在血樣內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲過程中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟:
[0021]1)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌；
[0022]2)細(xì)胞篩選膜的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入預(yù)先配好的蛋白溶液對(duì)細(xì)胞篩選膜表面進(jìn)行表面修飾，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0023]3)血樣處理:將病人血樣用磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)行稀釋；
[0024]4)細(xì)胞捕獲:將含有癌細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液注入芯片中，使癌細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜所捕獲，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0025]5)細(xì)胞固定:將多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕獲的細(xì)胞固定在細(xì)胞篩選膜上，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0026]6)細(xì)胞染色:依次注入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色前處理；再注入有熒光素標(biāo)記的抗體，并使之與細(xì)胞表面的特異抗原或細(xì)胞的癌癥標(biāo)記物相結(jié)合；在每次注入新的溶劑之后，注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0027]7)成像與分析:將細(xì)胞篩選膜取出，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞篩選膜上的捕獲的細(xì)胞進(jìn)行成像并分析以確定癌細(xì)胞的個(gè)數(shù)。
[0028]本發(fā)明還提供了一種稀有細(xì)胞在檢測(cè)芯片中培養(yǎng)、擴(kuò)增的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0029]1)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌；
[0030]2)細(xì)胞過濾膜的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入預(yù)先配好的蛋白溶液對(duì)細(xì)胞篩選膜表面進(jìn)行表面修飾，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0031]3)細(xì)胞捕獲:將含有稀有細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液或血樣注入芯片中，使稀有細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜所捕獲；
[0032]4)細(xì)胞培養(yǎng):待細(xì)胞捕獲完畢后，緩慢注入細(xì)胞培養(yǎng)液后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033]本發(fā)明的有益效果在于:
[0034]1)稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片進(jìn)樣速度可以控制在一定的范圍內(nèi)，因此可以調(diào)節(jié)樣品通過細(xì)胞篩選膜的流量。
[0035]2)當(dāng)樣品通過細(xì)胞篩選膜的流量較小時(shí)，細(xì)胞篩選膜兩邊的壓差也較小，因而確保所捕獲的稀有細(xì)胞被保留且其活性不受較大的影響。
[0036]3)樣品由環(huán)形通道和與之相連的擴(kuò)散通道進(jìn)入樣品池的進(jìn)樣方式確保待檢樣品經(jīng)過細(xì)胞篩選膜時(shí)有一橫流分量，從而減少待檢樣品中細(xì)胞在微孔陣列濾膜表面沒有孔的部分的停留和被捕獲時(shí)的附加壓力。
[0037]4)通過錐形微孔或雙層微孔陣列時(shí)，樣品中除稀有細(xì)胞外的所有成分都可通過細(xì)胞篩選膜，因而確保細(xì)胞篩選膜的通透性或細(xì)胞篩選膜兩邊的壓差不變，從而使所捕獲的稀有細(xì)胞被保留且其活性不受壓差的影響。
[0038]5)細(xì)胞篩選膜表面可進(jìn)行各種生物化學(xué)修飾，以增強(qiáng)稀有細(xì)胞捕獲的選擇性或其它特性。
[0039]6)當(dāng)稀有細(xì)胞在芯片中被捕獲后，可以在芯片中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的操作，如細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞處理與成像及分子水平上的檢測(cè)和分析。
[0040]7)當(dāng)稀有細(xì)胞在芯片中被捕獲后，也可以將細(xì)胞篩選膜取出，并結(jié)合其它方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、處理與成像以及分子水平上的檢測(cè)和分析。
[0041]8)夾在芯片中的細(xì)胞篩選膜上的錐形微孔或雙層微孔口徑較小的一面可以朝上或朝下，與此稀有細(xì)胞可以被限制在上層或下層的樣品池中以方便觀察。
[0042]9)通過調(diào)節(jié)上層樣品入口和上層樣品出口的壓強(qiáng)及下層樣品入口和下層樣品出口的壓強(qiáng)，可控制流體走向，即進(jìn)入上層圓形樣品池的樣品可以從上層樣品出口或下層樣品出口輸出，進(jìn)入下層圓形樣品池的樣品可以從下層樣品出口或上層樣品出口輸出。
[0043]10)本發(fā)明為癌癥早期診斷、化療藥物評(píng)估、個(gè)體化治療、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及腫瘤藥物的開發(fā)等提供了一種可靠的手段。
[0044]11)本發(fā)明的細(xì)胞過濾器應(yīng)用方便、可靠、且效率高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1為本發(fā)明的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
[0046]圖2為圖1中基體的上層結(jié)構(gòu)俯視示意圖。
[0047]圖3為圖1中基體的下層結(jié)構(gòu)俯視示意圖。
[0048]圖4為細(xì)胞篩選膜結(jié)構(gòu)示意圖。
[0049]圖5為圖4的A-A剖視圖，其顯示為錐形微孔陣列及固定環(huán)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0050]圖6為圖4的A-A剖視圖，其顯示為雙層微孔陣列及固定環(huán)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0051]圖7為錐形微孔陣列濾膜的掃描電鏡圖，其中(a)錐形微孔小口徑的一面，(b)錐形微孔大口徑的一面。
[0052]圖8為圖1的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片的實(shí)物圖。
[0053]圖9為用不同流 速捕獲HT29細(xì)胞捕獲效率圖。
[0054]圖10為不同濃度HT29細(xì)胞在芯片中的捕獲效率圖。
[0055]圖11為捕獲于細(xì)胞篩選膜上的HT29細(xì)胞免疫熒光圖。
[0056]圖中各附圖標(biāo)記的名稱為:
[0057]I —基體；2—基片；3-上層；4 一下層；5_細(xì)胞篩選膜；6—上層樣品入口 ；7-上層樣品輸入通道；8—上層樣品出口 ；8.1 —上層樣品輸出通道；9-下層樣品入口 ；10_下層樣品輸入通道；11_下層樣品出口 ；11.1-下層樣品輸出通道；12_上層環(huán)形通道；12.1-上層缺口 ；13 —下層環(huán)形通道；13.1-下層缺口 ；14 一上層擴(kuò)散通道；15 —下層擴(kuò)散通道；16 —上層圓形樣品池；17 —下層圓形樣品池；18 —圓形凹口 ；19 一錐形微孔陣列；20 —雙層微孔陣列；21 —固定環(huán)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0058]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0059]實(shí)施例1
[0060]如圖1-6所示是本發(fā)明一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片的基本實(shí)施例。它包括一個(gè)基體I和一個(gè)與基體I平面吻合并密封粘合的基片2，所述基體I由上層3、下層4和集成在上層3與下層4之間的細(xì)胞篩選膜5構(gòu)成，所述上層3的一端設(shè)置有上層樣品入口 6，另一端設(shè)置有上層樣品出口 8，上層樣品入口 6通過上層樣品輸入通道7與一帶有上層缺口 12.1的上層環(huán)形通道12相連，而該上層環(huán)形通道12通過若干條呈輻射狀設(shè)置的上層擴(kuò)散通道14與一上層圓形樣品池16相連，該上層圓形樣品池16通過上層樣品輸出通道8.1與上層樣品出口 8相連；同樣，所述上層3的一端和下層4的一端設(shè)置有連通的下層樣品入口 9，另一端設(shè)置有連通的下層樣品出口 11，下層樣品入口 9通過下層樣品輸入通道10與一帶有下層缺口 13.1的下層環(huán)形通道13相連，而該下層環(huán)形通道13通過若干條呈輻射狀設(shè)置的下層擴(kuò)散通道15與一下層圓形樣品池17相連，該下層圓形樣品池17通過下層樣品輸出通道11.1與下層樣品出口 11相連。上層3與下層4的液體交換由分隔兩層的細(xì)胞篩選膜5來實(shí)現(xiàn)。
[0061]當(dāng)從上層樣品入口 6輸入時(shí)，樣品通過上層環(huán)形通道12及上層擴(kuò)散通道14進(jìn)入上層圓形樣品池16。當(dāng)從下層樣品入口 9輸入時(shí)，樣品通過下層環(huán)形通道13及下層擴(kuò)散通道15進(jìn)入下層圓形樣品池17。通過調(diào)節(jié)上層樣品入口 6和上層樣品出口 8的壓強(qiáng)及下層樣品入口 9和下層樣品出口 11的壓強(qiáng)，可控制流體走向，即進(jìn)入上層圓形樣品池16的樣品可以從上層樣品出口 8或下層樣品出口 11輸出，進(jìn)入下層圓形樣品池17的樣品可以從下層樣品出口 11或上層樣品出口 8輸出。
[0062]細(xì)胞捕獲由細(xì)胞篩選膜5實(shí)現(xiàn)，該細(xì)胞篩選膜5被放置在下層4上部的圓形凹口18處，其中的微孔陣列濾膜上密集分布和規(guī)則排列有錐形微孔陣列19或雙層微孔陣列20，并封裝在一固定環(huán)21上，夾在芯片中的細(xì)胞篩選膜5上錐形微孔或雙層微孔口徑較小的一面朝上。樣品過濾時(shí)，樣品中的稀有細(xì)胞可被阻隔在細(xì)胞篩選膜5的錐形微孔或雙層微孔口徑較小的一面，過濾后的樣品通過下層圓形樣品池17?？稍谏蠈訕悠份斎胪ǖ?中布置特定的結(jié)構(gòu)并修飾特異性抗體，預(yù)篩選樣品中的部分細(xì)胞。
[0063]上層樣品輸入通道7、上層樣品輸出通道8.1、下層樣品輸入通道10、下層樣品輸出通道11.1、上層環(huán)形通道12、下層環(huán)形通道13、上層擴(kuò)散通道14和下層擴(kuò)散通道15的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，寬度大于等于20微米，小于等于2毫米。上層圓形樣品池16和下層圓形樣品池17的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直徑大于等于2毫米，小于等于30毫米。微孔陣列濾膜的厚度大于等于10微米，小于等于100微米，所述錐形微孔陣列或雙層微孔陣列的小孔徑直徑大于等于I微米，小于等于20微米，大孔徑直徑大于等于5微米，小于等于100微米，所述微孔陣列濾膜的兩個(gè)小孔間圓心距離大于等于2微米，小于等于500微米。圓形凹口 18的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直徑大于等于2毫米，小于等于30毫米。
[0064]在芯片中所捕獲的稀有細(xì)胞可用顯微成像及顯微熒光成像的方法加以分析。[0065]實(shí)施例2
[0066]如圖7、8所示，是本發(fā)明一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片的實(shí)施例。
[0067]圖7為錐形微孔陣列濾膜的掃描電鏡圖，其中(a)為錐形微孔小口徑的一面，(b)為錐形微孔大口徑的一面。細(xì)胞篩選膜5的厚度為40微米。固定環(huán)21的厚度為60微米。細(xì)胞篩選膜5上密集分布和規(guī)則排列的錐形微孔的小口徑直徑為6.5微米，大口徑直徑為25微米，其周期為40微米。所述的微孔陣列濾膜的制作材料為聚乙二醇。
[0068]圖8為圖1的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片的實(shí)物圖。上層樣品輸入通道7、上層樣品輸出通道8.1、下層樣品輸入通道10、下層樣品輸出通道11.1的寬度為500微米，上層環(huán)形通道12、下層環(huán)形通道13的寬度為400微米。上層擴(kuò)散通道14和下層擴(kuò)散通道15的寬度為200微米，長度為I毫米，每個(gè)擴(kuò)散通道相互間隔角度為45度。上層圓形樣品池16和下層圓形樣品池17的直徑為6毫米。細(xì)胞篩選膜5的厚度為100微米。所述的基片2為玻璃片。本實(shí)例中基體I材料為聚合物聚二甲基硅氧烷。
[0069]實(shí)施例3
[0070]使用實(shí)施 例2中稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片用于捕獲PBS溶液中參雜直腸癌細(xì)胞HT29，包括下述步驟:
[0071]I)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌；
[0072]2)細(xì)胞篩選膜5的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入20μ I的MaxGel溶液(I:100比例稀釋在PBS溶液中)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育小時(shí)后，移去殘留溶液，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0073]3)細(xì)胞捕獲:將IOml含有直腸癌細(xì)胞ΗΤ29的磷酸鹽緩沖液注入芯片中，使癌細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜5所捕獲；
[0074]4)細(xì)胞固定:將濃度為4%的多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕獲的細(xì)胞固定在細(xì)胞篩選膜5上，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0075]5)細(xì)胞染色:依次注入濃度為0.2%Triton-X100通透液和濃度為1%牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色前處理；再注入有熒光素標(biāo)記的抗體，并使之與細(xì)胞表面的特異抗原或細(xì)胞的癌癥標(biāo)記物相結(jié)合；在每次注入新的溶劑之后，注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0076]6)成像與分析:將細(xì)胞篩選膜5取出，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞篩選膜5上的捕獲的HT29細(xì)胞進(jìn)行成像并分析捕獲的細(xì)胞的數(shù)目以及對(duì)應(yīng)的捕獲效率。
[0077]圖9為磷酸鹽緩沖液在不同流速時(shí)HT29細(xì)胞的捕獲效率圖。
[0078]圖10為磷酸鹽緩沖液在流速分別為0.2和0.5毫升/分時(shí)HT29細(xì)胞的捕獲效率圖。
[0079]實(shí)施例4
[0080]使用實(shí)施例2中稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片用于捕獲血樣中直腸癌細(xì)胞HT29，包括下述步驟:
[0081]I)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌；
[0082]2)細(xì)胞篩選膜5的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入20 μ I的MaxGel溶液(I:100比例稀釋在PBS溶液中)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育小時(shí)后，移去殘留溶液，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0083]3)血樣處理:分別取正常人血樣5毫升，PBS溶液4毫升，含有直腸癌細(xì)胞ΗΤ29的PBS溶液I毫升，并混合；
[0084]4)細(xì)胞捕獲:將IOml含有直腸癌細(xì)胞HT29的磷酸鹽緩沖液注入芯片中，使癌細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜5所捕獲；
[0085]5)細(xì)胞固定:將濃度為4%的多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕獲在細(xì)胞篩選膜5上的細(xì)胞固定，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0086]6)細(xì)胞染色:依次注入濃度為0.2%Triton-X100通透液和濃度為1%牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色前處理；再注入有熒光素標(biāo)記的抗體，并使之與細(xì)胞表面的特異抗原或細(xì)胞的癌癥標(biāo)記物相結(jié)合；在每次注入新的溶劑之后，注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；
[0087]7)成像與分析:將細(xì)胞篩選膜5取出，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞篩選膜5上的捕獲的HT29細(xì)胞進(jìn)行成像并分析捕獲的細(xì)胞的數(shù)目以及對(duì)應(yīng)的捕獲效率。[0088]圖11為血樣通過細(xì)胞過濾膜5后所捕獲的HT29細(xì)胞熒光。DAPI標(biāo)識(shí)為所有細(xì)胞核，CK標(biāo)識(shí)的為HT29細(xì)胞角蛋白，⑶45標(biāo)識(shí)的為白細(xì)胞，Merge為DAP1、CK與⑶45的組合圖。標(biāo)尺長度為100微米。
[0089]其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，它包括一個(gè)基體(1)和一個(gè)與基體(1)平面吻合并密封粘合的基片(2)，所述基體(1)由上層(3)、下層(4)和集成在上層(3)與下層(4)之間的細(xì)胞篩選膜(5)構(gòu)成，所述上層(3)的一端設(shè)置有上層樣品入口(6)，另一端設(shè)置有上層樣品出口(8)，所述上層樣品入口(6)通過上層樣品輸入通道(7)與一帶有上層缺口(12.1)的上層環(huán)形通道(12)相連，所述上層環(huán)形通道(12)通過若干條呈輻射狀設(shè)置的上層擴(kuò)散通道(14)與一上層圓形樣品池(16)相連，所述上層圓形樣品池(16)通過上層樣品輸出通道(8.1)與上層樣品出口(8)相連，同樣，所述上層(3)的一端和下層(4)的一端設(shè)置有連通的下層樣品入口(9)，另一端設(shè)置有連通的下層樣品出口(11)，所述下層樣品入口(9)通過下層樣品輸入通道(10)與一帶有下層缺口(13.1)的下層環(huán)形通道(13)相連，所述下層環(huán)形通道(13)通過若干條呈輻射狀設(shè)置的下層擴(kuò)散通道(15)與一下層圓形樣品池(17)相連，所述下層圓形樣品池(17)通過下層樣品輸出通道(11.1)與下層樣品出口(11)相連。
2.如權(quán)利要求1所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述下層(4)的上部設(shè)有用于安置細(xì)胞篩選膜(5)的圓形凹口(18)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述細(xì)胞篩選膜(5)由固定環(huán)(21)和封裝在固定環(huán)(21)上的微孔陣列濾膜構(gòu)成，所述微孔陣列濾膜為呈密集分布和規(guī)則排列的錐形微孔陣列(19)濾膜或雙層微孔陣列(20)濾膜。
4.如權(quán)利要求1或2所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述上層樣品輸入通道(7)、上層樣品輸出通道(8.1)、下層樣品輸入通道(10)、下層樣品輸出通道(11.1)、上層環(huán)形通道(12)、下層環(huán)形通道(13)、上層擴(kuò)散通道(14)和下層擴(kuò)散通道(15)的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，寬度大于等于20微米，小于等于2毫米。
5.如權(quán)利要求1或2所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述上層圓形樣品池(16)和下層圓形樣品池(17)的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直徑大于等于2毫米，小于等于30毫米。
6.如權(quán)利要求3所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述微孔陣列濾膜的厚度大于等于10微米，小于等于100微米，所述錐形微孔陣列(19)或雙層微孔陣列(20)的小孔徑直徑大于等于I微米，小于等于20微米，大孔徑直徑大于等于5微米，小于等于100微米，所述微孔陣列濾膜的兩個(gè)小孔間圓心距離大于等于2微米，小于等于500微米。
7.如權(quán)利要求2所述的稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片，其特征在于，所述圓形凹口(18)的高度大于等于20微米，小于等于2毫米，直徑大于等于2毫米，小于等于30毫米。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片在細(xì)胞捕獲、固定及染色、細(xì)胞成像及計(jì)數(shù)過程中的應(yīng)用，其特征在于:包括以下步驟: O滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌； 2)細(xì)胞篩選膜的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入預(yù)先配好的蛋白溶液對(duì)細(xì)胞篩選膜表面進(jìn)行表面修飾，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 3)細(xì)胞捕獲:將含有癌細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液注入芯片中，使癌細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜所捕獲； 4)細(xì)胞固定:將多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕獲的細(xì)胞固定在細(xì)胞篩選膜上，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗；5)細(xì)胞染色:依次注入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色前處理；再注入有熒光素標(biāo)記的抗體，并使之與細(xì)胞表面的特異抗原或稀有細(xì)胞的標(biāo)記物相結(jié)合；在每次注入新的溶劑之后，注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 6)成像與分析:將細(xì)胞篩選膜取出，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞篩選膜上的捕獲的細(xì)胞進(jìn)行成像并分析捕獲的細(xì)胞的數(shù)目以及對(duì)應(yīng)的捕獲效率。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片在血樣中循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲過程中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟: 1)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌； 2)細(xì)胞篩選膜的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入預(yù)先配好的蛋白溶液對(duì)細(xì)胞篩選膜表面進(jìn)行表面修飾，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 3)血樣處理:將病人血樣用磷酸鹽緩沖液溶液進(jìn)行稀釋； 4)細(xì)胞捕獲:將含有癌細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液注入芯片中，使癌細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜所捕獲，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 5)細(xì)胞固定:將多聚甲醛溶液注入芯片中，使捕獲的細(xì)胞固定在細(xì)胞篩選膜上，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 6)細(xì)胞染色:依次注入Triton-XlOO通透液和牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色前處理；再注入有熒光素標(biāo)記的抗體，并使之與細(xì)胞表面的特異抗原或細(xì)胞的癌癥標(biāo)記物相結(jié)合；在每次注入新的溶劑之后，注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 7)成像與分析:將細(xì)胞篩選膜取出，用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞篩選膜上的捕獲的細(xì)胞進(jìn)行成像并分析以確定癌細(xì)胞的個(gè)數(shù)。
10.一種權(quán)利要求1所述稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片在細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增過程中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: 1)滅菌:將稀有細(xì)胞檢測(cè)芯片置于紫外光線下進(jìn)行滅菌； 2)細(xì)胞篩選膜的表面修飾:先用注射泵在芯片中注入預(yù)先配好的蛋白溶液對(duì)細(xì)胞篩選膜表面進(jìn)行表面修飾，然后注入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗； 3)細(xì)胞捕獲:將含有稀有細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液或血樣注入芯片中，使稀有細(xì)胞被細(xì)胞篩選膜所捕獲； 4)細(xì)胞培養(yǎng):待細(xì)胞捕獲完畢后，緩慢注入細(xì)胞培養(yǎng)液后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK103937658SQ201410123388
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】唐亞東, 石劍, 李思思, 汪莉, 陳勇 申請(qǐng)人:武漢介觀生物科技有限責(zé)任公司