一種豬NF-κappaBC-Rel亞基真核表達載體的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種豬NF-κappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構(gòu)建，其構(gòu)建方法為：首先，根據(jù)C-Rel基因，設(shè)計了一對特異性引物P1、P2，用重組PCR的方法擴增出目的基因，使其兩段分別帶上EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點，把目的片段和載體雙酶切后用SolutionI進行連接反應(yīng)，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌，建立PMD19-T-C-Rel重組質(zhì)粒。其次，把重組質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)載體雙酶切后用SolutionI進行連接反應(yīng)，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌最后，分別采用了PCR法，雙酶切法和測序法三種方法進行篩選和鑒定陽性菌落。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒序列與GenBank中的目的片段序列一致。證明目的基因已經(jīng)插入pcDNA3.1(+)載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
【專利說明】—種豬NF-K appaBC-Rel亞基真核表達載體的構(gòu)建
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種真核表達載體的構(gòu)建，特別是涉及一種豬NF-K appaBC-Rel亞基真核表達載體的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞核轉(zhuǎn)錄因子-kB(Nucleartranscriptionfactor-κ: appaB, NF-K: B)是一類能結(jié)合多種基因啟動子區(qū)的固定核苷酸序列并啟動基因轉(zhuǎn)錄功能的蛋白，通過調(diào)節(jié)細胞因子，趨化、生長因子，黏附分子及多種酶的基因表達，參與機體免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，它是細胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是細胞存活、細胞周期、細胞黏附和遷移的重要調(diào)節(jié)者。NF-κ B 是由 NF-κ B/Rel 蛋白家族的 5 個成員，包括 NF-κ BI (P50/P105)、NF- κ Β2 (Ρ52/Ρ100)、RelA(P65)、RelB和C-Rel以同源或異源二聚體形式組成的，即為不同的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮不同的轉(zhuǎn)錄激活特性。其中P50和P65亞基在細胞中廣泛存在，RelB僅在胸腺和淋巴結(jié)中表達，而C-Rel只在造血細胞和淋巴細胞中表達；目前已知的異源二聚體有P50/P65，p50/C-Rel，P65/C-Rel，其中最常見的是由P50與P65形成的P50/P65異源二聚體。在靜息狀態(tài)時，NF-κ B通常與其抑制物I κ B結(jié)合形成無活性的三聚體形式存在于細胞漿，當細胞受到細胞外信號刺激時，通過一個或多個信號轉(zhuǎn)導途徑，NF-κΒ與IkB解離，迅速發(fā)生核易位，形成有活性的NF-κ B，發(fā)揮其功能。在P50/P65活化的過程中，P50亞基用于與κΒ序列結(jié)合，而Ρ65亞基有兩個重要功能，即利用其C端的反式激活域增強靶基因的轉(zhuǎn)錄激活及與各種I κ B成員直接耦聯(lián)。
[0003]近年來，NF- KB被作為作用靶點治療或緩解多種人類自身免疫系統(tǒng)性疾病的一大研究熱點，因此構(gòu)建一種NF- κ BC-Rel亞基的真核表達載體，以期為進一步C-Rel在多種免疫抑制性疾病感染機制中的作用的研究奠定基礎(chǔ)就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種豬NF- KappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構(gòu)建，為研究C-Rel基因在多種免疫抑制性疾病感染機制中的作用提供一個有效的工具。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0006]一種豬NF- KappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構(gòu)建，所述載體為pcDNA3.1-C-Rel重組載體，該重組載體是通過以下方法構(gòu)建獲得的:
[0007]步驟一、PMD19-T-C-Rel重組質(zhì)粒的構(gòu)建:采集豬前腔靜脈血，分離出淋巴細胞獲得cDNA，再用引物P1、P2擴增出C-Rel目的片段，構(gòu)建PMD19-T_C-Rel重組質(zhì)粒；
[0008]步驟二、C-Rel基因轉(zhuǎn)錄片段的獲得:以PMD19-T-C_Rel重組質(zhì)粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，將酶切的目的片段用膠回收試劑盒回收，用于連接反應(yīng)；
[0009] 步驟三、pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒的酶切:以pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂凝膠電泳后，膠回收試劑盒進行大片段回收，-200C保存?zhèn)溆茫?br> [0010]步驟四、連接反應(yīng):C_Rel基因片段和PCDNA3.1 (+)載體片段按3:1摩爾比例，在連接酶的作用下，置于4°C反應(yīng)過夜；
[0011]步驟五、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細胞，即:取連接產(chǎn)物IOul加入200ulDH5a感受態(tài)細胞，冰浴30min，42°C 90s,再冰浴5min，加入1mlLB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min，取200ul菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12-18h ；
[0012]步驟六、挑選單個疑似菌落用EcoR I和Xho I進行雙酶切鑒定，將初步鑒定陽性的pcDNA3.1-C-Rel重組質(zhì)粒進行測序，比較重組質(zhì)粒序列與GenBank中的目的片段序列的
一致性。
[0013]進一步的，上述載體構(gòu)建步驟一中，針對C-Rel基因的特異性引物為:
[0014]Pl:
[0015]5’ -GAATTCGCCACCATGGGACACTATTCACAACGTGGGTATAAC-3’ ；
[0016]P2:
[0017]5，-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAAAACTCAAATGCAA-3，。
[0018]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供一種豬NF-κ appaBC-Rel亞基的真核表達載體，為研究C-Rel基因在多種免疫抑制性疾病感染機制中的作用提供一個有效的工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為PCR鑒定C-Rel基因真核表達目的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020]圖中M 為 DL2000Marker ; I 為 PCR 產(chǎn)物。
[0021]圖2為PMD19-T-C_Rel雙酶切產(chǎn)物。
[0022]圖3為pCDNA3.1 (+) -C-Rel雙酶切鑒定結(jié)果。圖中M為DLMarkerIII ；1為PCDNA3.1 (+)-C-Rel質(zhì)粒電泳結(jié)果；2為pCDNA3.1 (+)-C-Rel質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明方案做進一步詳細描述:
[0024]試驗例:
[0025]一、實驗材料
[0026]1.試驗菌株、細胞及質(zhì)粒
[0027]E.coliDH5 a、pMD19_T、pDNA3.1 ( + )真核表達載體由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心保存；豬前腔靜脈血；
[0028]2.相關(guān)試劑
[0029]2 X TaqPCRMasterMix,限制性內(nèi)切酶、EcoR1、XhoI，pMD19-TSimpleVector,Marker III, DL2000 ,質(zhì)粒pcDNA3.1(+)購自Invitrogen ;瓊脂糖、溴化乙錠等購自Sigma公司；DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；
[0030]二、實驗方法
[0031](一)引物設(shè)計與合成[0032]以C-Rel為模板，設(shè)計并合成特異性引物P1、P2擴增C-Rel基因，跨度1803bp，Pl引入GCCACC序列及酶切位點EcoR I，P2引入CTCGAG序列及酶切位點Xho I，引物為:
[0033]Pl:5，-GAATTCGCCACCATGGGACACTATTCACAACGTGGGTATAAC-3，
[0034]P2:5，-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAAAACTCAAATGCAA-3，
[0035]( 二)C-Rel-基因片段的克隆及測序
[0036]1.豬外周血淋巴細胞的分離及cDNA的合成[0037]前腔靜脈采集豬血5mL，加入5mLCMF輕輕混勻，避光沿管壁將稀釋血液緩慢加入到等體積的淋巴細胞分離液表面，2000r/min，離心20min，取中間淋巴細胞層于另一離心管中，加入5mL生理鹽水重懸洗滌，2000r/min，離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌I次后用含10%胎牛血清的1640按1.5X 106/mL重懸淋巴細胞轉(zhuǎn)至細胞瓶，添加終濃度為7g/mL刀豆蛋白ConA,置5%C02培養(yǎng)箱37°C誘導培養(yǎng)，24h后收集細胞沉淀。
[0038]加入ImLRNAi sopIus吹打混勻，靜置5min后加入200 μ L氯仿充分混勻，靜置5min, 12000r/min,離心5min ;取上清，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置15min,13000r/min, 15min ;棄上清,加入ImL冰乙醇,室溫靜置5min, 12000r/min,離心5min ;棄上清，用滅菌濾紙條吸干液體，室溫放置5min，待無酒精味后；加入20 μ LRNase-freeffater溶解RNA，獲得RNA在_20°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0039]2.獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄
[0040](I)反轉(zhuǎn)錄體系IOul:
[0041 ] 5XPrimerScriptBuffer2ul
[0042]PrimerScriptRT-EnzymeMixI0.5ul
[0043]OligodT0.5ul
[0044]Randomprimer0.5ul
[0045]RNA3ul
[0046]H203.5ul
[0047](2)反轉(zhuǎn)錄條件:
[0048]37 °C25ul
[0049]85 °C5ul
[0050]4 °C①
[0051 ] (3)所得cDNA在-40V下保存?zhèn)溆?[0052]3.以cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，分別獲得C-Rel片段。
[0053](I)PCR反應(yīng)體系都是50 μ 1:
[0054]cDNA2 μ I
[0055]PrimeSTARMaxPremix(2Χ) 25 μ I
[0056]上下游引物(lOpmol/μI)各 I μ I
[0057]ddH2021 μ I
[0058](2)反應(yīng)條件:
[0059]預(yù)變性98°C 5min
[0060]變性98OlOs[0061 ]退火 56°C 15s[0062]延伸72°C35s to2 35 個循環(huán)
[0063]孵育72 °C 5min
[0064]4 °Coo
[0065]4.PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0066]取5ul的產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠，同時在另一上樣孔加3ulDL2000Marker作為對照，電泳完成后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，目的產(chǎn)物如圖1所示，若無雜條帶，且擴增大小與預(yù)期相符，則用于回收和測序。
[0067]5.PCR擴增片段的純化
[0068](I)將含目的片段C-Rel的瓊脂糖塊切下，放入EP管中。
[0069](2)按每IOOmg瓊脂糖加入400_600ul的比例加入SI液，置于65°C水浴至膠完全溶化，每兩分鐘顛倒混勻一次。
[0070](3)將獲得的DNA溶膠液全部轉(zhuǎn)移至一個干凈的HiBindDNAMini柱子中，室溫下
10,OOOxg離心I分鐘.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)。
[0071](4)移 300ulBindingBuffer (XP2)至柱子中,室溫下,10, OOOxg 下離心 Imin0
[0072](5)棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi).移700ulSPffffashbuffer (已用無水乙醇稀釋的)至柱子中，室溫下10，OOOxg離心lmin。
[0073](6)重復(fù)用7001113?驟3811131^€61'洗漆柱子.室溫下10，OOOxg離心lmin。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi).室溫下，13，OOOxg離心2min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體。
[0074](7)把柱子裝在一個干凈的EP管上，加入15~30ul (具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度)的ElutionBuffer到柱基質(zhì)中央，室溫放置lmin, 13, OOOxg離心Imin以洗脫DNA。貯存于-20°C備用。
[0075]6.PCR回收產(chǎn)物與T載體的連接
[0076]連接體系如下:
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種豬NF-KappaBC-Rel亞基的真核表達載體的構(gòu)建，其特征在于，所述載體為pcDNA3.1-C-Rel重組載體，該重組載體是通過以下方法構(gòu)建獲得的: 步驟一、PMD19-T-C-Rel重組質(zhì)粒的構(gòu)建:采集豬前腔靜脈血，分離出淋巴細胞獲得cDNA，再用引物P1、P2擴增出C-Rel目的片段，構(gòu)建PMD19-T_C-Rel重組質(zhì)粒； 步驟二、C-Rel基因轉(zhuǎn)錄片段的獲得:以PMD19-T-C-Rel重組質(zhì)粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，將酶切的目的片段用膠回收試劑盒回收，用于連接反應(yīng)； 步驟三、pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒的酶切:以pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒為模板，進行EcoR I和Xho I的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂凝膠電泳后，膠回收試劑盒進行大片段回收，-20°C保存?zhèn)溆茫? 步驟四、連接反應(yīng)=C-Rel基因片段和pcDNA3.1(+)載體片段按3:1摩爾比例，在連接酶的作用下，置于4°C反應(yīng)過夜； 步驟五、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細胞，即:取連接產(chǎn)物IOul加入200ulDH5a感受態(tài)細胞，冰浴30min，42°C 90s,再冰浴5min，加入1mlLB液體培養(yǎng)基，37 °C震蕩培養(yǎng)60min，取200ul菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12_18h ； 步驟六、挑選單個疑似菌落用EcoR I和Xho I進行雙酶切鑒定，將初步鑒定陽性的pcDNA3.1-C-Rel重組質(zhì)粒進行測序，比較重組質(zhì)粒序列與GenBank中的目的片段序列的一致性。
2.如權(quán)利要求1所述的載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該載體構(gòu)建步驟一中，針對C-Rel基因的特異性 引物為:
【文檔編號】C12N15/79GK103882049SQ201410124019
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】徐志文, 朱玲, 付夢謹 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學