魚鰓細胞系的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種魚鰓細胞系的建立方法，包括用抗生素水在室溫下處理暫養(yǎng)的健康魚類，用冰水將魚體麻醉后浸入5%二氯乙醚消毒5min，再用70%乙醇棉球?qū)︳~體表面進行滅菌處理，然后在超凈臺內(nèi)將鰓組織切成0.8-1.51mm3的小塊，用含有抗生素的Leibovitz’sL-15培養(yǎng)基沖洗3次，接種到含有5mLLeibovitz’sL-15完全培養(yǎng)基的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入溫度為28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4d換1次完全培養(yǎng)基液；當鰓組織細胞達到95%融合時，按照標準的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶傳代培養(yǎng)，如此傳代培養(yǎng)至50代，便建立起魚鰓細胞系。本發(fā)明方法使難于培養(yǎng)的魚鰓細胞得到了順利培養(yǎng)，能在體外穩(wěn)定生長并建系成功，可傳代超過50代，并能穩(wěn)定增殖，成為無限細胞系。
【專利說明】魚鰓細胞系的建立方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于魚類細胞培養(yǎng)【技術(shù)領域】，特別涉及一種魚鰓細胞系的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]魚類組織培養(yǎng)及細胞系的發(fā)展對于病毒、毒物、致癌物質(zhì)的分離和細胞生理學、基因表達等具有重要的意義。Wolf和Quimby等(1962)從虹鱒性腺分離培養(yǎng)了第一個魚類細胞系-RTG-2。迄今為止,該細胞系已經(jīng)廣泛應用于病毒學和毒物學研究。魚類細胞系已經(jīng)在魚類免疫學、毒理學、生態(tài)毒理學、內(nèi)分泌學、病毒性、生物醫(yī)學研究、疾病防治、生物技術(shù)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和輻射生物學等領域作出了重要貢獻。細胞培養(yǎng)系統(tǒng)還為顯帶技術(shù)的應用提供了最佳的染色體制備方法。魚類細胞系已經(jīng)廣泛用作病毒性、基因表達和水產(chǎn)毒理學研究的體外模型。此后，開發(fā)魚類細胞系的工作取得了很大進展，細胞系數(shù)量大幅增至283個。大多數(shù)魚類細胞系來源于淡水或溯河性魚類。對魚類細胞系或細胞培養(yǎng)的知識在發(fā)達國家很成熟，但是文獻資料顯示，中國在這一領域的資料非常有限，特別是在魚類細胞系的培養(yǎng)方面更加稀少。
[0003]魚鰓是維持體內(nèi)平衡的非常重要的器官。鰓上皮細胞有很多功能，包括氣體交換、酸堿平衡和離子調(diào)節(jié)、廢物的排泄等。這些功能對水、離子和水通過由三種復雜細胞(呼吸細胞，氯細胞，粘液細胞)構(gòu)成的上皮從而直接與外界環(huán)境進行接觸是非常必要的。鰓上皮與水接觸時必須要適應外部環(huán)境，如溫度，溶解氧，pH,或污染物，從而維持或調(diào)節(jié)其正常功能。許多在體研 究已經(jīng)表明魚鰓在遇到環(huán)境干擾時的功能及其調(diào)節(jié)作用。例如，使用探針(抗體，cDNA)或拮抗劑已經(jīng)證明某些離子轉(zhuǎn)運蛋白參與滲透調(diào)節(jié)和酸堿調(diào)節(jié)。然而，由于魚鰓上皮結(jié)構(gòu)復雜，要想更好地理解鰓的功能，特別是細胞類型及細胞之間的相互作用，進行體外魚鰓細胞系/的建立或魚鰓的培養(yǎng)迫在眉睫。
[0004]目前所用的幾種魚鰓體外培養(yǎng)方法都有其各自的優(yōu)缺點。第一種體外培養(yǎng)方法是分離新鮮的鰓上皮細胞以獲得有關呼吸細胞及富含線粒體細胞的離子轉(zhuǎn)運信息。另一種體外培養(yǎng)方法是器官培養(yǎng)系統(tǒng)(分離鰓絲并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)f 4 d)。該技術(shù)已經(jīng)有可能測量皮質(zhì)醇或銅對幾種鰓參數(shù)的影響。第三種方法是建立了幾種魚鰓細胞系。RTgill-Wl細胞系已經(jīng)被用于毒理學和病原體試驗研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種魚鰓細胞系的建立方法，為魚類生理學、免疫學、毒理學、生態(tài)毒理學、內(nèi)分泌學、病毒性、生物醫(yī)學研究等研究提供技術(shù)支持和保障。
[0006]本項發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成的。
[0007]本發(fā)明的魚鰓細胞系的建立方法，包括如下步驟:
(1)用含500IU/mL青霉素和500 μ g/mL鏈霉素的抗生素水在室溫下處理暫養(yǎng)的健康魚類；
(2)將(I)處理的魚體用冰水麻醉后，浸入5%的二氯乙醚消毒5min，然后用70%乙醇的棉球?qū)︳~體表面進行滅菌處理；
(3)將(2)處理的魚體放在超凈臺內(nèi)，在無菌條件下將鰓組織切成0.8-1.51 mm3的小塊，然后用含有抗生素的Leibovitz’ s L-15培養(yǎng)基沖洗3次；
(4)將(3)獲得的組織片段接種到含有5mL Leibovitz’s L-15完全培養(yǎng)基的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入溫度為28。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 -4 d換I次完全培養(yǎng)基液；
(5)當(4)的組織細胞達到95%融合時，按照標準的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶傳代培養(yǎng)，如此傳代培養(yǎng)至50代，便建立起魚鰓細胞系。
[0008]所述步驟(3)中的抗生素種類及劑量分別為:500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素和2.5 μ g/mL兩性霉素。
[0009]所述步驟(3)中所用的Leibovitz’ s L-15培養(yǎng)基為市購產(chǎn)品。
[0010]所述步驟(4)中所用的Leibovitz’ s L-15完全培養(yǎng)基的組分為:Leibovitz’sL-15培養(yǎng)基，15% (V/V)胎牛血清，500 IU/mL青霉素，500 μ g/mL鏈霉素，2.5 μ g/mL兩性霉素O
[0011]所述步驟(4)中的胎牛血清為市購的滅活胎牛血清。
[0012]所述步驟(5)中所用的胰蛋白酶消化方法中所用的試劑為胰蛋白酶-EDTA溶液磷酸緩沖液，即:0.25%胰蛋白酶和0.0296ETDA。
[0013]本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果:采用本發(fā)明的技術(shù)方案，對魚鰓細胞進行了原代及傳代培養(yǎng)，取得了較好的培養(yǎng)效果，從而建立了魚鰓細胞系，使難于培養(yǎng)的魚鰓細胞得到了順利培養(yǎng)，能在體外穩(wěn)定生長并建系成功。所培養(yǎng)的魚鰓細胞中，由于增殖而進行傳代培養(yǎng)，并且讓細胞系度過了傳代的危機，傳代超過50代，并能穩(wěn)定增殖，成為無限細胞系。從而為魚類生理學、免疫學、毒理學、生態(tài)毒理學、內(nèi)分泌學、病毒性、生物醫(yī)學研究等研究提供技術(shù)支持和保障。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明的魚鰓細胞系的建立方法，包括如下步驟:
(1)將實驗室馴化的健康鯉魚幼魚放在含500IU/mL青霉素和500 μ g/mL鏈霉素的抗生素處理水中，溫度22.0 - 24.0° C ;然后用冰水將幼魚麻醉后,浸入5%的chlorex消毒5 min,最后用70%乙醇棉球酒精棉球?qū)Ⅳ~體表面消毒；
(2)將表面消毒后的幼魚放入超凈臺內(nèi)解剖取鰓，將鰓組織在無菌條件下切成約Imm3的小塊，并用含有500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素和2.5 μ g/mL兩性霉素的市購Leibovitz’ s L-15培養(yǎng)液沖洗3次；
(3)制備好Leibovitz’sL-15完全培養(yǎng)基,其組分包括市購市購的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基、15%(V/V)市購的滅活胎牛血清、500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素和2.5 μ g/mL兩性霉素；然后將鯉魚鰓組織片段接種到含有5 mL Leibovitz’s L_15完全培養(yǎng)基的25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入溫度為28。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d或4 (!換I次完全培養(yǎng)基液；當鯉魚鰓組織的細胞達到95%融合時，按照標準的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶傳代培養(yǎng)；其中胰蛋白酶消化方法中所用的試劑為胰蛋白酶-EDTA溶液磷酸緩沖液，即:0.25% 胰蛋白酶和 0.0296ETDA。
[0015](4)如此傳代培養(yǎng)至50代，即建立起魚鰓細胞系。
【權(quán)利要求】
1.魚鰓細胞系的建立方法,包括如下步驟: (1)用含500IU/mL青霉素和500 μ g/mL鏈霉素的抗生素水在室溫下處理暫養(yǎng)的健康魚類； (2)將(1)處理的魚體用冰水麻醉后，浸入5%的二氯乙醚消毒5min，然后用70%乙醇的棉球?qū)︳~體表面進行滅菌處理； (3)將(2)處理的魚體放在超凈臺內(nèi)，在無菌條件下將鰓組織切成0.8-1.51 mm3的小塊，然后用含有抗生素的Leibovitz’ s L-15培養(yǎng)基沖洗3次； (4)將(3)獲得的組織片段接種到含有5mL Leibovitz’s L-15完全培養(yǎng)基的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放入溫度為28。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 -4 d換1次完全培養(yǎng)基液； (5)當(4)的組織細胞達到95%融合時，按照標準的胰蛋白酶消化方法，以1:2的比例分瓶傳代培養(yǎng)，如此傳代培養(yǎng)至50代，便建立起魚鰓細胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚鰓細胞系的建立方法，其特征在于，所述步驟(3)中的抗生素種類及劑量分別為:500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素和2.5 μ g/mL兩性霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚鰓細胞系的建立方法，其特征在于，所述步驟(3)中所用的Leibovitz’ s L-15培養(yǎng)基為市購產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚鰓 細胞系的建立方法，其特征在于，所述步驟(4)中所用的Leibovitz’s L-15完全培養(yǎng)基的組分為:Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基、15% (V/V)胎牛血清、500 IU/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素和2.5 μ g/mL兩性霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚鰓細胞系的建立方法，其特征在于，所述步驟(4)中的胎牛血清為市購的滅活胎牛血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚鰓細胞系的建立方法，其特征在于，所述步驟(5)中所用的胰蛋白酶消化方法中所用的試劑為胰蛋白酶-EDTA溶液磷酸緩沖液，即:0.25%胰蛋白酶和.0.02%ETDAo
【文檔編號】C12N5/071GK103937736SQ201410133077
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】曹謹玲, 陳劍杰, 羅永巨, 王俊東, 李宏全, 宋晶 申請人:山西農(nóng)業(yè)大學