一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法。本發(fā)明采用溫和的弱酸法提取其中天然生物活性多肽，然后再將溫和弱酸法提取多肽過(guò)程中所殘留和廢棄的沉淀物質(zhì)再采用酶解法進(jìn)行水解，即將同一種原料分別采用酸解法和酶解法聯(lián)合進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其提取方法不僅體現(xiàn)在被提取的原料或資源得到充分利用、且使原廢棄物得到最大限度使用、并使提取制備的復(fù)合多肽的得率明顯提高；而且，節(jié)省寶貴的自然資源、減少環(huán)境污染、安全隱患消除、生產(chǎn)周期縮短、提取試劑和儀器減少、投資和生產(chǎn)成本減低、多肽生物利用度提高、未來(lái)使用應(yīng)用范圍擴(kuò)大、人體應(yīng)用價(jià)值提高。
【專利說(shuō)明】一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)美容保健及抗衰老產(chǎn)品等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是涉及一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1、多肽及其應(yīng)用的技術(shù)背景
[0003]肽類(p印tide)分為寡肽和多肽，是由兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸縮合并以肽鍵相連的一類生物活性物質(zhì)，它是蛋白質(zhì)的中間產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的片段。肽類物質(zhì)與生物體內(nèi)其它物質(zhì)相比，其最大的特點(diǎn)是它們具有很高的生物活性和生物多樣性。正是因?yàn)樗鼈兙哂袕V泛的生物活性，也被稱之為活性生物多肽。多肽(polypeptide)是肽類的其中一部分，也是構(gòu)成生命的最基本和重要的物質(zhì)之一。事實(shí)上，活性生物多肽廣泛分布并存在于大自然之中，生物體內(nèi)有很多生物活性物質(zhì)大都是以多肽的結(jié)構(gòu)形式存在的。大量科學(xué)研究表明，活性生物多肽實(shí)際上是由20余種天然氨基酸通過(guò)肽鏈以不同的排列方式和形態(tài)構(gòu)成，即從兩肽到多肽的復(fù)雜線性和環(huán)形結(jié)構(gòu)形成，它們均是源于蛋白質(zhì)中間產(chǎn)物及天然構(gòu)象的多功能化合物。
[0004]在生物體內(nèi)，這些活性生物多肽不僅以多肽分子結(jié)構(gòu)及天然構(gòu)象的形式存在，且也以天然生物活性的作用方式在機(jī)體發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)。正如有些學(xué)者所言:活性生物多肽可謂生物體生命象征的基本存在形式，它在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝中起著至關(guān)重要的生物學(xué)作用。而且，人體內(nèi)的各種生命活動(dòng)、代謝進(jìn)程和生理機(jī)能等，也幾乎都是受特定氨基酸序列組成的生物活性多肽或蛋白質(zhì)所主導(dǎo)和調(diào)控。
[0005]理論上講，這些活性生物多肽的生物活性主要表現(xiàn)在它們能夠參與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成代謝和分解代謝，能夠促進(jìn)生物體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞的有絲分裂與增殖分化，能夠主動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)的合成與分泌，能夠確保生命遺傳基因的表達(dá)與復(fù)制，能夠保證細(xì)胞中生命物質(zhì)的正常合成及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和的數(shù)量、質(zhì)量和速度；同時(shí)，還能夠提高和調(diào)控機(jī)體生命活動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)的生理利用率與生物利用度，增強(qiáng)機(jī)體組織與細(xì)胞的新陳代謝，進(jìn)而，有效調(diào)控人體的生長(zhǎng)與發(fā) 育、成長(zhǎng)與成熟、衰老與疾病。或者說(shuō)，活性生物多肽在人體內(nèi)所有的細(xì)胞以及由細(xì)胞組成的組織、器官乃至整個(gè)生理系統(tǒng)都受活性多肽的調(diào)節(jié)和控制，它決定和控制著人體蛋白質(zhì)的合成，而蛋白質(zhì)又是生命最為重要的表現(xiàn)形式。長(zhǎng)期以來(lái)，很多人根據(jù)分子的大小和形狀去判斷其吸收與否，及小分子物質(zhì)容易被吸收和利用的觀點(diǎn)而片面地認(rèn)為，人體所需的蛋白質(zhì)主要依靠其最終分解產(chǎn)物氨基酸的形式吸收后補(bǔ)充。然而，近年來(lái)的科學(xué)研究卻證實(shí)，人體所吸收蛋白質(zhì)的主要形式不都是氨基酸，而是活性生物肽?；钚陨锒嚯呐c人類健康、抗衰老及延年益壽等密切相關(guān)、且意義重大。這是因?yàn)?，活性生物多肽作為機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育的智能化生物監(jiān)控器，能主動(dòng)調(diào)節(jié)，并有效監(jiān)視和調(diào)控機(jī)體內(nèi)各個(gè)細(xì)胞中蛋白產(chǎn)物的表達(dá)、翻譯、復(fù)制等過(guò)程。當(dāng)機(jī)體生命活動(dòng)正常及各類細(xì)胞分裂、增殖正常時(shí)，活性生物多肽以確保生命活動(dòng)和細(xì)胞正常分裂和蛋白質(zhì)正常合成。當(dāng)機(jī)體生命活動(dòng)異常及各細(xì)胞增殖異常時(shí)，活性生物多肽即會(huì)立即發(fā)現(xiàn)并實(shí)施對(duì)錯(cuò)誤細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控、并可能停止對(duì)它進(jìn)行主動(dòng)修復(fù)和遷移，且通過(guò)及時(shí)剪切和剪接、修正和修復(fù)異常錯(cuò)誤細(xì)胞以保證蛋白質(zhì)正常合成和人體處于健康狀態(tài)。因此，目前學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，活性生物多肽不僅是機(jī)體生命活動(dòng)的主因，也是人體細(xì)胞健康和整體抗衰老的要素?？梢哉f(shuō)，機(jī)體如果沒(méi)有活性生物多肽，就等于機(jī)體沒(méi)有生物活性物質(zhì)，而機(jī)體也就失去了生命的活力和代謝的動(dòng)力。
[0006]2、目前多肽的提取制備方法及其所存在的缺陷或不足:
[0007]目前，以大自然中活的生物(包括動(dòng)物及其臟器、植物及中草藥、微生物、昆蟲(chóng)、海洋生物等)為原料提取和制備多肽的方法很多，包括酸水解法、堿水解法、酶水解法、酸醇提取法、膜分離法、超聲提取法、微波提取法、以及兩種方法結(jié)合應(yīng)用等方法。然而，與其他生物小分子的提取、分離方法不同的是，蛋白質(zhì)和多肽類等生物大分子化合物的提取、分離是一個(gè)梯度純化的過(guò)程，即在不改變這些化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的條件下，盡量將提取物中的雜質(zhì)分離出來(lái)，因此，提取的條件必須是較為溫和的，且不會(huì)明顯改變蛋白質(zhì)和多肽的理化性質(zhì)及其生物活性和抗氧化活性等。
[0008]但采用單純的酸解或堿解法提取多肽，若所選擇的溶液體系酸性或堿性太強(qiáng)，都可能使被提取物發(fā)生不可逆變性或過(guò)度水解以及分子構(gòu)象等發(fā)生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學(xué)活性和功能，從而使所提取的多肽失去應(yīng)有的功效作用和應(yīng)用價(jià)值。采用酶解法通常選用的具有內(nèi)切功能的各種蛋白水解酶。如采用酶解法時(shí)使用的水解酶量過(guò)大或pH條件過(guò)于劇烈等，同樣可能使被提取物發(fā)生不可逆變性或過(guò)度水解以及分子構(gòu)象等發(fā)生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學(xué)活性和功能，從而使所提取的多肽失去應(yīng)有的功效作用和應(yīng)用價(jià)值。因?yàn)榫S持酸性蛋白酶的最適合pH值為2.0~2.5，堿性蛋白酶的最適PH值為11，其反應(yīng)條件均較為劇烈，這不僅對(duì)設(shè)備的要求較高且水解度不容易控制，在生產(chǎn)中不具有實(shí)際意義。而中性蛋白酶雖然是從蛋白質(zhì)內(nèi)部將肽鍵打開(kāi)，專一性突出，反應(yīng)條件較為溫和(PH = 7)，水解效力適中，操作易于控制，并且不會(huì)破壞氨基酸結(jié)構(gòu)和其它營(yíng)養(yǎng)成分，在有效成分 的保留上有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且價(jià)格低廉，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，但如水解酶量過(guò)多或過(guò)少、酶類選擇不合理、或pH條件太劇烈，其提取得率往往偏低、又得不償失。而且，為了阻止在完成多肽提取后所加入的蛋白酶繼續(xù)發(fā)生水解、通常需要煮沸進(jìn)行滅酶活，這樣可能在一定程度上造成多肽生物活性的降低或破壞。
[0009]而采用酸醇法提取多肽，其提取液體的pH值通常在3.5或以下才能有更好的提取得率和分離效果，然而，此pH值雖然不能嚴(yán)重改變其分子結(jié)構(gòu)和生物活性，但此法提取的多肽在PH高于3.5或以上以及一般條件下較難溶解，這不僅影響其溶解度，也影響著實(shí)際應(yīng)用。如果為了該提取多肽的溶解而將其溶解體系的PH降低到3.5或以下，則在某些領(lǐng)域，如皮膚美容品和化妝品中難以直接應(yīng)用。而且，采用酸醇法提取多肽，使用的乙醇不僅增加提取成本，又污染環(huán)境、影響操作者的健康，而且，殘存在多肽提取液中的乙醇其分離、剔除以及乙醇的后期回收等過(guò)程工藝繁瑣、難度較大。而單純使用超濾法提取分離多肽，雖然方法簡(jiǎn)單、適合規(guī)模化生產(chǎn)，但膜的堵孔現(xiàn)象、實(shí)際使用壽命和成本、以及多肽提取得率等技術(shù)瓶頸等尚需要進(jìn)一步完善和改進(jìn)。而且，目前采用的多肽超聲提取法、微波提取法等也不同程度存在著這樣或那樣的問(wèn)題或不足。為此，現(xiàn)在需要設(shè)計(jì)和研制一種更加適合應(yīng)用的復(fù)合多肽及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明的目的是針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的缺點(diǎn)和問(wèn)題加以改進(jìn)、創(chuàng)新，提供一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法，并克服和解決上述【背景技術(shù)】中存在的缺點(diǎn):
[0011 ] (I)單純的酸解或堿解法提取多肽，若所選擇的溶液體系酸性或堿性太強(qiáng)，都可能使被提取物發(fā)生不可逆變性或過(guò)度水解以及分子構(gòu)象等發(fā)生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學(xué)活性和功能，從而使所提取的多肽失去應(yīng)有的功效作用和應(yīng)用價(jià)值
[0012](2)酶解法通常選用的具有內(nèi)切功能的各種蛋白水解酶。如采用酶解法時(shí)使用的水解酶量過(guò)大或PH條件過(guò)于劇烈等，同樣可能使被提取物發(fā)生不可逆變性或過(guò)度水解以及分子構(gòu)象等發(fā)生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學(xué)活性和功能，從而使所提取的多肽失去應(yīng)有的功效作用和應(yīng)用價(jià)值。
[0013](3)酸醇法提取多肽，其提取液體的pH值通常在3.5或以下才能有更好的提取得率和分離效果，但此法提取的多肽在PH高于3.5或以上以及一般條件下較難溶解，這不僅影響其溶解度，也影響著實(shí)際應(yīng)用。如果為了該提取多肽的溶解而將其溶解體系的PH降低到3.5或以下，則在某些領(lǐng)域，如皮膚美容品和化妝品中難以直接應(yīng)用。而且，采用酸醇法提取多肽，使用的乙醇不僅增加提取成本，又污染環(huán)境、影響操作者的健康，而且，殘存在多肽提取液中的乙醇其分離、剔除以及乙醇的后期回收等過(guò)程工藝繁瑣、難度較大。
[0014](4)單純使用超濾法提取分離多肽，雖然方法簡(jiǎn)單、適合規(guī)模化生產(chǎn)，但膜的堵孔現(xiàn)象、實(shí)際使用壽命和成本、以及多肽提取得率等技術(shù)瓶頸等尚需要進(jìn)一步完善和改進(jìn).[0015]本發(fā)明所提供的一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法，正是針對(duì)上述存在的諸多問(wèn)題或局限設(shè)計(jì)研制和改進(jìn)創(chuàng)新一種復(fù)合多肽的提取制備方法，從而避免了當(dāng)前同類方法和技術(shù)的一些不足之處。
[0016]本發(fā)明一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0017](I)取新鮮的待提取物，勻漿后加入10~30倍重量的白醋，并將PH值調(diào)至3.5~4.5，再在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎處理O~40min ;將燒杯置于4°C冰箱中進(jìn)行磁力攪拌4~24h ;然后，12000r/min,離心20`min,沉淀稱重，同時(shí)收集上清液進(jìn)行超濾，I μ m膜粗濾，透過(guò)液進(jìn)行10萬(wàn)膜超濾，未透過(guò)濾液用于下個(gè)步驟提取，透過(guò)液再進(jìn)行I萬(wàn)膜超濾，最后進(jìn)行納濾，納濾液進(jìn)行冷凍干燥，即可得到復(fù)合酸解多肽，也可稱為復(fù)合天然多肽；
[0018](2)取步驟(1)所得的沉淀和未透過(guò)液，加入2倍體積的蒸餾水和中性蛋白酶，攪拌均勻，加入IM NaOH堿液將pH調(diào)至至5.5~7.5，在水浴溫度45~65°C下提取I~3h，結(jié)束后用白醋調(diào)酶解液至中性酶PH至4.0，終止酶解反應(yīng)，12000r/min，離心20min，收集上清液進(jìn)行超濾，I μ m膜粗濾，10萬(wàn)膜超濾，透過(guò)液I萬(wàn)膜超濾，濾液進(jìn)行納濾，納濾獲得的濃縮液冷凍干燥得到復(fù)合酶解多肽。
[0019]步驟(1)或(2)所述的透過(guò)液進(jìn)行超濾，它包括兩次超濾，第一次經(jīng)過(guò)10萬(wàn)膜超濾，第二次經(jīng)過(guò)I萬(wàn)膜超濾。
[0020]步驟(1)中采用蒸餾水調(diào)節(jié)白醋的PH值；步驟⑵所述調(diào)節(jié)PH值的堿液為I摩爾的氫氧化鈉；步驟(1)或(2)所述的冷凍干燥條件為-45°c預(yù)凍lh，-80°c，4.5Pa冷凍干燥約20h。
[0021]本發(fā)明將同一種原料分別采用酸解法和酶解法聯(lián)合進(jìn)行復(fù)合多肽提取，不僅其聯(lián)合提取制備技術(shù)本身就具有明顯創(chuàng)新性，而且，其中一些提取制備條件、工藝路線設(shè)計(jì)、具體操作方法等均有鮮明創(chuàng)新。[0022]本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)主要表現(xiàn)在三個(gè)方面:第一，采用食用級(jí)白醋進(jìn)行酸解法提??；第二，采用食用級(jí)中性蛋白水解酶進(jìn)行酶解提??；第三，采用級(jí)聯(lián)超濾進(jìn)行提取分離等。
[0023]1、采用食用級(jí)白醋進(jìn)行酸解法提取的創(chuàng)新點(diǎn)主要有:
[0024](I)采用食用白醋水解蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其提取工藝更加簡(jiǎn)單，甚至可以在確定該食用白醋來(lái)源和一定比例時(shí)直接將食用白醋添加至被提取組織或原料勻漿之中直接進(jìn)行提取，與傳統(tǒng)多肽提取制備相比，不僅省去了多次添加提取試劑的繁瑣工藝，而且還省去了提取試劑配制和pH調(diào)校等繁瑣步驟。
[0025](2)采用食用白醋水解蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其提取工藝更有效成效，體現(xiàn)在采用本發(fā)明方法所提取的復(fù)合多肽不僅工藝穩(wěn)定、得率較高、生物活性保持較好、且在實(shí)際應(yīng)用時(shí)的相溶性及溶解性更佳。
[0026](3)采用食用白醋水解蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其提取工藝更安全，這不僅是因?yàn)檎麄€(gè)提取過(guò)程不需要再添加乙醇等易燃易爆性化學(xué)試劑，免除后續(xù)提取分離的繁瑣，降低提取制備成本，減少環(huán)境污染，而且直接用食用白醋提取，其后期應(yīng)用無(wú)論是經(jīng)口服途徑、還是經(jīng)皮外用等均更加安全可靠。
[0027](4)采用食用白醋水解蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其提取工藝更方便；這不僅因?yàn)閷⑹秤眉?jí)白醋作為提取溶液條件溫和、提取簡(jiǎn)單、且提取原料來(lái)源十分方便，而且，食用級(jí)白醋溶液的溫和條件，克服了提取溶液酸性或堿性太強(qiáng)都可能使被提取物的多肽發(fā)生劇烈變性或水解以及分子構(gòu)象發(fā)生改變并逐步失去生物活性。
[0028](5)由于多肽源于蛋白，故應(yīng)先使帶有活性肽的蛋白質(zhì)溶解。復(fù)合多肽提取的勻漿液，傳統(tǒng)方法可用水溶液、鹽溶液或緩沖溶液等作為提取溶劑，而本發(fā)明采用食用級(jí)白醋水溶液作為其提取溶劑，實(shí)驗(yàn)證明，它不僅能夠充分溶解蛋白質(zhì)或肽類化合物，而且通過(guò)調(diào)節(jié)穩(wěn)定的PH，使其提取的微環(huán)境及其穩(wěn)定性更`好，不易與樣品發(fā)生反應(yīng)，可更好地保證所提取的多肽不失去生物活性。這是因?yàn)槭秤眉?jí)白醋水溶液為弱酸溶液，而提取復(fù)合多肽的蛋白質(zhì)在弱酸性環(huán)境中不僅其肽鏈可被溫和水解、且復(fù)合多肽在該溶液中的溶解度比在水中更大，而且食用級(jí)白醋水溶液為弱酸溶液的存在尚不會(huì)改變擬提取復(fù)合多肽的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性，也不會(huì)影響其良好的生物活性和抗氧化活性。
[0029]2、采用食用級(jí)中性蛋白水解酶進(jìn)行酶解法提取的創(chuàng)新點(diǎn)主要有:
[0030](I)本發(fā)明采用食用級(jí)中性蛋白水解酶水解蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行剩余或殘留物質(zhì)進(jìn)行復(fù)合多肽提取，該中性蛋白酶是具有內(nèi)切功能的中性蛋白酶，而中性蛋白酶主要從蛋白質(zhì)內(nèi)部將肽鍵打開(kāi)，專一性突出，反應(yīng)條件溫和(pH = 7.0)，水解效力適中，操作易于控制，并且不會(huì)破壞氨基酸結(jié)構(gòu)和其它營(yíng)養(yǎng)成分，在有效成分的保留上有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且價(jià)格低廉，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0031](2)本發(fā)明采用食用級(jí)中性蛋白水解酶水解蛋白質(zhì)多肽鏈進(jìn)行剩余或殘留物質(zhì)進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其提取所采用溶液的酸堿度值控制在中性的條件之中(PH7.0)，這樣可避免使用酸性蛋白水解酶和堿性蛋白水解酶水解蛋白質(zhì)多肽鏈時(shí)必須使用過(guò)強(qiáng)的酸性或堿性環(huán)境條件，而提取溶液的酸性或堿性過(guò)強(qiáng)，都可能使被提取的復(fù)合多肽發(fā)生變性或水解以及分子構(gòu)象發(fā)生改變并逐步失去生物活性。因?yàn)樗嵝缘鞍酌傅淖钸m合PH值為2.0~2.5，堿性蛋白酶的最適PH值為11，其反應(yīng)條件均較為劇烈，對(duì)設(shè)備的要求較高且水解度不容易控制，在生產(chǎn)中不具有實(shí)際意義。[0032]雖然，目前也有人曾使用過(guò)食用級(jí)中性蛋白水解酶進(jìn)行蛋白質(zhì)水解和多肽提取，但本發(fā)明通過(guò)我們自己的正交試驗(yàn)，探索并得到最佳的提取條件，而這，是與目前同類提取方法完全不同的，也是本發(fā)明的創(chuàng)新之處。
[0033]特別是，目前使用食用級(jí)中性蛋白水解酶進(jìn)行蛋白質(zhì)水解和多肽提取后需要加熱甚至高溫對(duì)該酶進(jìn)行滅活，而滅酶的溫度過(guò)高，都可能使被提取的復(fù)合多肽發(fā)生變性或水解以及分子構(gòu)象發(fā)生改變并逐步失去生物活性。而本發(fā)明則采用常溫或低溫超濾方式去除殘留水解酶，不僅減少工藝、節(jié)省能源，而且，可完整保留提取復(fù)合多肽的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性，也不會(huì)影響其良好的生物活性和抗氧化活性。
[0034]3、采用級(jí)聯(lián)超濾進(jìn)行提取分離的創(chuàng)新點(diǎn)主要有:
[0035](I)本發(fā)明設(shè)計(jì)并采用的是級(jí)聯(lián)超濾方法，即首先通過(guò)粗濾器初濾經(jīng)過(guò)自然沉淀的粗提液，這樣不僅可省去無(wú)大容量低溫離心機(jī)的條件限制，還可在常溫或低溫條件下有效過(guò)濾掉肉眼明顯可見(jiàn)的顆粒物。
[0036](2)本發(fā)明還設(shè)計(jì)了對(duì)經(jīng)過(guò)粗濾器過(guò)濾的粗提液再以10萬(wàn)分子量的超濾膜進(jìn)行截留，這樣它不僅可快速對(duì)粗濾液進(jìn)行第二次過(guò)濾，也可使提取液中某些肉眼不可見(jiàn)的不溶性微粒及雜蛋白或微生物、以及未經(jīng)完全酸解的大分子蛋白質(zhì)截留而除去，而且通過(guò)此法還可確保后續(xù)小分子超濾膜不被或少被異物堵塞，從而可提高提取分離復(fù)合多肽的效率和效果。
[0037](3)在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明再設(shè)計(jì)了 I萬(wàn)分子量的超濾膜，對(duì)經(jīng)過(guò)10萬(wàn)分子量的超濾膜超濾后的透過(guò)液再次進(jìn)行透過(guò)，使大于I萬(wàn)分子量和小于10萬(wàn)分子量的蛋白質(zhì)或非復(fù)合多肽等雜質(zhì)進(jìn)一步被分離或截留；同時(shí)，使小于I萬(wàn)分子量的復(fù)合多肽順利透過(guò)，從而使較低分子量的復(fù)合多肽得到進(jìn)一步的提取和分離。而這些小于I萬(wàn)分子量的復(fù)合多肽未來(lái)將可通過(guò)經(jīng)皮給藥途徑應(yīng)用。
[0038](4)本發(fā)明最后還設(shè)計(jì)了分子量為300納米以下的納濾膜，對(duì)經(jīng)過(guò)I萬(wàn)分子量的超濾膜超濾后的透過(guò)液進(jìn)行納濾，使小于I萬(wàn)分子量和大于300納米的復(fù)合多肽得以截留，這不僅起到常溫或低溫條件了快速濃縮大容量超濾透過(guò)液的目的，而且，還能將300納米以下的非復(fù)合多肽物質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽、非蛋白氮、激素等有效濾除，從而使復(fù)合多肽的純度進(jìn)一步提高。特別是，采用本發(fā)明的級(jí)聯(lián)超濾進(jìn)行提取分離，確保復(fù)合多肽提取條件完全溫和，這也與某些傳統(tǒng)多肽的提取、分離方法不同，而且，本發(fā)明正好符合復(fù)合多肽類提取、分離這樣一種梯度純化的過(guò)程，即在不改變這些多肽生物活性和多肽化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的條件下，盡量將提取物中復(fù)合多肽提取出來(lái)、而將那些非復(fù)合多肽的雜質(zhì)分離出去。
[0039]雖然，目前也有人曾使用過(guò)超濾膜進(jìn)行蛋白質(zhì)和多肽提取分離，但本發(fā)明通過(guò)我們自己設(shè)計(jì)的級(jí)聯(lián)超濾再結(jié)合納濾濃縮和分離技術(shù)探索并得到更好的綜合效應(yīng)，而這，并與目前同類提取方法在設(shè)計(jì)思路和實(shí)施方法有很大不同，而這，也是本發(fā)明的創(chuàng)新之處。 [0040]綜上所述，本發(fā)明主要具有以下有益效果，即本發(fā)明將同一種原料分別采用酸解法和酶解法聯(lián)合進(jìn)行復(fù)合多肽提取，其發(fā)明的有益效果，不僅體現(xiàn)在被提取的原料或資源得到充分利用、且使原廢棄物得到最大限度使用、并使提取制備的復(fù)合多肽的得率明顯提高；而且，節(jié)省寶貴的自然資源、明顯減少環(huán)境污染、安全隱患消除、生產(chǎn)周期縮短、提取試劑和儀器減少、投資和生產(chǎn)成本減低、生物利用度提高、未來(lái)使用應(yīng)用范圍擴(kuò)大、人體應(yīng)用價(jià)值提聞。[0041]本發(fā)明的有益效果具體表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面:
[0042](I)節(jié)省寶貴的自然資源:過(guò)去提取制備天然生物活性多肽一般采用單一方法進(jìn)行提取和制備，這些方法對(duì)提取單一多肽后的余料或其它多肽以及所謂的沉淀廢除物將直接丟棄而不會(huì)再回收和利用，造成本來(lái)寶貴的自然資源及蛋白多肽資源的大量浪費(fèi)。本發(fā)明則首先采用溫和的弱酸法提取其中天然生物活性多肽，然后再將溫和弱酸法提取多肽過(guò)程中所殘留和廢棄的沉淀物質(zhì)再采用酶解法進(jìn)行水解，如此可得到更多的數(shù)量和種類的多肽，節(jié)省和利用了本來(lái)就非常寶貴的自然資源。
[0043](2)節(jié)省能源、減少環(huán)境污染:過(guò)去提取制備天然生物活性多肽，常采用酸-醇提取法，該方法對(duì)提取多肽雖然經(jīng)典和傳統(tǒng)，但提取過(guò)程中使用乙醇量較大，有一定的環(huán)境污染和人體刺激；而且，由于提取所用的乙醇回收難度較大、或即使能夠使乙醇回收，但操作較為繁瑣、實(shí)際丟失較多，造成較大的能源浪費(fèi)和較明顯的環(huán)境污染、且存在較多的安全隱患。本發(fā)明直接采用單純食用級(jí)白醋以弱酸性條件進(jìn)行提取，省略乙醇添加，不僅節(jié)省能源、確保安全生產(chǎn)、且也大大減少環(huán)境污染及對(duì)長(zhǎng)期乙醇刺激對(duì)人體健康的影響。
[0044](3)投資和生產(chǎn)成本減低:過(guò)去大量提取制備天然生物活性多肽，無(wú)論采用酸-醇提取法，還是酶解法，其提取試劑較多、制備儀器和設(shè)備眾多，尤其在提取制備過(guò)程及多肽分離等環(huán)節(jié)，必須使用大容量低溫勻漿機(jī)、大容量冷凍離心機(jī)、超聲細(xì)胞破碎儀、透析、層析和梯度洗脫以及濃縮裝置等，甚至需要濾菌系統(tǒng)和有機(jī)溶劑回收體系等，其耗資較多、投資較大，但采用本發(fā)明方法，只要增加本發(fā)明設(shè)計(jì)和制造的級(jí)聯(lián)超濾和納濾系統(tǒng)，即可省去上述大部分儀器和設(shè)備及提取試劑，甚至無(wú)需冷凍離心和過(guò)濾除菌設(shè)備等，不僅使大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)合多肽的投資大大降低，而且也可使復(fù)合多肽的生產(chǎn)成本大大減少。
[0045](4)操作簡(jiǎn)便、易于產(chǎn)業(yè)化:本發(fā)明提取條件已通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、操作方法也基本程序化、且實(shí)施過(guò)程已經(jīng)簡(jiǎn)化，使整個(gè)提取制備操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)程序減少、生產(chǎn)周期縮短、且易于產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)，特別是本發(fā)明的納濾濃縮部分，不僅簡(jiǎn)便而快速、保留多肽生物活性，還可除去應(yīng)用中忌諱的某些激素類成分和重金屬離子等，這是過(guò)去傳統(tǒng)方法旋轉(zhuǎn)濃縮所無(wú)法達(dá)到的有益效果。
[0046](5)多肽提取效率及純度和得率均提高明顯:本發(fā)明采用酸解法和酶解法聯(lián)合提取，不僅大大減少蛋白及多肽資源浪費(fèi)，而且，大大提高了復(fù)合多肽的提取效率，特別是采用本發(fā)明的級(jí)聯(lián)超濾結(jié)合納濾提取法，使復(fù)合多肽提取的得率和純度等明顯提高。
[0047](6)生物利用度提高、未來(lái)使用應(yīng)用范圍擴(kuò)大、人體應(yīng)用價(jià)值提高:本發(fā)明提取制備的復(fù)合多肽，其顯著的特點(diǎn)是分子量較小、而生物活性較高，且含有多種功能性多肽等，因此，與傳統(tǒng)多肽提取法所制備的多肽相比，本發(fā)明提取制備的復(fù)合多肽其生物利用度更高、未來(lái)應(yīng)用范圍更大、人體應(yīng)用價(jià)值更好。總之，本發(fā)明提取制備多肽，其基本處理過(guò)程為單純物理過(guò)程，無(wú)任何相變。設(shè)備操作溫度低，避免了傳統(tǒng)工藝的種種弊端；而且，聯(lián)合體提取制備最終提取系統(tǒng)均采用先進(jìn)的超濾膜和納濾膜相結(jié)合的分離技術(shù)，其工藝簡(jiǎn)單，運(yùn)行穩(wěn)定可靠，處理效率高；同時(shí)，可以對(duì)首次提取制備過(guò)程中剩余蛋白資源及其有用物質(zhì)進(jìn)行多肽提取制備和綜合利用，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、環(huán)保雙贏；除此之外，多肽提取儀器和設(shè)備投資少、運(yùn)行費(fèi)用低、但提取制備多肽得率明顯提高。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0048]圖1.一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法工藝流程及技術(shù)路線。
[0049]圖2.海蝦酸解多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0050]圖3.Bicinchoninic acid(BCA)法測(cè)定奸酸解多肽正交試驗(yàn)得到的多肽含量
[0051]圖4.海蝦酸解正交試驗(yàn)結(jié)果因素指標(biāo)分析
[0052]圖5.海蝦酶解多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0053]圖6.BCA法測(cè)定鮮蝦酶解正交試驗(yàn)得到的多肽含量
[0054]圖7.海蝦酶解正交試驗(yàn)結(jié)果因素指標(biāo)分析
[0055]圖8.鮮蝦酸解正交試驗(yàn)所得鮮蝦天然多肽樣品20% SDS-PAGE圖
[0056]圖9.鮮蝦酶解多肽的20% SDS-PAGE圖
【具體實(shí)施方式】
[0057]本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種復(fù)合多肽聯(lián)合提取制備方法。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面以海蝦多肽提取為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0058]實(shí)施例1:海蝦復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法
[0059](I)酸解法海蝦復(fù)合多肽提取制備的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和制備方法
[0060]按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，準(zhǔn)確取一定量的新鮮海蝦，洗凈后浙干；添加一定量的預(yù)冷勻漿液，以后，立即置于組織勻漿器中進(jìn)行勻漿；待勻漿充分后，再稱重并記錄之；然后，即可進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)(如表1所示)。
[0061]表1L9-3-4正交表(軟件:正交設(shè)計(jì)助手II v3.1)
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合多肽的聯(lián)合提取制備方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)取新鮮的待提取物，勻漿后加入10~30倍重量的白醋，并將PH值調(diào)至3.5~4.5，再在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎處理O~40min ;將燒杯置于4°C冰箱中進(jìn)行磁力攪拌4~24h ;然后，12000r/min,離心20min,沉淀稱重，同時(shí)收集上清液進(jìn)行超濾，Ium膜粗濾,透過(guò)液進(jìn)行超濾，未透過(guò)濾液用于下個(gè)步驟提取，最后進(jìn)行納濾，納濾液進(jìn)行冷凍干燥，即可得到復(fù)合酸解多肽； (2)取步驟(1)所得的沉淀和未透過(guò)液，加入2倍體積的蒸餾水和中性蛋白酶，攪拌均勻，加入堿液將pH調(diào)至5.5~7.5，在水浴溫度45~65°C下提取I~3h，結(jié)束后用白醋調(diào)酶解液至中性酶PH至4.0,終止酶解反應(yīng)，12000r/min,離心20min，收集上清液進(jìn)行超濾，I μ m膜粗濾，透過(guò)液進(jìn)行超濾，濾液再進(jìn)行納濾，納濾獲得的濃縮液冷凍干燥得到復(fù)合酶解多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)或(2)所述的透過(guò)液進(jìn)行超濾，它包括兩次超濾，第一次經(jīng)過(guò)10萬(wàn)膜超濾，第二次經(jīng)過(guò)I萬(wàn)膜超濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中采用蒸餾水調(diào)節(jié)白醋的PH值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑵所述調(diào)節(jié)PH值的堿液為I摩爾的氫氧化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)或(2)所述的冷凍干燥條件為-45°C預(yù)凍lh，-80°C,4. 5Pa冷凍干燥約20h。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103882085SQ201410142330
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】楊永鵬, 郝林琳, 董萍, 丁克祥, 張?chǎng)? 左夏林, 虞偉民, 劉莉, 梁虹, 丁振華 申請(qǐng)人:楊永鵬, 董萍, 丁克祥