鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，該試劑盒包含：針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQIDNO:1序列設(shè)計的上游引物P1，該P(yáng)1的3’末端倒數(shù)第一個堿基與SEQIDNO:1第1454位堿基相同，其3’末端倒數(shù)第二個堿基與SEQIDN0:1第1453位堿基相同；針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQIDNO：2序列設(shè)計的上游引物P2，該P(yáng)2的3’末端倒數(shù)第二個堿基與SEQIDNO：2第1891位堿基相同；針對SEQIDNO:1或SEQIDNO：2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計的通用下游引物P3。本發(fā)明的試劑盒，可快速、簡便、準(zhǔn)確地區(qū)分鴨坦布蘇病毒自然感染強(qiáng)毒和弱毒疫苗免疫毒株，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，對于鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株的臨床廣泛應(yīng)用具有重要意義。
【專利說明】鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鴨坦布蘇病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株 和弱毒疫苗株的試劑盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 2010年4月以來，我國上海、浙江、江蘇等地發(fā)生了以肉鴨生長遲緩和蛋鴨產(chǎn)蛋 急劇下降為特征的一種傳染病，短短幾個月時間里，南方各省幾乎所有的蛋鴨場都受到了 該病的侵襲，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)的研究者通過病毒分離鑒定，病毒基 因組序列分析，動物回歸試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)證明該傳染病是由一種新的黃病毒--鴨坦布蘇病毒 (Duck Tembusu virus，DTMUV)所引起，該病毒屬于黃病毒屬Ntaya病毒群。鴨感染該病毒 后，主要的臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、沉郁、厭食等；蛋鴨出現(xiàn)產(chǎn)蛋量急劇下降甚至停止，肉鴨出 現(xiàn)生長遲緩，其主要病變?yōu)?，脾臟腫大明顯，產(chǎn)蛋鴨卵泡出血、變性、破裂。鴨坦布蘇病毒病 自2010年在華東部分地區(qū)首次發(fā)生后，迅速傳播到浙江、安徽、福建、江蘇等省份的主要水 禽養(yǎng)殖場，之后傳播到廣東、山東、河南、河北等省市，到目前為止全國大部分主要水禽養(yǎng)殖 地區(qū)均已受到該病的威脅。
[0003] 鴨坦布蘇病毒病在中國大陸首次發(fā)生，該病具有高度傳染性，并且一年四季都可 流行，給鴨坦布蘇病毒病的防控帶來了極大的困難。鴨坦布蘇病毒是新發(fā)病毒，對于該病 毒的流行性病學(xué)、致病機(jī)理、傳播媒介等方面的相關(guān)研究較少，對該病的防控難度較大，目 前預(yù)防該病最有效的方法是疫苗免疫。在之前的研究中，本實(shí)驗(yàn)室將一株鴨坦布蘇病毒分 離株在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)并克隆純化，獲得了致病力減弱的毒株，雛鴨感染 試驗(yàn)表明，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒的致病力逐漸降低，其中，傳代培養(yǎng)的第180代病毒 (FX2010-180P株）對鴨不致病，并且具有很好的免疫原性，可以作為鴨坦布蘇病毒病活疫 苗的候選毒株，與強(qiáng)毒株（FX2010)相比，鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）有34 個核苷酸發(fā)生突變，上述內(nèi)容已在中國專利申請CN2012102792326中公開。鴨坦布蘇病毒 弱毒疫苗株（FX2010-180P株）作為鴨坦布蘇病毒活疫苗，已經(jīng)申請臨床試驗(yàn)。在該鴨坦布 蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）生產(chǎn)和臨床應(yīng)用時，建立一種能夠區(qū)分鴨坦布蘇病毒 弱毒疫苗株（FX2010-180P株）與臨床上流行強(qiáng)毒株的方法是急需的。目前，區(qū)分鴨坦布蘇 病毒強(qiáng)、弱毒株的方法只能通過序列分析來實(shí)現(xiàn)。序列分析首先要分別擴(kuò)增出強(qiáng)、弱毒株特 征性的基因片段，然后通過克隆技術(shù)把目的片段連接到載體上，獲得含有目的片段的質(zhì)粒， 然后進(jìn)行測序分析；或者回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，然后再進(jìn)行測序分析。但是，序列分析方法繁 瑣、費(fèi)時，不利于實(shí)現(xiàn)對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的及時、快速鑒別診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決目前還不能快速、高效地鑒別診斷鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗 株的技術(shù)問題，提供一種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，該試劑盒可快 速、簡便、準(zhǔn)確地區(qū)分鴨坦布蘇病毒自然感染強(qiáng)毒和弱毒疫苗免疫毒株，其特異性強(qiáng)、靈敏 度高、重復(fù)性好。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 在本發(fā)明的一個方面，提供了一種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑 盒，所述試劑盒包含：
[0007] 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO :1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P1， 該上游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :1第1454位堿基相同，該P(yáng)l的3' 末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :1第1453位堿基相同；
[0008] 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物 P2,該上游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1891位堿基相同；
[0009] 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計 的通用下游引物P3。
[0010] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試 劑盒，所述試劑盒包含：
[0011] 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物 P1，該上游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :2第1454位堿基相同，該P(yáng)l的 3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1453位堿基相同；
[0012] 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO :1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P2， 該上游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ IDNO :1第1891位堿基相同；
[0013] 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計 的通用下游引物P3。
[0014] 優(yōu)選的，所述上游引物P2的3'末端倒數(shù)第一個堿基為人工引入的錯配堿基，該 錯配堿基與鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的基因序列均不互補(bǔ)。在引物P2的3'末端 人工引入錯配堿基，可提高鑒別檢驗(yàn)方法的特異性。
[0015] 更優(yōu)選的，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :3所示，上游引物P2的序列如 SEQ ID NO :4所示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO :5所示。
[0016] 更優(yōu)選的，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :6所示，上游引物P2的序列如 SEQ ID NO :7所示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO :5所示。
[0017] 所述試劑盒還包含：RT-PCR反應(yīng)緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶。
[0018] 優(yōu)選的，所述試劑盒用于檢測樣品時的PCR退火溫度為54?59°C。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的引 物，該引物包括：
[0020] 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO :1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P1， 該上游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :1第1454位堿基相同，該P(yáng)l的3' 末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :1第1453位堿基相同；
[0021] 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物 P2,該上游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1891位堿基相同；
[0022] 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計 的通用下游引物P3。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的引 物，該引物包括：
[0024] 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物 P1，該上游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :2第1454位堿基相同，該P(yáng)l的 3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1453位堿基相同；
[0025] 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO :1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P2， 該上游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ IDNO :1第1891位堿基相同；
[0026] 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計 的通用下游引物P3。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試 劑盒在制備區(qū)分鴨坦布蘇病毒自然感染強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試 劑盒在制備快速鑒定鴨坦布蘇病毒的廣品中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，具有特異性強(qiáng)、靈敏度 高的特點(diǎn)，不僅能快速鑒定出鴨坦布蘇病毒，而且還能快速、準(zhǔn)確地區(qū)分鴨坦布蘇病毒自然 感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，對于鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）的臨床 廣泛應(yīng)用具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0031] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1引物及限制酶酶切位點(diǎn)在鴨坦布蘇病毒基因組中的位置及 各毒株在此區(qū)域的比較圖；
[0032] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1用引物對SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5在 不同退火溫度下對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒、弱毒株基因組進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果圖；
[0033] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1用引物對SEQ ID NO :6 / SEQ ID NO :7 / SEQ ID NO :5在 不同退火溫度下對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒、弱毒株基因組進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果圖；
[0034] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2鴨坦布蘇病毒強(qiáng)、弱毒株在不同含量病毒液條件下進(jìn)行擴(kuò) 增的結(jié)果圖；
[0035] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3的RT-PCR檢測不同鴨源病毒基因組的結(jié)果圖；
[0036] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例4的鴨坦布蘇病毒強(qiáng)、弱毒株RT-PCR產(chǎn)物的酶切分析結(jié)果 圖；
[0037] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例5的RT-PCR檢測弱毒疫苗株病毒液和強(qiáng)毒感染鴨卵巢組織 的結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（薩姆布魯克J，拉塞爾D W，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第3版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。
[0039] 下面通過具體實(shí)施例闡述本發(fā)明。
[0040] 材料：
[0041] 1 ?試劑
[0042] RNAiso Plus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物工程（大連）有 限公司；PCRMix購自廣州東盛生物科技有限公司；氯仿、異丙醇、75%乙醇（用DEPC處理過 的水配制）、無RNase的水。
[0043] 2?病毒和細(xì)胞
[0044] 鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010株）和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P 株），病毒滴度為IO 5 5TCID5tl / 0.1ml。DF-I細(xì)胞由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所保存，用含 有10%犢牛血清和適量抗生素的DMEM培養(yǎng)基（Gibco BRL公司）在37°C、5% CO2的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。
[0045] 實(shí)施例1鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的引物設(shè)計和PCR條件的確定
[0046] (1)引物設(shè)計及合成
[0047] 把GenBank中公布的鴨坦布蘇病毒BYD-I株、FS株、ALD株、JM株、JS804株、ZJ-6 株和SD株等8株鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）的基 因組序列進(jìn)行比較分析，設(shè)計3條引物。其中，P1 (5' -CTGAAACATGCCGCYAGA-3'，Y=C / T. SEQ ID NO :3)為鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)特異性上游引物，P2(5' -GTGTAGTAATAC ATTTTCCCTAGCA-3'，SEQ ID NO :4)為鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）特異性 上游引物，P2引物3'末端的堿基"A"既不是強(qiáng)毒序列也不是弱毒序列，加"A"是為了提高 鑒別檢驗(yàn)方法的特異性，P3(5' -CCGAAAACCTGATGAATGC-3'，SEQ IDN0:5)是強(qiáng)、弱毒株通 用的下游引物（圖1)。Pl / P3和P2 / P3預(yù)期能分別特異性地擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株 (FX2010)和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株），擴(kuò)增產(chǎn)物分別為860bp和429bp。 在擴(kuò)增片段的序列中，Sail限制酶酶切位點(diǎn)是強(qiáng)、弱毒株都有的，而BglII限制酶酶切位點(diǎn) 是強(qiáng)毒株特異的（圖1)。引物由上海英俊生物有限公司合成。
[0048] 上述PI、P2引物的設(shè)計原理是利用鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)SEQ ID NO :1 基因序列和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）SEQ ID N0:2基因序列在第1453、 1454、1891位堿基存在差別，設(shè)計包含SEQ ID NO :1序列第1453、1454位堿基的上游引物 Pl和包含SEQ ID NO :2序列第1891位堿基的上游引物P2,然后在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列中設(shè)計通用的下游引物P3,這樣Pl / P3和P2 / P3能分別擴(kuò)增出鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P 株）的特異性片段；同樣，也可以設(shè)計包含SEQ ID NO :2序列第1453、1454位堿基的上游 引物Pl (例如SEQ ID NO :6)和包含SEQ ID NO :1序列第1891位堿基的上游引物P2 (例 如SEQ ID NO :7)，再在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列 中設(shè)計通用的下游引物P3,該P(yáng)l / P3和P2 / P3能分別擴(kuò)增出鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P株）和鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)的特異性片段，同樣能將鴨坦布蘇病毒 強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株區(qū)分開。
[0049] (2)樣品的處理
[0050] 對于組織樣品，每克組織加ImllOX雙抗無菌PBS，進(jìn)行研磨，然后12000rpm，4°C離 心10min，取上清備用。對于細(xì)胞培養(yǎng)的病毒液樣品可直接用于RNA的提取。
[0051] (3)病毒RNA的提取
[0052] 按照RNAiso Plus說明書提取病毒RNA。
[0053] 1)取樣品0? 1ml，移入一個盛有0? 3ml RNAiso Plus的eppendorf離心管中，用移 液槍反復(fù)吹打至組織完全裂解，液體基本澄清。室溫靜置5min，每管加入0. 08ml氯仿，劇烈 搖動 15sec，靜置 3min。12000g4°C離心 lOmin。
[0054] 2)小心吸取上清夜置于另一無菌的新eppendorf離心管中，加入0? 4ml異丙醇，室 溫靜止 lOmin，12000g4°C離心 lOmin。
[0055] 3)棄上清，用Iml現(xiàn)配的75%乙醇清洗沉淀，7500g4°C離心5min。棄上清，讓沉淀 在室溫自然干燥（5-10min)。
[0056] 4)每管用20 ii L無Rnase的DEPC水重懸溶解。
[0057] (4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0058] 用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取總RNA5 ii L，加入引物P34ii L(40pmol)， 置65 °C IOmin后，迅速冰浴2min，然后依次加入MLV緩沖液4 ii L、DEPC水3 ii L、 dNTPMix(10mmol)2ii L、RRIl ii L(40U)、MLVl ii L(200U)。置 30 °C 10min、42 °C lh，然后 70 °C 15min〇
[0059] (5) PCR
[0060] 使用PCRMix試劑，在25 ii L反應(yīng)體系中，分別加入PCRMixl2. 5 ii L、上游引 物 Pl (SEQ ID NO :3)和 P2 (SEQ ID NO :4)各 I ii L(IOpmol)，下游引物 P3 (SEQ ID NO : 5) I ii L(IOpmol)、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ii L，超純水7. 5 ii L。PCR程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性3min ;95°C變 性30s、54?59°C退火30s、72°C延伸lmin，35個循環(huán)；72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%的 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0061] (6) RT-PCR退火溫度的確定
[0062] 取鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010株）和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P 株），分別稀釋為IO 5ciTCID5tl / 0.1ml，然后按照上述（2)?（4)的方法進(jìn)行試驗(yàn)，確定 RT-PCR方法的退火溫度。
[0063] 結(jié)果：
[0064] 1)以引物對 Pl / P2 / P3(SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5) 在不同退火溫度分別擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P)。結(jié)果顯示，對于弱毒疫苗株（FX2010-180P)，退火溫度在54?59°C擴(kuò)增 時，都只出現(xiàn)1條特異的目的條帶。對于強(qiáng)毒株（FX2010)，退火溫度在54?59°C擴(kuò)增時， 也只出現(xiàn)1條特異的目的條帶?？紤]到PCR的特異性以及擴(kuò)增效率，選用56°C作為鑒別診 斷RT-PCR的退火條件（圖2)。圖2中，1?6 :鴨坦布蘇病毒弱毒株（FX2010-180P，退火 溫度54?59°C ) ;7 :DL2000DNA Marker ;8?13 :鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010,退火溫度 59 ?54°C )。
[0065] 2)以引物對 Pl / P2 / P3(SEQ ID NO :6 / SEQ ID NO :7 / SEQ ID NO :5)在 不同退火溫度分別擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P)和鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株 (FX2010)。結(jié)果顯示，對于弱毒疫苗株（FX2010-180P)，退火溫度在54?57°C擴(kuò)增時，都只 出現(xiàn)1條特異的目的條帶；對于強(qiáng)毒株（FX2010)，退火溫度在55?56°C擴(kuò)增時，也只出現(xiàn) 1條特異的目的條帶（圖3)。圖3中，I :DL2000DNA Marker ;2?3 :鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株 (FX2010,退火溫度分別為55?56°C ) ;4?7 :鴨坦布蘇病毒弱毒株（FX2010-180P，退火溫 度分別為54?57°C ) ;8 :陰性對照。
[0066] 實(shí)施例2RT-PCR敏感性試驗(yàn)
[0067] 根據(jù)實(shí)施例1引物對SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5所確定的退 火溫度，將鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P)分別 作系列稀釋，取〇. Iml含10TCID5Q、102TCID5Q、IO3TCID 5tl和IO4TCID5tl的病毒液，用該引物對進(jìn) 行RT-PCR方法檢驗(yàn)。
[0068] 以不同病毒含量的病毒液作為檢測材料，用RT-PCR方法檢測。結(jié)果顯示，對于 鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)，IOTCID 5tl的病毒液可以檢測到特異性條帶（圖4)，對于 鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P)，IO 3 tlTCID5ci病毒液可以檢測到特異性條帶（圖 4)。圖4中，1?4 :鴨坦布蘇病毒弱毒株（FX2010-180P，毒價分別為10?IO4 qTCID5q) ;5 : DL2000DNAMarker ;6?9 :鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010,毒價分別為104 °?IOTCID5ci)。
[0069] 實(shí)施例3RT-PCR特異性試驗(yàn)
[0070] 根據(jù)實(shí)施例 1 引物對 SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5 所確定 的退火溫度，用該引物對擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)、鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P)、鴨瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒、H9亞型流感病毒、I型鴨肝炎病毒、鴨呼腸孤病 毒和正常細(xì)胞陰性對照的基因組，檢驗(yàn)RT-PCR方法的特異性。
[0071] 結(jié)果：應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗 株（FX2010-180P)基因組，分別能夠擴(kuò)增出大小為860bp和429bp的一條片段，而鴨瘟病 毒、番鴨細(xì)小病毒、亞型流感病毒、I型鴨肝炎病毒、鴨呼腸孤病毒和正常細(xì)胞陰性對照 的基因組沒有擴(kuò)增出任何片斷，表明該方法對鴨坦布蘇病毒的檢測特異性強(qiáng)（圖5)。圖5 中，I :DL2000DNA Marker ;2 :鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010) ;3 :鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P) ;4 :鴨瘟病毒；5 :番鴨細(xì)小病毒；6 :H9亞型流感病毒；7 :1型鴨肝炎病毒； 8:鴨呼腸孤病毒；9:陰性對照。
[0072] 實(shí)施例4限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)分析
[0073] 在實(shí)施例1用引物SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5對鴨坦布蘇病 毒強(qiáng)毒株（FX2010株）和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）擴(kuò)增片斷中，Sal I限制酶酶切位點(diǎn)（GTCGAC)是鴨坦布蘇病毒強(qiáng)、弱毒株共有的，而BglII限制酶酶切位點(diǎn) (AGATCT)是強(qiáng)毒株特有的。因此，將鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010株）和鴨坦布蘇病毒弱 毒疫苗株（FX2010-180P株）RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Bgl II和Sal I進(jìn)行酶切分析，根據(jù) 酶切產(chǎn)物大小可以進(jìn)一步驗(yàn)證鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010株）和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗 株（FX2010-180P 株）。
[0074] 結(jié)果：鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Sal I限制酶酶切后的電泳圖 可以看到約250bp和180bp的片斷；鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Bgl II限制酶 酶切后的電泳圖可以看到約550bp和300bp的片斷，用Sal I限制酶酶切后的電泳圖可以 看到約600bp和250bp的片斷（圖6)。圖6中，I. DL2000DNAMarker ;2.鴨坦布蘇病毒弱 毒疫苗株（Sal I酶切）；3.鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（Bgl II酶切）；4.鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株 (Sal I 酶切）。
[0075] 實(shí)施例5鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR檢測試劑盒的組成及 應(yīng)用該試劑盒對臨床樣品進(jìn)行RT-PCR檢測和重復(fù)性試驗(yàn)
[0076] 1、試劑盒的組成
[0077] 將5￡〇10勵：3、5￡〇10勵：4和5￡〇10勵：5所示的？1/?3、卩2/?3引物對、 RT-PCR反應(yīng)緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶，裝配成試劑盒，組裝后置于合適條件保存。
[0078] 或?qū)?SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :5 所示的 Pl / P3、P2 / P3 引物 對、RT-PCR反應(yīng)緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶，裝配成試劑盒，組裝后置于合適條件保存。
[0079] 2、本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用
[0080] 取不同批次的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）病毒液和鴨坦布蘇病 毒強(qiáng)毒株（FX2010)感染鴨后第4天的卵巢組織按照上述方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0081] 用鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株（FX2010)和鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P) 病毒液重復(fù)多次，結(jié)果都一致，重復(fù)性良好。用上述含有SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO :5引物對的試劑盒檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的4批次的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P)的病毒液，均擴(kuò)增出特異性條帶（圖7)。用該試劑盒再檢驗(yàn)鴨坦布蘇病毒 強(qiáng)毒感染鴨的卵巢組織，均擴(kuò)增出特異性條帶（圖7)。圖7中，I. DL2000DNAMarker ;2? 5. 1?4批次鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株病毒液；6.陰性對照；7?10.鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株 感染鴨（1?4號鴨）卵巢組織；11.正常鴨卵巢組織對照。
[0082] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 含： 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO :1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P1，該上 游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :1第1454位堿基相同，該P(yáng)l的3'末端 倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :1第1453位堿基相同； 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P2， 該上游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1891位堿基相同； 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計的通 用下游引物P3。
2. -種鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 含： 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P1， 該上游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :2第1454位堿基相同，該P(yáng)l的3' 末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1453位堿基相同； 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO: 1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P2,該上 游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ IDNO :1第1891位堿基相同； 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計的通 用下游引物P3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，其特 征在于，所述上游引物P2的3'末端倒數(shù)第一個堿基為人工引入的錯配堿基，該錯配堿基 與鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的基因序列均不互補(bǔ)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，其特征在 于，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :3所示，上游引物P2的序列如SEQ ID NO :4所 示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO : 5所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，其特征在 于，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :6所示，上游引物P2的序列如SEQ ID NO :7所 示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO : 5所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒，其特 征在于，所述試劑盒用于檢測樣品時的PCR退火溫度為54?59°C。
7. -種檢測鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的引物，其特征在于，包括以下引物： 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO :1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P1，該上 游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :1第1454位堿基相同，該P(yáng)l的3'末端 倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :1第1453位堿基相同； 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P2， 該上游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1891位堿基相同； 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計的通 用下游引物P3。
8. -種檢測鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的引物，其特征在于，包括以下引物： 針對鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P1， 該上游引物Pl的3'末端倒數(shù)第一個堿基與SEQ ID NO :2第1454位堿基相同，該P(yáng)l的3' 末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ ID NO :2第1453位堿基相同； 針對鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株SEQ ID NO: 1所示基因序列設(shè)計的特異性上游引物P2,該上 游引物P2的3'末端倒數(shù)第二個堿基與SEQ IDNO :1第1891位堿基相同； 針對所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列設(shè)計的通 用下游引物P3。
9. 權(quán)利要求1或2所述的鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒在制備區(qū)分 鴨坦布蘇病毒自然感染強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1或2所述的鑒別鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株的試劑盒在制備快 速鑒定鴨坦布蘇病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212912SQ201410142794
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】李澤君, 李國新 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所