一種獸用偽狂犬弱毒活疫苗的規(guī)?；a(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域中疫苗的制備方法，特別是涉及一種用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生 產(chǎn)獸用偽狂犬弱毒活疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng) 物的急性傳染病，尤其是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。
[0003] 目前，偽狂犬病在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，己有40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道發(fā)生了偽狂 犬病。隨著規(guī)模化養(yǎng)豬的不斷發(fā)展和強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，豬偽狂犬病的發(fā)生和流行日趨嚴(yán)重。在 我國(guó)己有20多個(gè)省市報(bào)道發(fā)生了豬偽狂犬病，并己先后分離到多株P(guān)RV毒株，己報(bào)道分離 到的毒株有閩A、陜A、京A、AKW、SR、YN、DQ-8401、S、Y株等。目前尚無針對(duì)豬偽狂犬病的有 效治療藥物，主要依靠疫苗接種、隔離感染豬群、淘汰隱性感染動(dòng)物得到控制。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)偽狂犬疫苗的方法仍然采用原代或傳代細(xì)胞系貼壁培養(yǎng)方法，其 采用的是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，具有抗原批量小、批間差大、效率低下、勞動(dòng)強(qiáng)度大、占用場(chǎng)地 多等缺點(diǎn)。而本發(fā)明利用懸浮培養(yǎng)工藝不僅可克服上述轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝的缺點(diǎn)，而且還可提 高抗原產(chǎn)量、節(jié)約成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)，但是目前暫無生產(chǎn)偽狂犬弱毒活疫苗的懸浮培養(yǎng)工 藝及其應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)獸用偽狂犬弱毒活疫苗的方法，以 達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)獸用偽狂犬弱毒活疫苗的目的。
[0006] 本發(fā)明所提供的獸用偽狂犬弱毒活疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)方法，是利用細(xì)胞懸浮工藝 培養(yǎng)偽狂犬病毒弱毒株，使反應(yīng)器內(nèi)懸浮培養(yǎng)的BHK21-C13細(xì)胞密度大于或等于2XIO6細(xì) 胞/mL，然后用含偽狂犬病懸浮種毒的病毒維持液進(jìn)行培養(yǎng)，再將收獲的偽狂犬弱毒病毒液 經(jīng)澄清、配苗、分裝、凍干后得到獸用偽狂犬弱毒活疫苗。
[0007] 其中，反應(yīng)器內(nèi)懸浮培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞過程為：利用復(fù)蘇的BHK21-C13懸浮細(xì) 胞株在營(yíng)養(yǎng)液中傳代懸浮培養(yǎng)至BHK21-C13懸浮細(xì)胞的細(xì)胞密度多2.OXIO6細(xì)胞/mL， 將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器中，加入懸浮專用培養(yǎng)基至細(xì)胞密度0. 2-0. 5XIO6細(xì)胞/mL，在 36. 5±0. 5°C，pH值 7. 20±0. 1，D0 值 30% -60% (溶解度百分比），轉(zhuǎn)速 60-110rpm下培養(yǎng) 48-72小時(shí)至反應(yīng)器內(nèi)的BHK21-C13細(xì)胞密度大于等于2XIO6細(xì)胞/mL。
[0008] 所述營(yíng)養(yǎng)液或懸浮專用培養(yǎng)基為：在BBSM培養(yǎng)基中按I. 15g/L加入碳酸氫鈉，再 添加3%-5% (體積百分比）新生牛血清，調(diào)節(jié)pH值至7. 2 ±0. 5。
[0009] 培養(yǎng)偽狂犬生產(chǎn)用懸浮病毒液過程為：將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)合格的BHK21-C13懸浮細(xì) 胞棄掉懸浮專用培養(yǎng)基，加入病毒維持液恢復(fù)至原培養(yǎng)體積，再按1 %體積加入偽狂犬懸浮 種毒，在36. 5 ± 0? 5°C，pH值7. 40-7. 60, DO值30%-60% (溶解度百分比），轉(zhuǎn)速60-1 IOrpm 下培養(yǎng)，待細(xì)胞病變多75%時(shí)收獲病毒液。
[0010] 所述病毒維持液為：BBSM培養(yǎng)基中按I. 15g/L加入碳酸氫鈉，再添加1% -3% (體 積比）新生牛血清，pH值7. 4±0. 5。
[0011] 以上所述的生產(chǎn)方法中，視生產(chǎn)規(guī)模由小至大反應(yīng)器容積依次為5L、50L、500或 5000L;且，大規(guī)模的生產(chǎn)使用大容積的反應(yīng)器，該反應(yīng)器中使用前一小規(guī)模生產(chǎn)容器中培 養(yǎng)的BHK21-C13懸浮細(xì)胞。5L、50L、500L、5000L反應(yīng)器中的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件相同。
[0012] 所述生產(chǎn)方法中，所述偽狂犬病懸浮種毒是用BHK21-C13懸浮細(xì)胞培養(yǎng)偽狂犬基 礎(chǔ)種毒培養(yǎng)的偽狂犬生產(chǎn)用懸浮種毒，具體獲得過程如下：
[0013] 1)偽狂犬基礎(chǔ)種毒培養(yǎng)
[0014] 取貼壁培養(yǎng)得到的長(zhǎng)勢(shì)良好且已鋪滿單層的BHK21-C13貼壁細(xì)胞，棄去原培養(yǎng) 液，加入含1% (體積百分比）偽狂犬病弱毒種毒的病毒維持液（維持液同權(quán)利要求5)， 在37°C培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變多75% (數(shù)量百分比）時(shí)收獲病毒液，-20°C冷凍保存，取樣檢測(cè) TCID5tl，每 0?ImL病毒含量應(yīng)彡KftlTCID5ci;
[0015] 2)偽狂犬生產(chǎn)用懸浮種毒培養(yǎng)
[0016] 將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)合格的懸浮BHK21-C13細(xì)胞，棄掉細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，加入病毒維持 液恢復(fù)至原培養(yǎng)體積，再按1% (體積百分比）加入偽狂犬基礎(chǔ)種毒，PH值7. 40-7. 60， 0020%-60%(溶解度百分比），轉(zhuǎn)速60-110印111，溫度36.0±0.51：條件下累計(jì)懸浮培養(yǎng) 72-96h，待細(xì)胞病變彡75% (數(shù)量百分比）時(shí)收獲病毒液，-20°C冷凍保存；
[0017] 為適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)，偽狂犬生產(chǎn)用懸浮種毒還包括哪些在反應(yīng)器中傳代擴(kuò)大培養(yǎng) 至種毒批所需體積的部分，即將步驟2)收獲的病毒液經(jīng)反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)1-2代得到的生產(chǎn) 用偽狂犬病懸浮種毒批。
[0018] 所述生產(chǎn)方法中，獸用偽狂犬弱毒病毒液的澄清采用0. 45ym濾芯正壓過濾；
[0019] 凍干包括：預(yù)凍階段：常溫進(jìn)箱，l_2h將制品降至-42°C并維持2h;升華干燥 階段：1-2h將制品從-42°C升至-8°C并維持IOh ;0. 5-lh將制品從-8°C升至0°C并維持 0. 5-lh ;解吸干燥階段：1-2h將制品從0°C升至28°C并維持7h，凍干結(jié)束。
[0020] 本發(fā)明用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)獸用偽狂犬弱毒活疫苗，實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)獸 用偽狂犬弱毒活疫苗。該方法的核心是利用生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞 并接種偽狂犬種毒，調(diào)節(jié)培養(yǎng)參數(shù)使偽狂犬病毒大量繁殖，從而獲得高濃度及高滴度的偽 狂犬病毒，病毒液經(jīng)澄清、稀釋、凍干制備獸用偽狂犬弱毒活疫苗。利用本發(fā)明提供的用 BHK21-C13懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備獸用偽狂犬弱毒活疫苗工藝，作為偽狂犬病毒宿主細(xì)胞的 BHK21-C13細(xì)胞懸浮培養(yǎng)非常成功，培養(yǎng)體積可達(dá)5000L，細(xì)胞密度達(dá)到2-4XIO6細(xì)胞/mL。 本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)偽狂犬弱毒病毒大量增殖，大大提高病毒滴度與抗原產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)工藝自動(dòng) 化，提高了疫苗的質(zhì)量，解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)BHK21-C13細(xì)胞生產(chǎn)偽狂犬病毒產(chǎn)量低、疫苗 效力低、免疫劑量大等技術(shù)難題。本發(fā)明還克服了目前工藝繁瑣、抗原含量低，效力低，劑量 大、批間差大等技術(shù)難題，不僅能提高BHK21-C13細(xì)胞密度，自動(dòng)監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)或病毒繁殖 的最適生化條件，提高病毒滴度，而且工藝規(guī)模放大相對(duì)容易，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定、批間差小，生 產(chǎn)和應(yīng)用前景廣闊。
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備獸用偽狂犬弱毒活疫苗的工藝流程圖
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá) 到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的 來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提 示替換使用。
[0024] 實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0025] 實(shí)施例1、用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備獸用偽狂犬弱毒活疫苗
[0026] 如圖1所示，本發(fā)明用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備獸用偽狂犬弱毒活疫苗的主要工藝流程 包括以下五個(gè)步驟：1、懸浮BHK21-C13種細(xì)胞培養(yǎng)；2、懸浮BHK21-C13細(xì)胞5L、50L、500L、 5000L反應(yīng)器培養(yǎng)；3、偽狂犬弱毒懸浮種毒培養(yǎng)；4、偽狂犬弱毒活疫苗生產(chǎn)用懸浮毒液培 養(yǎng)；5、澄清、配苗、分裝、凍干。
[0027] 一、懸浮培養(yǎng)BHK21-C13種細(xì)胞
[0028] 1、種細(xì)胞復(fù)蘇
[0029] 從液氮中取出一支凍存的BHK21-C13懸浮細(xì)胞株，37°C快速