專利名稱：：登革血清型1減毒株的制作方法登革血清型1減毒林本發(fā)明涉及新型活的減毒VDV1(VERO來(lái)源的登革血清型l病毒)毒林，其通過(guò)在PDK和Vero細(xì)胞上傳代并進(jìn)行消毒(sanitization)而衍生自野生型登革1型毒株16007。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含此類VDV1毒抹的疫苗組合物。登革病由黃病毒屬(Gubler，1988)的4種緊密相關(guān)但抗原不同的病毒血清學(xué)類型(Gubler,1988;Kautner等人，1997;Rigau-P6rez等人，1998;Vaughn等人，1997)引起。登革病毒血清型感染可以產(chǎn)生一系列臨床疾病，從非特異的病毒綜合征到嚴(yán)重的致命的出血性疾病。蚊蟲(chóng)叮咬后登革熱(DF)的潛伏期平均為4天(范圍為3-14天)。DF的特征在于雙相熱、頭痛、身體各個(gè)部分的疼痛、衰竭、滲、淋巴結(jié)病和白細(xì)胞減少(Kautner等人，1997;Rigau-P"ez等人，1998)。病毒血癥期與熱性疾病相同(Vaughn等人，l997)。從DF恢復(fù)通常在7-10天中完成，但長(zhǎng)時(shí)間的虛弱是常見(jiàn)的。白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)減少是時(shí)常發(fā)生的。登革出血熱(DHF)是特征在于穩(wěn)態(tài)異常和血管滲透性增加的嚴(yán)重?zé)嵝约膊。鲅軡B透性增加可以導(dǎo)致血容量減少和低血壓(登革休克綜合征，DSS)，這通常并發(fā)嚴(yán)重內(nèi)出血。如果不治療，DHF的病死率可以高達(dá)10%,但在大多數(shù)具有治療經(jīng)驗(yàn)的中心低于1%(WHOTechnicalGuide,1986)。登革熱感染的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷基于病毒的分離和/或登革熱病毒特異性抗體的檢測(cè)。登革病是僅次于瘧疾的第二種最重要的熱帶傳染病，全世界有超過(guò)一半的人口(25億)生活在處于流行傳播危險(xiǎn)中的區(qū)域。估計(jì)每年發(fā)生50，000，000-100，000，000例登革熱、500，000位住院的DHF患者和25，000例死亡。登革熱是亞洲、太平洋、非洲、拉丁美洲和加勒比海的地方流行病。超過(guò)100個(gè)熱帶國(guó)家具有地方流行的登革熱病毒感染，并且DHF已在超過(guò)60個(gè)這些國(guó)家中得到證實(shí)(Gubler，2002;Monath，1994)。許多充分描述的因素似乎涉及登革熱感染人口增長(zhǎng)，特別是與貧困相關(guān)的無(wú)計(jì)劃和不受控制的都市化，空中旅行增加，缺乏有效的蚊蟲(chóng)控制，以及衛(wèi)生和公共衛(wèi)生基礎(chǔ)惡化(Gubler，2002)。在旅行者和移居國(guó)外者中對(duì)于登革熱的認(rèn)識(shí)漸增(Shirtcliffe等人，1998)。登革熱已證明是在具有登革熱地方流行的熱帶區(qū)域部署期間美國(guó)軍隊(duì)中熱性疾病的主要原因(DeFraites等人，1994)。所述病毒在涉及人和埃及伊蚊(Jedesae^T〃)的周期中維持，所述埃及伊蚊是更喜歡以人為食的、家里的、白天叮咬的蚊子。人感染由在受感染埃及伊蚊的血液飼喂過(guò)程中的病毒注射起始。唾液病毒主要儲(chǔ)存于脈管外組織中。在接種后被感染的主要細(xì)胞亞群是樹(shù)突狀細(xì)胞，它隨后遷移至引流淋巴結(jié)(Wu等人，2000)。在皮膚和引流淋巴結(jié)中進(jìn)行初期復(fù)制后，病毒在急性發(fā)熱期期間出現(xiàn)在血液中，一般持續(xù)3-5天。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞一起在登革熱病毒的主要靶中。針對(duì)同型再感染的保護(hù)是完全的并且可能是終身的，但登革熱類型之間的交叉保護(hù)持續(xù)小于12周(Sabin，1952)。因此，受試者可以經(jīng)歷不同血清型的第二次感染。第二次登革熱感染是形成嚴(yán)重登革病的理論上的危險(xiǎn)因素。然而，DHF是多因素的，包括所涉及的病毒林，以及患者的年齡、免疫狀態(tài)和遺傳素質(zhì)。兩種因素在DHF的發(fā)生中起主要作用伴隨高病毒血癥(該疾病的嚴(yán)重度與病毒血癥水平相關(guān)(Vaughn等人，2000))的快速病毒復(fù)制，和伴隨炎癥介質(zhì)高水平釋放的重要炎癥應(yīng)答(Rothman和Ennis，1999)。沒(méi)有針對(duì)登革病的特異療法。DF的處理由臥床休息、用退熱藥和鎮(zhèn)痛藥控制發(fā)熱和疼痛、以及足夠的流體攝入來(lái)支持。DHF的治療需要流體喪失的校正、凝血因子的替換和肝素輸注。預(yù)防措施目前依賴于媒介控制和個(gè)人防護(hù)措施，這難以執(zhí)行并且昂貴。目前沒(méi)有注冊(cè)針對(duì)登革熱的疫苗。因?yàn)榈歉锏?個(gè)血清型在全世界流通，并且因?yàn)樗鼈儽粓?bào)告涉及DHF病例，所以疫苗接種應(yīng)理想地給予針對(duì)所有4種登革熱病毒血清型的保護(hù)。再現(xiàn)天然免疫性的活的減毒疫苗(LAVs)已用于開(kāi)發(fā)針對(duì)許多疾病的疫苗，包括屬于與登革相同的屬的幾種病毒(商購(gòu)可得的黃病毒活減毒疫苗的例子包括黃熱病和日本腦炎疫苗)?；顪p毒病毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)是它們的復(fù)制能力以及誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。此外，由針對(duì)病毒不同組分(結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白)的完整病毒粒子疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答再現(xiàn)了由天然感染誘導(dǎo)的那些。登革熱疫苗計(jì)戈寸在泰國(guó)于CentreforVaccineDevelopment,InstituteofSciencesandTechnologyforDevelopment,MahidolUniversity開(kāi)始。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上成功開(kāi)發(fā)了候選活減毒疫苗，其對(duì)于在原代犬腎(PDK)細(xì)胞中的登革血清型1(毒林16007，第13代=LAV1)、血清型2(毒林16681，第53代)和血清型4(毒林1036，第48代)病毒，以及對(duì)于在原代綠猴腎(PGMK)細(xì)胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)細(xì)胞(第3代)中的血清型3(毒林16562)。這些疫苗已在泰國(guó)志愿者中作為單價(jià)(單種血清型)、二價(jià)(兩種血清型)、三價(jià)(三種血清型)和四價(jià)(所有四種血清型)疫苗進(jìn)行了測(cè)試。這些疫苗被發(fā)現(xiàn)在兒童和成人中是安全并具有免疫原性(Gubler,1997)。這些LAV1-4毒林已在MahidolUniversity的EP1159968中進(jìn)行描述，并保藏于CNCM(分別為CNCMI-2480;CNCMI-2481;CNCMI-2482和CNCMI-2483)。登革1型活減毒病毒林(LAV1)的完整序列由R.Kinney等人(CDC，F(xiàn)ortCollins)確定。親本DEN-1毒林16007(SEQIDNo.2)和LAV1(SEQIDNo.3)毒林之間的序列差異描述在表1中。因此，野生型病毒林16007和LAV1毒林的遺傳比較顯示了一組14個(gè)點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變可以與LAV1減毒相關(guān)聯(lián)。表l:DEN-116007和DEN-116007/PDK13(LAV1)的序列差異<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>修改相應(yīng)密碼子的核苷酸變化以斜體指出。最初于1983年建立的LAV1毒林進(jìn)一步被迅速鑒定為潛在的疫苗候選物(Bhamarapravati和Yoksan，1997)。然而，在那時(shí)，沒(méi)有意識(shí)到通過(guò)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)物向具有海綿狀腦炎的人的傳播是一種危險(xiǎn)，并且病毒常規(guī)地維持在原代犬腎細(xì)胞(PDK)中。此外，這種LAV1毒株相應(yīng)于異質(zhì)群體。由于在所述組合物中存在的毒林之一的潛在體外或體內(nèi)選擇，這種異質(zhì)性代表了另外的危險(xiǎn)?？紤]到這些漸增的擔(dān)心，申請(qǐng)人決定建立消毒(sanitization)過(guò)程以便消除任何此類危險(xiǎn)。通過(guò)首先將LAV1疫苗毒林從PDK中轉(zhuǎn)移到VERO細(xì)胞，然后用純化的LAV1基因組RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，隨后為病毒噬斑純化的兩個(gè)順次步驟，申請(qǐng)人生產(chǎn)了新型Vero來(lái)源的血清型1病毒(雨l)。通過(guò)轉(zhuǎn)移至VERO細(xì)胞和生物學(xué)克隆而如此獲得的這種新型VDV1毒林，在序歹寸、同質(zhì)謹(jǐn)斑大小(homogenousplaquesize)和溫度敏感性方面不同于LAV1毒株，但重要的是保留了LAVl的某些表型和基因型特征，例如減毒點(diǎn)(attenuationspot)、小噬斑表型、在高溫時(shí)的生長(zhǎng)限制，并且保留了LAV1毒林的免疫原性特征。這些特征使得這種新型毒林成為用于在人中進(jìn)行預(yù)防性免疫接種的有價(jià)值的疫苗候選物。定乂"登革熱病毒"是屬于黃病毒科黃病毒屬的正義單鏈RNA病毒。在登革血清型l(DEN-1)毒林16007的情況下，整個(gè)序列長(zhǎng)度為10735個(gè)核苷酸(SEQIDNo.2)。RNA基因組在5'末端處包含I型帽，但沒(méi)有3'末端poly(A)尾?；蚪Y(jié)構(gòu)是5'-非編碼區(qū)(NCR)、結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼(C)、前膜/膜(prM/M)、包膜(E))和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)以及NCR。病毒RNA基因組與C蛋白結(jié)合從而形成核殼體(二十面體對(duì)稱)。如同其他黃病毒一樣，DEN病毒基因組編碼翻譯成單個(gè)多蛋白的不間斷開(kāi)放讀碼框(0RF)。登革1型的強(qiáng)毒(致病)抹的連續(xù)傳代導(dǎo)致分離出經(jīng)修飾的病毒，其是"活的且減毒的"，即有傳染性但不能引起疾病。這些經(jīng)修飾的病毒通常在猴中進(jìn)行測(cè)試以評(píng)估其減毒。然而，人是唯一顯示出臨床疾病體征的靈長(zhǎng)類。這樣的病毒稱為"活的且減毒的"，即其在大多數(shù)受試人中引起輕度(即就調(diào)節(jié)目的而言是可接受的，因?yàn)槌尸F(xiàn)出正的利益/風(fēng)險(xiǎn)比)至低的次級(jí)效應(yīng)或者不引起次級(jí)效應(yīng)(即全身事件和/或生物學(xué)異常和/或局部反應(yīng))，但仍進(jìn)行感染并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)"LAV"指活的減毒登革熱病毒林。在本發(fā)明的情況下，"LAVs，，是通過(guò)在原代犬腎(PDK)細(xì)胞中傳代例如傳10、11、U或U代而最初來(lái)源于登革血清型1(DEN-1)毒株16007的活的減毒林。例如，"LAV1/PDK13，，是毒林16007在PDK細(xì)胞中傳代13次后建立的減毒株(也稱為DEN-116007/PDK13)。LAV1/PDK13核苷酸序列顯示于SEQIDNo.3中。"VDV1"意指通過(guò)本申請(qǐng)中公開(kāi)的消毒過(guò)程可獲得的LAV。因此，VDV1是生物學(xué)克隆(均質(zhì)的)VERO-適應(yīng)的登革血清型1病毒，其能夠在靈長(zhǎng)類特別是人中誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，包括中和抗體。本發(fā)明的VDV1毒林可以容易地直接從本文公開(kāi)的VDV1序列開(kāi)始重建。特異性體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)可以通過(guò)ELISA測(cè)定法容易地進(jìn)行測(cè)定。在已接種疫苗者血清中的中和抗體的存在通過(guò)如4.1.2.2節(jié)中所述的噬斑減少中和測(cè)試來(lái)進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)如此測(cè)定的中和抗體滴度為至少大于或等于1:10時(shí)，血清被視為對(duì)于中和抗體的存在是陽(yáng)性的。術(shù)語(yǔ)"突變"意指遺傳材料例如DNA、RNA、cDNA中任何可檢測(cè)的變化，或者此類變化的任何過(guò)程、機(jī)制或結(jié)果。突變包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。在本申請(qǐng)的情況下，在登革1型病毒基因組序列或多蛋白中鑒定的突變依照Dunnen和Antonarakis(2000)的命名法進(jìn)行命名。如由Dunnen和Antonarakis限定的，在核酸水平上，置換由">"指明，例如"31A〉G"表示參考序列第31位處的核苷酸A變成G。在蛋白質(zhì)水平上的變異描述了突變結(jié)果且如下報(bào)告。終止密碼子由X指明(例如，R97X表示Arg96變成終止密碼子)。氨基酸置換例如由"S9G"指明，這意指第9位處的Ser被Gly替換。Kfi^^源^登革j&清型74辜(^ZWJ先前開(kāi)發(fā)的登革1型疫苗候選物L(fēng)AV1的組成通過(guò)消毒過(guò)程得到改善。本文公開(kāi)的VERO來(lái)源的登革血清型1病毒(VDV1)使用通過(guò)在PDK細(xì)胞上連續(xù)傳代而減毒的DEN-116007病毒。VDV1包含活減毒DEN-1病毒的完整基因組序列，并且具有與在人中測(cè)試的原始LAV1毒林相同的與減毒相關(guān)聯(lián)的點(diǎn)。LAV1疫苗候選物的消毒通過(guò)去除蛋白質(zhì)并只將純化的病毒基因組材料導(dǎo)入Vero細(xì)胞中來(lái)進(jìn)行。更具體而言，毒林的消毒在2個(gè)步驟中進(jìn)行1)于32。C在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增DEN16007/PDK11(LAV1/PDK11);2)純化病毒RNA并轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中。步驟1通過(guò)LAV1/PDK11在Vero細(xì)胞上傳代1次來(lái)進(jìn)行。為了那個(gè)目的，Vero細(xì)胞用LAV1/PDK11以0.01的moi進(jìn)行感染，并于32'C孵育5天。對(duì)于步驟2，利用病毒基因組是感染性RNA這一事實(shí)，這意味著，當(dāng)引入細(xì)胞中時(shí)，它能夠重構(gòu)出完整的傳染性病毒。因此，第二個(gè)純化和轉(zhuǎn)染步驟包括下列步驟a)從噬斑-純化的病毒中提取和純化病毒RNA;b)有利地使純化的RM與陽(yáng)離子脂質(zhì)結(jié)合；c)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，特別是Vero細(xì)胞LS10;d)回收新合成的病毒；和e)通過(guò)噬斑純化來(lái)純化VDV毒林，和任選地使其在宿主細(xì)胞特別是Vero細(xì)胞中擴(kuò)增。Vero細(xì)胞技術(shù)是眾所周知的技術(shù)，其已用于不同的商業(yè)產(chǎn)品(可注射的和口服的脊髓灰質(zhì)炎疫苗、狂犬病疫苗)。在本發(fā)明中，限定的Vero細(xì)胞有利地用于保證不存在可能與外來(lái)因子存在相關(guān)的任何危險(xiǎn)。"限定的VERO細(xì)胞"意指這樣的細(xì)胞或細(xì)胞系，即關(guān)于其的培養(yǎng)條件是已知的，并且所述細(xì)胞不含任何外來(lái)因子。這些包括例如SanofiPasteur的VERO細(xì)胞LSIO。如此分離的VDV毒林通常以冷凍組合物形式或凍干產(chǎn)品形式貯存。為了那個(gè)目的，VDV可以與稀釋劑相混合，所述稀釋劑通常是包含冷凍防護(hù)化合物例如糖醇和穩(wěn)定劑的緩沖水溶液。如通過(guò)pH計(jì)于RT測(cè)定的，在冷凍或凍干前的pH有利地設(shè)定為6-9，例如約7，例如pH7.5+/-0.2。使用前，將凍干產(chǎn)品與藥學(xué)稀釋劑或賦形劑例如無(wú)菌NaCl4%。溶液相混合，以重構(gòu)液體免疫原性組合物或疫苗。與LAV1/PDK13毒林相比較，在轉(zhuǎn)染后回收的病毒的減毒特異性基因座處進(jìn)行的測(cè)序沒(méi)有顯示任何突變。經(jīng)生物學(xué)克隆的VDV1病毒顯示出同質(zhì)噬斑表型和相對(duì)于其LAV1親本的顯著遺傳穩(wěn)定性，因?yàn)樗绕淇梢杂蓽p毒基因型的保守性中推導(dǎo)出來(lái)。對(duì)VDV1毒林進(jìn)行測(cè)序，并且與血清型1登革活減毒病毒(LAV1/PDK13)毒林序列(SEQIDNo3)進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)關(guān)于參考LAV1序列的一組3個(gè)核苷酸差異。它們中的一個(gè)在氨基酸水平上是沉默的(第2719位)。另2個(gè)(第5962和7947位)位于非結(jié)構(gòu)肽的編碼序列(分別為NS3-481和NS5-125)中。這些差異無(wú)一相應(yīng)于任何所述LAV1減毒位置。本發(fā)明因此提供了活的減毒登革1型病毒林，其由野生型病毒DEN-116007獲得，DEN-116007通過(guò)在PDK細(xì)胞上連續(xù)傳代并隨后通過(guò)在VER0細(xì)胞上傳代和消毒來(lái)進(jìn)行減毒。特別地，本發(fā)明的減毒抹至少包含相對(duì)于野生型DEN-116007和LAV1/PDK13毒林的核苷酸序列或多蛋白序列的鑒定出的序列突變(非沉默的和任選地沉默的)。因此，本發(fā)明涉及分離的活的減毒登革1型病毒林，其包含LAV1/PDK13毒林的序列(SEQIDNo.3)，或由LAV1/PDK13毒株的序列(SEQIDNo.3)組成，其中至少第5962和7947位的核苷酸，以及任選地第2719位的核普酸被突變，條件是下列核苷酸不被突變1323、1541、1543、1545、1567、1608、2363、2695、2782、5063、6048、6806、7330和9445。優(yōu)選地，所述突變是置換。優(yōu)選地，第5962位的核苷酸是A，第7947位的核苷酸是G。更加優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的分離株包含序列SEQIDNo.3，其包含突變2719G>A、5962OA和7947A>G0因此，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒登革1型病毒林包含野生型登革1型毒林16007的序列(SEQIDNo.2)，其中所述序列至少包含突變1323T>C、1541G>A、1543A>G、1545G>A、1567A>G、1608C>T、2363A>G、2695T>C、2782C>T、5063G>A、5962C>A、6048A>T、6806A>G、7330A>G、7947A>G和9445C>T。優(yōu)選地，相對(duì)于野生型毒林16007的核苷酸序列(SEQIDNo,2)，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒林進(jìn)一步包含突變2719G>A。根據(jù)本發(fā)明的活的減毒登革1型病毒株包括變異林，所述變異抹包含如上文限定的在第5962和7947位處突變的序列SEQIDNo.3，并且進(jìn)一步包含給定密碼子位置中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換，所述核苷酸置換不導(dǎo)致那個(gè)位置處編碼的氨基酸的改變。有利地，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒登革1型病毒林包含這樣的序列，其通過(guò)數(shù)目有限的突變，例如不超過(guò)5個(gè)、更加優(yōu)選地不超過(guò)2個(gè)突變，而不同于SEQIDNo.1。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的登革1型病毒林的基因組序列由核苷酸序列SEQIDNo.1組成。本發(fā)明還涉及活的減毒登革1型毒林，其可以通過(guò)在細(xì)胞特別是Vero細(xì)胞上進(jìn)一步傳代而衍生自序列SEQIDNo，1的VDV1毒林。本發(fā)明還涉及分離的核酸，其包含DNA序列SEQIDNo.l或其等價(jià)RNA序列，或由DNA序列SEQIDNo.1或其等價(jià)RNA序列組成。"核酸分子"指核糖核苷(腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷或胞苷；"RNA分子")或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥(niǎo)苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物例如硫代磷酸酯和硫酯，其為單鏈形式或雙鏈螺旋。如本文使用的，與SEQIDNo.1"等價(jià)"的RNA序列意指其中脫氧胸苷已被尿苷替換的序列SEQIDNo.1。因?yàn)镾EQIDNo.1構(gòu)成VDV1cDNA序列，因此等價(jià)的RNA序列相應(yīng)于VDV1的正鏈RNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及序列SEQIDNo.41的多蛋白及其片段。SEQIDNo.41是由SEQIDNo.1編碼的多蛋白的序列。參考蛋白質(zhì)的"片段"意指其序列包含參考蛋白質(zhì)的相鄰氨基酸鏈的多肽。片段的長(zhǎng)度可以是至少8個(gè)、至少12個(gè)、至少20個(gè)氨基酸。序列SEQIDNo.41的多蛋白的所述片段至少包含NS3蛋白第481位(SEQIDNo.41的第1956位)的賴氨酸，和/或NS5蛋白第位(SEQIDNo.41的第2618位)的精氨酸。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，由SEQIDNo.1編碼的多蛋白的片段是NS3蛋白和/或NS5蛋白，或者包含NS3蛋白和/或NS5蛋白。^瘦^遂和《,逸合參本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的VDV1毒林的免疫原性組合物，其適合于用作疫苗。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物引發(fā)針對(duì)登革熱病毒的特異性體液免疫應(yīng)答，包括中和抗體。優(yōu)選地，免疫原性組合物是疫苗。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，免疫原性組合物是單價(jià)組合物，即，它引發(fā)只針對(duì)登革1型病毒的特異性免疫應(yīng)答和/或給予只針對(duì)登革1型病毒的保護(hù)。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及多價(jià)登革免疫原性組合物。此類多價(jià)免疫原性組合物或疫苗可以通過(guò)將單個(gè)單價(jià)登革疫苗相組合來(lái)獲得。免疫原性或疫苗組合物可以進(jìn)一步包含至少另一種血清型的活減毒登革熱病毒。特別地，免疫原性或疫苗組合物可以包含與選自血清型2、血清型3和血清型4的至少一種活減毒登革熱病毒相組合的根據(jù)本發(fā)明的VDV1。優(yōu)選地，免疫原性或疫苗組合物可以是四價(jià)登革疫苗組合物，即包含與活的減毒登革2型病毒林、活的減毒登革3型病毒林和活的減毒登革4型病毒林相組合的根據(jù)本發(fā)明的VDV1的疫苗組合物?；畹臏p毒登革2型、登革3型、登革4型病毒林先前已得到描述?？梢詤⒖加蒑ahidolUniversity開(kāi)發(fā)的活減毒疫苗，通過(guò)在原代犬腎(PDK)細(xì)胞中傳代登革血清型2(毒林16681,第53代；LAV2)和血清型4(毒林1036，第48代，LAV4)病毒，以及在原代綠猴腎(PGMK)細(xì)胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)細(xì)胞(第3代)中傳代血清型3(毒林16562)(LAV3)。LAV2(SEQIDNo.42)、LAV3(SEQIDNo.43)和LAV4(SEQIDNo.44)的核苷酸序列顯示于所附序列表中。有利地，活的減毒登革2型毒林可以相應(yīng)于VDV2毒林，其通過(guò)在Vero細(xì)胞上的消毒過(guò)程而從由Mahidol開(kāi)發(fā)的LAV2毒林獲得。特別地，活的減毒登革2型毒林(VDV2)可以包含序列SEQIDNo.40，和有利地由序列SEQIDNo.40組成。免疫原性組合物(包括疫苗)可以制備為為注射劑，其可以相應(yīng)于液體溶液、懸浮液或乳狀液?；钚悦庖咴猿煞挚梢院团c之相容的藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方法進(jìn)行制備。常規(guī)地，將根據(jù)本發(fā)明的抗原與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或賦形劑例如水或磷酸鹽緩沖鹽水溶液、濕潤(rùn)劑、填充劑、乳化劑、穩(wěn)定劑相混合。賦形劑或稀釋劑將根據(jù)所選藥物形式、施用方法和途徑以及藥學(xué)實(shí)踐來(lái)進(jìn)行選擇。合適的賦形劑或稀釋劑以及關(guān)于藥物制劑的要求在Remington'sPharmaceuticalSciences中得到描述，所述參考文獻(xiàn)是這個(gè)領(lǐng)域中的參考書(shū)的例子。優(yōu)選地，免疫原性組合物或疫苗相應(yīng)于可注射組合物，其包含緩沖水溶液以維持例如6-9的pH(于RT用pH計(jì)測(cè)定的)。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含佐劑，即改善或增強(qiáng)由VDV1毒林引發(fā)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。在人疫苗領(lǐng)域中常用的任何藥學(xué)上可接受的佐劑或佐劑混合物可以用于這個(gè)目的。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可以通過(guò)在人疫苗領(lǐng)域中常用的任何常規(guī)途徑進(jìn)行施用，例如腸胃外(例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi))途徑。在本發(fā)明的情況下，免疫原性組合物或疫苗優(yōu)選是在三角肌區(qū)中皮下施用的可注射組合物。^f^^凝神辨才法本發(fā)明進(jìn)一步提供了針對(duì)登革感染對(duì)有此需要的宿主進(jìn)行免疫接種的方法，其包括給宿主施用免疫有效量的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗。"有此需要的宿主，，指處于登革感染危險(xiǎn)中的人，即去存在登革熱病毒感染的地區(qū)旅行的個(gè)體，以及那些地區(qū)的居民。施用途徑是疫苗領(lǐng)域中使用的任何常規(guī)途徑。施用途徑的選擇取決于所選擇的制劑。優(yōu)選地，免疫原性組合物或疫苗相應(yīng)于有利地在三角肌區(qū)中經(jīng)由皮下途徑施用的可注射組合物。免疫原性組合物或疫苗中的LAV或VDV特別是VDV1的量可以方便地表示為病毒噬斑形成單位(PFU)單位或細(xì)胞培養(yǎng)半感染劑量(CCID5。)劑型，并且通過(guò)使用常規(guī)藥學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行制備。例如，對(duì)于單價(jià)組合物j艮據(jù)本發(fā)明的組合物可以以包含10-106CCID5。，或103-105CCIDsoLAV或VDV，例如4±0.5log1QCCID5。VDV1毒林的劑型進(jìn)行制備。當(dāng)組合物是多價(jià)的時(shí)，為了減少病毒干擾的可能性并因此達(dá)到平衡的免疫應(yīng)答(即針對(duì)組合物中包含的所有血清型的免疫應(yīng)答)，在所施用的疫苗中存在的每種不同登革血清型的量可以是不相等的。"免疫有效量"是能夠誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答(包括在已接種疫苗者血清中的中和抗體)的量，如通過(guò)如4.1.2.2節(jié)中所述的噬斑減少中和測(cè)試所評(píng)估的；當(dāng)如此測(cè)定的中和抗體滴度為至少大于或等于1:10時(shí)，血清被視為對(duì)于中和抗體的存在是陽(yáng)性的。施用體積可以依施用途徑而變。皮下注射可以為約0.1ml-1.0ml,優(yōu)選0.5ml的體積。關(guān)于組合物施用的最佳時(shí)間是在最初暴露于登革熱病毒之前約1-3個(gè)月。本發(fā)明的疫苗可以作為預(yù)防劑在處于登革感染危險(xiǎn)中的成人或兒童中施用。因此，所靶向的群體包括未接觸過(guò)登革熱病毒的人以及接觸過(guò)登革熱病毒的人。本發(fā)明的疫苗可以以單次劑量進(jìn)行施用，或者任選地，施用可以涉及使用致敏劑量，隨后為加強(qiáng)劑量，所述加強(qiáng)劑量例如在2-6個(gè)月后施用，這由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定為適當(dāng)?shù)?。本發(fā)明將根據(jù)下列附圖和實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行描述。附1是VDV1前主種子(pre-masterseed)的歷史概括。圖2是流程圖，其概述了所開(kāi)發(fā)的產(chǎn)生填充產(chǎn)品(單價(jià))，"即用型"劑量的制備過(guò)程。圖3是VDV1基因組圖譜的圖示。上方的箭頭是多蛋白的編碼序列。下方的箭頭表示成熟肽的編碼序列。直條表示野生型登革1型毒抹16007和LAV1毒林之間的核苷酸變化。星號(hào)標(biāo)明LAV1和VDV1之間的核苷酸變化。圖4顯示于37X:孵育7天后，對(duì)登革1型病毒LAV1、VDV1和毒林16007的噬斑大小分析。圖5是圖形分析，其顯示了關(guān)于登革1型病毒LAV1、VDV1和毒林16007的噬斑大小分布。圖6是用于在未接觸過(guò)黃病毒的健康成人中評(píng)估VDV1單價(jià)疫苗的安全性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的概括。實(shí)施例實(shí)施例1:消毒1.1病毒RNA的純化最初希望通過(guò)純化和轉(zhuǎn)染從疫苗毒林DEN-16007/PDK10或薦-16007/PDK11(由SanofiPasteur生產(chǎn)，滴度4.60logTCID5。/ml)的早期種子中直接提取的病毒RAN來(lái)進(jìn)行LAV1的消毒。以那種方式進(jìn)行了8種不成功的測(cè)定法，RNA量從103到107個(gè)拷貝變化。然后決定在RNA提取和轉(zhuǎn)染前在Vero細(xì)胞上進(jìn)行1次適應(yīng)傳代。Vero細(xì)胞(VEROLS10p142至145)用主種子(masterseed)DEN-1/PDK11的樣品以0.01的m.o.i.進(jìn)行感染，并于32X:孵育5天。然后，培養(yǎng)基用感染培養(yǎng)基(包含10mMMgS04)替換。第二天可見(jiàn)清晰的致細(xì)胞病變效應(yīng)，并且通過(guò)RT-PCR證實(shí)了培養(yǎng)物上清液中病毒RNA的存在。在感染后第8天收集培養(yǎng)基，用等體積的包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH-7.5)進(jìn)行稀釋，并保持于-70C冷凍直至使用。這種Vero-擴(kuò)增的病毒命名為DEN-1/V100。它的感染滴度在Vero細(xì)胞上進(jìn)行測(cè)定，并且為6.9logTCID5。/ml。RNA純化和轉(zhuǎn)染過(guò)程如下進(jìn)行。將DEN-1VIOO懸浮液進(jìn)行稀釋，以便包含至少3x104和直至3x107TCIDs?；騊FU的病毒/毫升。向0.5ml病毒中加入在0.01mlWilliam，s培養(yǎng)基中稀釋的1個(gè)單位benzonase，以便消化來(lái)自細(xì)胞來(lái)源的DNA或RNA分子，并使溶液于4C在攪拌器上孵育2小時(shí)。在孵育步驟結(jié)沖液，在試劑盒RNeasyMinikit,QiagenRef.74104中提供)，并且蛋白質(zhì)用苯酚/氯仿(1/1，體積/體積)提取l次，再用氯仿(體積/體積)提取l次，隨后于室溫在14，000rpm下離心5分鐘。每次提取后，收集水相，注意不要收集界面處的材料(白色沉淀)，并且轉(zhuǎn)移到干凈的1mlEppendorf管中。隨后根據(jù)制造商(RNeasyminikit，QIAgen)的建議將RNA溶液施加到QIAgen柱上，以便去除痕量溶劑，并用0.06ml不含核酸酶的H20水洗脫。病毒RNA的存在通過(guò)定量RT-PCR，使用用已知量的病毒建立的參考曲線進(jìn)行證實(shí)，單位為T(mén)CID50/ml。1.2用純化的RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用lipofectamine(LF2000Reagent,LifeTechnologies)來(lái)進(jìn)行，所述1ipofectamine是通過(guò)電荷相互作用與RNA結(jié)合并且允許通過(guò)與細(xì)胞膜融合而將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)混合物。LF2000試劑的最佳量在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中通過(guò)下述過(guò)程來(lái)測(cè)定使在16-24小時(shí)前鋪板(在6孔平板中，0.3-0.5x106細(xì)胞/孔)的Vero細(xì)胞與劑量漸增的(5-20ja1)Hpofectamine—起孵育。細(xì)胞隨后于32"C和5%C02下孵育4-5小時(shí)，之后用不含F(xiàn)CS的新鮮培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基，并于32匸繼續(xù)孵育過(guò)夜。在倒置顯微鏡下定期檢查毒性(圓形、有折射力或漂浮的細(xì)胞，細(xì)胞單層的同質(zhì)性)，共48小時(shí)。在這些條件下無(wú)毒的Hpofectamine的最高劑量是10|il，并且被選擇用于RNA轉(zhuǎn)染。使用1/10的經(jīng)純化的RNA制備物(相應(yīng)于大約4x105TCIDsJ平行地進(jìn)行4次轉(zhuǎn)染。將12;微升的病毒RNA溶液在500pl包含10piLF200QReagent(通過(guò)電荷相互作用與RNA結(jié)合并且允許通過(guò)與細(xì)胞膜融合而將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)混合物)的0ptiMEM培養(yǎng)基(GIBC0)中進(jìn)行稀釋。在4次反應(yīng)的2次中加入200ng酵母tRNA作為載體。在加入至6孔平板的匯合Vero細(xì)胞之前，允許4種轉(zhuǎn)染混合物于室溫沉淀10分鐘。于32TC孵育4小時(shí)后，去除轉(zhuǎn)染混合物并將細(xì)胞在PBS中漂洗1次。加入3毫升轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基(Williams，GIBC0)，并于32r繼續(xù)孵育5天。該培養(yǎng)基隨后用3ml登革感染培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10mMMgS04的Williams)替換。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)觀察到中等毒性效應(yīng)并在第3天時(shí)消失。在所有轉(zhuǎn)染測(cè)定法中，在轉(zhuǎn)染后6-8天檢測(cè)到典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)(圓形、有折射力的細(xì)胞)。在這些細(xì)胞的上清液中病毒的釋放通過(guò)qRT-PCR來(lái)證實(shí)。在轉(zhuǎn)染后第6天和第8天收集培養(yǎng)液(3ml)，并匯集在一起。病毒用6ml包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH-7.5)進(jìn)行稀釋，并進(jìn)行冷凍直至進(jìn)一步擴(kuò)增。將在轉(zhuǎn)染后這樣獲得的4種病毒溶液命名為T(mén)V(即在Vero細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染(TransfectioninVerocells)的縮寫(xiě))100、TV200、TV300和TV400，并且顯示出相似的感染滴度(參見(jiàn)下文)TV100:6.95logTCID50TV200:6.80logTCID50TV300:6.80logTCID50TV權(quán)6.85logTCID5。。值得注意的是，轉(zhuǎn)染效率在tRNA存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的樣品(TV300和TV400)中并未顯著增加。1.3轉(zhuǎn)染后回收的病毒的表征測(cè)定DENl-V100和TV100至400的噬斑大小。簡(jiǎn)而言之，Vero細(xì)胞以1，000，000細(xì)胞/(^2的密度在包含4%FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行鋪板。過(guò)夜賻育后，去除培養(yǎng)基，并用系列2倍或5倍稀釋的病毒感染細(xì)胞。于37X:和5。/。C02下1.5小時(shí)后，去除接種物，并將細(xì)胞在包含1.26%甲基纖維素和10%FBS的極限Eagle培養(yǎng)基(MimimalEagleMedium,MEM)中于37匸和5%C02下進(jìn)行孵育。孵育11天后，平板于-20。C在冷丙酮中固定20分鐘，并通過(guò)使用稀釋至2.5jug/ml的黃病毒特異性mAb的免疫染色來(lái)顯示。病毒噬斑使用圖像分析軟件(Saisam/Microvision)來(lái)效'J量。作為對(duì)照，平行地將DEN-116007和LAV1進(jìn)行鋪板。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于表l中。表l:DEN-116007、LAV1、V100(轉(zhuǎn)染前)和TVX00(轉(zhuǎn)染后)的噬斑大小<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增的V100病毒顯示出均質(zhì)的小噬斑(SP)表型。噬斑略微大于在LAV1的不同樣品中觀察到的(直徑2-3mm，而不是<2mm)。這種SP表型在轉(zhuǎn)染后回收的病毒中保留。在TV200樣品中檢測(cè)到，在鋪板的90個(gè)病毒中具有1個(gè)大噬斑(LP)。然而，僅在VERO細(xì)胞上進(jìn)行1次擴(kuò)增傳代后這個(gè)比例變成鋪板的10個(gè)LP對(duì)82個(gè)SP，這暗示LP群體是占優(yōu)勢(shì)的。值得注意的是，與LAV1相比較，平行進(jìn)行的減毒關(guān)鍵位置的測(cè)序并未揭示出轉(zhuǎn)染的病毒中的任何突變。1.4噬斑純化呈現(xiàn)同質(zhì)SP表型的DEN-1/TV100病毒的樣品被選擇用于噬斑純化。簡(jiǎn)而言之，Vero細(xì)胞在6孔平板中進(jìn)行鋪板，并用系列稀釋的病毒進(jìn)行感染，以便獲得每板1-20個(gè)噬斑。于37"€和5%C02下1.5小時(shí)后，去除接種物并使細(xì)胞在3ml固體培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，所述固體培養(yǎng)基由在42C預(yù)加熱的MEM-10%FCS組成，并與在42C進(jìn)行平衡的2%熔化瓊脂糖即時(shí)混合。允許培養(yǎng)基于室溫凝固30分鐘；在流動(dòng)通風(fēng)櫥(flowhood)中，并將板以倒置位置于321C-5%()02孵育10天。隨后加入補(bǔ)充有0.01%中性紅的第二層相同培養(yǎng)基，并使板于32匸再孵育l夜。在無(wú)菌條件下使用配備有0.1ml尖頭(Up)的微量移液管(micro-pipet)挑取4個(gè)良好分離的小噬斑，并轉(zhuǎn)移到包含0.2mlMEM-4%FCS的無(wú)菌管內(nèi)。該懸浮液通過(guò)渦旋振蕩進(jìn)行均質(zhì)化，在相同培養(yǎng)基中進(jìn)行系列稀釋，并立即用于感染Vero細(xì)胞的6孔平板。重復(fù)該方案，并進(jìn)行第二次6個(gè)SP的挑取。在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增之前，在T25cm2燒瓶中將每個(gè)被挑取的噬斑在1ml培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋。在感染后第6天收集培養(yǎng)基，用相同體積的包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH7.5)進(jìn)行稀釋，并冷凍于-70*C。所有這些步驟于32C進(jìn)行。經(jīng)噬斑純化的病毒分別命名為DEN-1/TV111、DEN-1/TV112、畫(huà)-1/TV121、DEN-1/TV131、DNE-1/TV132和DEN-1/TV141。感染滴度在Vero細(xì)胞上進(jìn)行測(cè)定(參見(jiàn)下文)TV111=6.85LogCCID5。/mlTV112-6.80LogCCID5。/mlTV121=6.80LogCCID5。/mlTV131-6.70LogCCID5o/mlTV132=6.45LogCCID5。/mlTV141=5.70LogCCID5。/ml。對(duì)于下列3個(gè)克隆進(jìn)行在Vero細(xì)胞上的第二次擴(kuò)增TVlll、TV112和TV121。1.5經(jīng)克隆的病毒的表征測(cè)定DEN-1/TV111、DEN-1/TV112、DEN-1/TV121、DEN-1/TV131、DEN-lTV132和DEN-1/TV141候選物的噬斑大小。還進(jìn)行特異性減毒基因座的點(diǎn)測(cè)序，并且沒(méi)有揭示出突變(表2)。表2:在DEN-1病毒的減毒特異性點(diǎn)處的測(cè)序<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>核苷酸位置在各自基因下指明，并且參考DEN-116007毒林SEQIDNo2。在不存在能夠區(qū)分這些克隆的任何其他標(biāo)準(zhǔn)的情況下，TV121被任意選擇作為VDV1的前主(pre-master)。總之，在VER0細(xì)胞上進(jìn)行了總共6次傳代以調(diào)整和克隆最初的DEN-116007/PDK11減毒林。在適合于工業(yè)應(yīng)用(環(huán)境控制、原料和實(shí)驗(yàn)的可溯性、動(dòng)物來(lái)源產(chǎn)品的分析證明)的條件下，將病毒RM進(jìn)行純化并轉(zhuǎn)染到限定的VER0細(xì)胞中。VER0適應(yīng)的毒抹通過(guò)噬斑純化進(jìn)行克隆以在VER0傳代數(shù)為6時(shí)產(chǎn)生VDV1疫苗候選物的前主種子。與LAV1相反，VDV1呈現(xiàn)出同質(zhì)小噬斑大小表型。此外，在減毒特異性位置處沒(méi)有鑒定出突變。進(jìn)一步的表征隨后通過(guò)測(cè)定批量(bulk)VDV1全序列和表型測(cè)試來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例2:測(cè)序病毒全序列根據(jù)下述策略來(lái)產(chǎn)生。從包含VDV1的樣品開(kāi)始，提取基因組RNA并進(jìn)行純化，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后由cDNA進(jìn)行所有重疊的PCR擴(kuò)增，在每個(gè)PCR產(chǎn)物的2個(gè)末端添加測(cè)序標(biāo)簽。在自動(dòng)化裝置中產(chǎn)生所有單個(gè)序列并進(jìn)行分析。下一個(gè)步驟由通過(guò)所有單個(gè)序列的多重比對(duì)的基因組重建組成。在這點(diǎn)上，關(guān)于參考序列的每個(gè)意外的核苷酸變化通過(guò)回到原始數(shù)據(jù)而謹(jǐn)慎地進(jìn)行重新分析。此類變化通過(guò)由新PCR產(chǎn)物進(jìn)行的另一個(gè)序列系統(tǒng)地進(jìn)行證實(shí)。一旦解決了所有錯(cuò)讀(ambiguities)，就完成了經(jīng)測(cè)序的病毒基因組，并且在VectorNTi數(shù)據(jù)庫(kù)中形成了新分子。它可以通過(guò)多重序列比對(duì)用于內(nèi)部基因組分析。2.1材料2.1.1病毒此處涉及的病毒是DEN-116007;LAV-1/PDK13;VDV1，其序列在所附的序列表中給出。這些病毒的完整基因組序列長(zhǎng)度為10735個(gè)核苷酸。2.1.2引物所有引物已在Seqweb生物信息學(xué)軟件包(Accelrys)，引物設(shè)計(jì)模塊中進(jìn)行了設(shè)計(jì)(表3)。表3:RT-PCR和測(cè)序引物的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2.2方法2.2.1病毒RNA的純化根據(jù)以前的經(jīng)驗(yàn)，需要最低限度1000DICCs。以在接下來(lái)的步驟中獲得陽(yáng)性RT-PCR反應(yīng)。這意味著需要最低限度104DICCs。/mL的病毒滴度。病毒基因組RNA使用QIAamp病毒RM小試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的建議進(jìn)行純化。簡(jiǎn)而言之，將來(lái)自粗制病毒樣品的140pl體積在裂解溶液存在下進(jìn)行孵育，并加載到試劑盒柱上。洗滌步驟后，純化的病毒RNA通過(guò)60ju1包含1ju1(40個(gè)單位)RNA酶抑制劑(RNAseOut，Sigma)的、不含核酸酶的無(wú)菌水進(jìn)行洗脫。2.2.2反轉(zhuǎn)錄病毒RNA通過(guò)來(lái)自ABGene的反轉(zhuǎn)錄酶(反向iT)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再次應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)操作條件，在20ji1的最終反應(yīng)體積中使用10jil純化的RNA。反應(yīng)通過(guò)負(fù)鏈引物的雜交來(lái)起始。每次PCR進(jìn)行1次RT反應(yīng)(表l)。cDNA合成通過(guò)于471C孵育45分鐘來(lái)獲得。2.2.3PCR所有PCR釆用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(Rochediagnostics)，使用來(lái)自表l的所有16對(duì)引物(+)和(-)來(lái)進(jìn)行。PCR條件如下:RT2p1PCR程序lOx緩沖液2.5(i1變性94X:2分鐘dNTP混合物(lOmM)2n1變性94°C15秒引物各0.8|i1雜交551C30秒H2016.4jal延伸68X:l分鐘酵0.5n1延伸68TC5分鐘所有PCR產(chǎn)物通過(guò)在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳來(lái)檢查。2.2.4測(cè)序測(cè)序反應(yīng)的主要部分已外包給GenomeExpress.基因組末端、錯(cuò)讀、某些內(nèi)部PCR接頭以及用于才支術(shù)原因而未由GenomeExpress測(cè)序的區(qū)域在機(jī)構(gòu)內(nèi)部(in-house)進(jìn)行。.在GenomeExpress的測(cè)序PCR產(chǎn)物于+4X:進(jìn)行運(yùn)輸，并且測(cè)序結(jié)果作為信息序列文件被接受。關(guān)于每個(gè)單個(gè)序列，可獲得文本25文件、質(zhì)量文件(qualityfile)和色鐠圖。序列比對(duì)后，在色語(yǔ)圖上檢查所有差異，并且如果鑒定為序列算法誤差則進(jìn)行校正。機(jī)構(gòu)內(nèi)部測(cè)序測(cè)序反應(yīng)使用SequithermExcel1IILC試劑盒(Epicentre)在熱循環(huán)儀PTC-200(MJResearch)上進(jìn)行。每種PCR產(chǎn)物在單個(gè)反應(yīng)中獨(dú)立地對(duì)2條鏈進(jìn)行測(cè)序。將反應(yīng)體系加載到測(cè)序電泳凝膠上。測(cè)序運(yùn)行和分析在自動(dòng)化測(cè)序儀GeneReadIR4200(Li-Cor)上進(jìn)行。2.3結(jié)果所有PCR片段使用共同的PCR添加尾從2個(gè)末端開(kāi)始進(jìn)行測(cè)序，所述PCR添加尾即在所有引物的5'末端處添加的特異性基序5'引物:M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQIDNo.38)3'引物:M13REV-AACAGCTATGACCATG(SEQIDNo.39)。M13-SEQ和M13-REV序列相應(yīng)于通用M13引物基序(NewEnglandBiolabs標(biāo)準(zhǔn))。對(duì)于最終重疊群裝配，在VectorNTi中，在ContigExpress才莫塊26測(cè)序反應(yīng)DNA高達(dá)200/250ng反應(yīng)緩沖液7.2pi引物(1-2pM)各1.5|i1酶1M1H20高達(dá)20|n1添加3p1變性/加樣緩沖液。樣品于95C變性3分鐘，并緊在樣品加載前用冰冷卻。測(cè)序電、泳電泳參數(shù)凝膠參數(shù)1500V凝膠高度41cm35mA凝膠厚度0.2mm40W溫度45X:時(shí)間9H00掃描速度3PCR程序30個(gè)循環(huán)壓流率行電電功逸4少J^-4少分衫衫分衫乂乂CIirj乂>_JPPPPP性性交伸伸n雜延延(Informax)中進(jìn)行快速分析。將LAV1參考序列與所有單個(gè)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。在此類條件下，所有結(jié)果可以在完整基因組上的右側(cè)位置處進(jìn)行比對(duì)，甚至當(dāng)某些區(qū)域仍缺少重疊群裝配時(shí)，從而產(chǎn)生總基因組比對(duì)的快速顯現(xiàn)。2.3.1完整的VDV1序列的裝配最終序列比對(duì)在VectorNTi，AlignX模塊(Informax)中進(jìn)行。通過(guò)軟件將常規(guī)多重序列比對(duì)算法ClustalW(Thompson等人，1994)用于建立總體比對(duì)。所有序列結(jié)果連同LAV1參考序列一起比對(duì)，從而允許更好地重建基因組。關(guān)于參考而言在序列中的任何差異需要在另一次獨(dú)立測(cè)序反應(yīng)上進(jìn)行證實(shí)。VDV1的完整序列顯示于SEQIDNo.1中。通常在單個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)某些錯(cuò)讀，特別是在序列末端附近。這是在任何PCR片段的2個(gè)末端處一定程度的反應(yīng)質(zhì)量差的內(nèi)在原因。此類質(zhì)量差的序列被排除在比對(duì)之外，直至可從其他PCR產(chǎn)物獲得2個(gè)其他獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)。當(dāng)在至少2個(gè)獨(dú)立的與共有序列相匹配的其他PCR序列中未得到證實(shí)時(shí)，相對(duì)于參考的差異在最終比對(duì)中不加以考慮。相反地，在2個(gè)獨(dú)立序列上證實(shí)的任何差異在最終序列中保留。表4概括了每個(gè)單獨(dú)測(cè)序反應(yīng)的特征，指出了起點(diǎn)、終點(diǎn)和長(zhǎng)度。還指出了鄰近PCR之間的重疊，以及指出了在最后一列中與參考序列的差異。表4:登革VDV1單獨(dú)序列的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>基因組的2個(gè)末端不能由PCR擴(kuò)增進(jìn)行測(cè)序，因?yàn)閏DNA合成和PCRDM反應(yīng)需要與基因組末端互補(bǔ)的寡核苷酸。在擴(kuò)增步驟過(guò)程中，這些寡核苷酸被摻入PCR片段中。序列結(jié)果是合成的寡核苷酸的序列，而不是病毒自身的序列。來(lái)自病毒基因組2個(gè)末端的PCR確實(shí)正確地運(yùn)轉(zhuǎn)，這暗示病毒序列與所述寡核苷酸序列并無(wú)顯著不同(如果有顯著不同，那么PCR擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)已失敗或至少應(yīng)當(dāng)具有差的質(zhì)量)?；蚪M的2個(gè)末端不能與所有其他PCR擴(kuò)增區(qū)分開(kāi)。因此，在重建的基因組(SEQIDNo.1)中，2個(gè)基因組末端被視為等同于寡核苷酸序列(并且還等同于參考)。在5'末端，所述序列是核苷酸l-34的序列。在3'末端，所述序列是核普酸10707-10735的序列。2.3.2序列比較VDV1毒林和LAV1參考之間的直接序列比較顯示了一連串的3個(gè)核苦酸差異。表5給出了這些位置的全部列表。表5:LAV1和VDV1毒林之間的序列比較<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>第2719位處的核普酸變化在氨基酸水平上是沉默的。第5962位處的第二個(gè)差異引發(fā)了在NS3-481處的氨基酸變化(天冬酰胺至賴氨酸)。兩者都是親水的，但賴氨酸帶正電，而天冬酰胺則不是。最后一個(gè)差異位于NS5肽中，將位置NS5-125處的賴氨酸置換成精氨酸。這樣的氨基酸置換從化學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看是相對(duì)保守的，精氨酸和賴氨酸殘基是親水的和帶正電的。表6:在其他登革l毒林上的差異的搜索<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>當(dāng)在所有可獲得的Genbank血清型1登革基因組序列之間進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，看起來(lái)大部分鑒定的差異也存在于其他毒林上(參見(jiàn)表6)。1個(gè)位置在VDV1毒林中是獨(dú)特的(第7947位；NS5-125)。因此，登革熱病毒的VDV1毒林的全部基因組序列已確定。已檢測(cè)到相對(duì)于親本LAV1基因組序列的3個(gè)核香酸差異。VDV1疫苗毒林通過(guò)病毒"消毒"和從犬到猴細(xì)胞的傳代而衍生自LAV1。LAV1和VDV1之間的差異可以具有幾個(gè)來(lái)源。首先，克隆步驟可以選出與LAV1中先前檢測(cè)的主要序列并非100%—致的病毒亞群。其次，LAV1在PDK細(xì)胞上產(chǎn)生，而VDV1在Vero細(xì)胞上制備。此類從犬到猴細(xì)胞的傳代可能誘導(dǎo)病毒變化，其反映了對(duì)新細(xì)胞系的適應(yīng)。第三，對(duì)于所有RNA病毒，較低的病毒RNA聚合酶保真度觸發(fā)了比DNA聚合酶更高的基因組突變率。就序列而言，在LAV1和VDV1之間只觀察到3個(gè)差異，相應(yīng)于只有2個(gè)氨基酸置換。與LAV1病毒減毒相關(guān)的所有14個(gè)核苷酸位置在VDV1中被保留。此外，還比較了主和批量VDV1的序列(表7)。表7:野生型16007毒林以及減毒的LAV1/PDK13和VDV1毒株之間的登革1核苷酸差異<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>Ser將VDVl主種子的全序列與批量序列進(jìn)行比對(duì)。在這兩個(gè)序列之間沒(méi)有觀察到差異，這表明經(jīng)過(guò)傳代的遺傳穩(wěn)定性。VDV1顯示了相對(duì)于其LAV1親本的顯著的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例3:表征這些研究的目的是評(píng)估減毒標(biāo)記中的變化是否通過(guò)傳代而出現(xiàn)。圖2中顯示的流程圖概述了所開(kāi)發(fā)的產(chǎn)生填充產(chǎn)品(單價(jià))，"即用型"劑量的制備過(guò)程。簡(jiǎn)而言之，由研究部門(mén)遞送的病毒前主種子在Vero細(xì)胞上2次連續(xù)傳代后，獲得各自的工作種子(workingseed)。最終病毒培養(yǎng)也通過(guò)感染Vero細(xì)胞懸浮液來(lái)實(shí)施。隨后收獲產(chǎn)生的病毒。脫氧核糖核酸(DNA)根據(jù)酶處理進(jìn)行消化。雜質(zhì)通過(guò)超濾來(lái)去除。感染滴度通過(guò)濃縮步驟而得到增強(qiáng)。加入包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH-7.5)，并且隨后將這種經(jīng)0.22-jum過(guò)濾的混合物在相同溶液內(nèi)稀釋至靶定的劑量。然后將活性物質(zhì)填充到玻璃管形瓶?jī)?nèi)，冷凍干燥，并在使用前進(jìn)行貯存。3.1表型標(biāo)記結(jié)果顯示于表8中。對(duì)主種子和批量種子進(jìn)行的驗(yàn)證測(cè)試是嗟斑大小:該測(cè)定法在孵育7天后于37"C在Vero細(xì)胞中進(jìn)行。噬斑的大小測(cè)定在用攝像機(jī)捕獲圖像后通過(guò)Saisamv.5.2.0(MicrovisionInstruments)專用軟件來(lái)進(jìn)行。在LAV1中檢測(cè)到2種群體(0.3mm和0.8mm)。主要群體是最小的。在適應(yīng)Vero細(xì)胞和生物學(xué)克隆后，VDV1噬斑大小分布看起來(lái)是同質(zhì)的，群體的超過(guò)98%顯示出集中至直徑0.8mm的單個(gè)峰。這些噬斑明顯不同于用DEN-116007病毒獲得的噬斑(參見(jiàn)圖4和5)。溫度敏感性:相對(duì)于非溫度敏感(Ts)的野生型(WT)D1-16007,單價(jià)l顯示出于39X:的明顯受限制的生長(zhǎng)。這通過(guò)感染滴度測(cè)定法和通過(guò)病毒RNA定量進(jìn)行證明。與37x:相比較，于wx:單價(jià)i種子的主種子、批量種子和第18代(在批量傳代物后10代)展示出90%或更多的滴度減少。表8:DEN-1病毒表型的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*n:動(dòng)物數(shù)目3.2基因型標(biāo)記VDV1疫苗毒抹可以在基因組水平上與親本毒株區(qū)分開(kāi)。已鑒定了減毒特異性基因座。這些基因座在主和批量種子中被保留。實(shí)施例4:在猴中的免疫原性、病毒血癥和毒理學(xué)可以在猴中獲得的最可靠和眾多的數(shù)據(jù)涉及免疫原性和病毒血癥。特別地，病毒血癥已被鑒定為與人中的毒力和疾病嚴(yán)重度有關(guān)的因素之一，并隨后構(gòu)成了所考慮的重要參數(shù)。很顯然，免疫原性是測(cè)試疫苗時(shí)的關(guān)鍵參數(shù)。發(fā)明人已確定了關(guān)于病毒血癥和免疫原性的最小/最大值。表9:對(duì)于在猴中由登革疫苗候選物誘導(dǎo)的應(yīng)答的最低要求，如在Vero或LLC-MK2細(xì)胞(這些細(xì)胞在此類測(cè)定法中視為等價(jià)的)中通過(guò)噬斑測(cè)定法測(cè)量的<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>pfu:噬斑形成單位PRNT50:噬斑減少中和滴度50(相應(yīng)于噬斑數(shù)目減少50%的滴度)4.1材料和方法4.1.1猴實(shí)驗(yàn)猴實(shí)驗(yàn)根據(jù)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的歐洲指南來(lái)進(jìn)行。對(duì)來(lái)自毛里求斯(CRPLeVallon)的恒河猴(食蟹猴(尸a;yc/cz;/ar/s))進(jìn)行免疫接種。在免疫接種前，猴在SanofiPasteur的動(dòng)物研究所隔離檢疫6周。猴通過(guò)皮下(SC)途徑在臂中用體積0.5ml的疫苗進(jìn)行免疫(參見(jiàn)各個(gè)分別的部分)。在用氯胺酮(Imalgene，Merial)輕度麻醉后，通過(guò)刺破腹股溝靜脈或隱靜脈來(lái)收集血液。在第0和28天，抽取5ml血液用于評(píng)估抗體應(yīng)答，而在第2和10天之間只抽取1ml血液用于評(píng)估病毒血癥。在水上收集血液并保持在冰上直至血清分離。為了做到這點(diǎn)，血液于4x:離心20分鐘，并且收集血清并貯存于-80x:直至在RichKinney's實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行測(cè)試。在干冰中裝運(yùn)到美國(guó)。4.1.2病毒血癥和中和抗體應(yīng)答(噬斑減少中和測(cè)試，PRNT)所有分析在CDC，F(xiàn)ortCollins,USA的R.Kinney實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。裝運(yùn)血清樣品并貯存于-80X:直至測(cè)試時(shí)。在第一次解凍時(shí)，就病毒血癥測(cè)試樣品，并對(duì)血清作1:5稀釋。在就中和抗體進(jìn)行測(cè)試之前，使1:5血清稀釋物于561c滅活30分鐘?！秮A么J病^j&癥將0.125ml血清加入至在96孔平板的第1個(gè)孔中的0.125ml稀釋劑(RPMI培養(yǎng)基)之中，并進(jìn)行10倍系列稀釋，對(duì)于每次稀釋將0.025ml轉(zhuǎn)移到0.225ml稀釋劑中。將0.2ml10°3-105'3稀釋系列在Vero細(xì)胞的6孔平板中進(jìn)行鋪板(病毒于37。C吸附1.5小時(shí)，用4ml不含中性紅的瓊脂糖覆蓋，6-7天后用2ml包含中性紅的瓊脂糖覆蓋，并計(jì)數(shù)噬斑)。病毒檢測(cè)極限是-10PFU/ml。關(guān)于對(duì)照，將原液DEN-16007PDK-13(LAV1)疫苗進(jìn)行鋪板。《厶么2WATf#和浙試J中和抗體如Huang等人(2000)中所述進(jìn)行定量。簡(jiǎn)而言之，將0.2ml熱滅活的經(jīng)1:5稀釋的血清加入96孔平板的第一個(gè)孔中，并進(jìn)行2倍系列稀釋，對(duì)于每次稀釋將0.1ml轉(zhuǎn)移到0.1ml稀釋劑(RPMI培養(yǎng)基)中。這導(dǎo)致產(chǎn)生1:10-1:320的血清稀釋系列。將0.1mlDEN病毒(60-160PFU;親本DEN116007病毒)加入至每個(gè)血清稀釋孔中，得到總共0.2ml血清-病毒混合物。96孔平板于41C孵育過(guò)夜。將0.1ml血清-病毒混合物(包含30-80PFU的輸入病毒)在6孑LVero平板中進(jìn)行鋪板(如上文在"病毒血癥"部分所指明的)，并且在用中性紅染色后計(jì)數(shù)噬斑。在2倍、1倍和0.5倍測(cè)試濃度下輸入病毒的多次反向滴定(backtitration)提供了輸入PFU的直接實(shí)驗(yàn)測(cè)定，這是用于測(cè)定50%(PRNT5。)和70%(PRNT7。)終點(diǎn)抗體滴度的基礎(chǔ)。陰性血清結(jié)果應(yīng)當(dāng)具有〈1:10的中和抗體滴度。顯示出320的中和滴度的血清在1:80-1:2560的稀釋度進(jìn)行再次測(cè)試，以確定終點(diǎn)滴度。4.2VDV〗矣選物的評(píng)估4.2.1VDVl/前主VDV1候選物的純化/選擇已如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。所選克隆(基于表型標(biāo)記和序列)已如在"材料和方法"中所述的在sanofipasteur(Marcy1，Etoile動(dòng)物研究所，115)中對(duì)來(lái)自CRPLeVallon，毛里求斯的雄性恒河猴(食蟹猴，平均重量3.1kg)進(jìn)行了測(cè)試。在第0天免疫接種后，從第2天到第10天追蹤病毒血癥，并且在第0天和第28天測(cè)量免疫原性。當(dāng)以液體形式時(shí)，所有病毒和疫苗保存于-70'C。LAV1:滴度1039DICC5。/ml;凍干的，重懸浮于0.5mlPBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6，，0.lg/1)中，并且全部施用。前主VDV1DEN1-TV111:滴度1059DICC5。/ml;液體，在PBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6，,0.lg/1)中稀釋至1053pfu/ml;施用0.5ml。通過(guò)SC途徑在臂中用23G1針進(jìn)行注射，對(duì)于VDV1采用105DICC5。的劑量。結(jié)果呈現(xiàn)于表10中。第28天時(shí)的滴定一式三份(PRNT7。)或一式兩份(PRNT5。)地進(jìn)行。表10:VDV1前主的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>簡(jiǎn)而言之，應(yīng)答在每個(gè)組中是相當(dāng)均一的，并且對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體可以鑒定出某些清晰的趨勢(shì)。在VDV1和LAV1之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異在某些LAV1猴中觀察到低且晚的病毒血癥。VDV1看起來(lái)是令人滿意的，并且特別是沒(méi)有呈現(xiàn)病毒血癥。4.2.2雨1批量因?yàn)樵谇爸?Premaster)階段已測(cè)試了疫苗的免疫原性，所以在批量階段設(shè)計(jì)了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試每個(gè)單價(jià)疫苗。如前面一樣使用來(lái)自C.R.P.LeVallon，lieMaurice的雄性食蟹猴(24只猴，平均重量3.4kg)。VDV1:批次滴度8.37loglODICC5。/ml安慰劑含Ca"和Mg2+的PBS疫苗在PBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6H20，0.lg/1)中稀釋至1053DICC5。/ml;通過(guò)SC途徑在臂中用23G1針施用0.5ml，相應(yīng)于105DICCs。的劑量。病毒血癥和免疫原性已照例在CDC中由RKinney進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示于表ll中。VDV1單價(jià)疫苗誘導(dǎo)了顯著的免疫應(yīng)答而不存在病毒血癥。因此，這種單價(jià)VDV1滿足在猴中最初限定的成功標(biāo)準(zhǔn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>4.3在猴中的神經(jīng)毒力測(cè)試對(duì)于每個(gè)病毒類型，IO只來(lái)自毛里求斯的恒河猴通過(guò)大腦內(nèi)途徑(在每個(gè)半球的丘腦中107'23CCID5。/mL)用VDV1主種子進(jìn)行接種。在測(cè)試結(jié)束時(shí)，將猴處死并用福爾馬林溶液灌注。組織樣品取自每只猴的腦(延髓、腦橋和小腦、中腦、丘腦(包括左和右部)、大腦皮層的左和右側(cè))。切下厚度為8Mm的切片并通過(guò)曙紅和掊花青進(jìn)行染色。在用VDV1種子注射的猴腦中沒(méi)有觀察到病原性的組織病理學(xué)征兆。實(shí)施例5:單價(jià)VDV1在未接觸過(guò)黃病毒的年齡為18-40歲的健康成人中的安全性這個(gè)1期試驗(yàn)的目的是證明在未接觸過(guò)黃病毒的成人中與Stamaril(用作對(duì)照組)相比較，單價(jià)VDV1在104CCIDs。的病毒濃度下的安全性、病毒血癥和免疫原性特性。給予單次注射，在6和12個(gè)月時(shí)隨訪。對(duì)于安全預(yù)防措施，在研究中進(jìn)行順次包括。參與和疫苗接種因此是交錯(cuò)的第1個(gè)群組(n-V組，總數(shù)n-l2)進(jìn)行了疫苗接種。在決定繼續(xù)對(duì)剩余受試者(11=8/組，總數(shù)n-16)進(jìn)行疫苗接種之前，一直到第28天收集的安全性數(shù)據(jù)由獨(dú)立數(shù)據(jù)監(jiān)察委員會(huì)(IndependentDataMonitoringCommittee)(IDMC)和皇家阿德雷德醫(yī)院研究藥物小組委員會(huì)(RoyalAdelaideHospitalInvestigationalDrugsSubcommittee)(IDSC)進(jìn)行評(píng)審。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的圖示在圖6中提供。施用疫苗后，患者定期接受各種臨床檢查和測(cè)試。這個(gè)隨訪的概括在下表12中給出。參與的群體由在入選當(dāng)天時(shí)年齡為18-40歲(即18歲生日那一天至41歲生日前那一天)的成人組成，所述成人是未接觸過(guò)黃病毒的[存在針對(duì)黃病毒疾病(例如黃熱病、日本腦炎、登革熱)的疫苗接種；或黃病毒感染史(經(jīng)臨床、血清學(xué)或微生物學(xué)證實(shí))，或以前居住在具有高度的登革感染地方流行性的地區(qū)或去具有高度的登革感染地方流行性的地區(qū)旅行(無(wú)論持續(xù)時(shí)間多長(zhǎng))，或居住在NorthQueensland2周或更長(zhǎng)時(shí)間或去NorthQueensland旅行2周或更長(zhǎng)時(shí)間的人被排除]表12:關(guān)于隨訪的流程圖<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>V:就i貪-D:天口就診之間的時(shí)間間隔將由研究疫苗接種日期進(jìn)行計(jì)算，所述研究疫苗接種日期可能不同于就診日期(例如在符合臨時(shí)排除標(biāo)準(zhǔn)的情況下)。V06和V07必須以至少1天的間隔進(jìn)行。測(cè)試的產(chǎn)品是評(píng)估的疫苗是管形瓶中的凍干產(chǎn)品，所述凍干產(chǎn)品用分開(kāi)提供的稀釋劑即時(shí)重構(gòu)活性成分4士0.51ogi。CCID5。的單價(jià)Vero登革熱病毒血清型1(VDV1)/0.5mL劑量;稀釋劑無(wú)菌NaCl4%。溶液，用于疫苗重構(gòu)。重構(gòu)的疫苗，即0.5mL單價(jià)VDV1的NaCl4%。溶液，應(yīng)當(dāng)立即使用或維持于+2X:-+8*0直至使用。在三角肌區(qū)中皮下施用0，5mL疫苗劑量。對(duì)照疫苗Stamaril⑤是由AventisPasteur生產(chǎn)的黃熱病疫苗。Stamaril⑧表現(xiàn)為凍千的、不含禽白血病的、穩(wěn)定化的產(chǎn)品，其緊在使用前用稀釋劑進(jìn)行重構(gòu)。(活性成分活的減毒黃熱病病毒(17D毒林)>1，000小鼠半致死劑量(LD5。)/稀釋劑無(wú)菌NaCl4%0溶液)。在三角肌區(qū)中皮下施用對(duì)照疫苗。試驗(yàn)的初步結(jié)果報(bào)告在下表13中。表13:初步的安全性數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>1表13顯示，生物學(xué)異常(WCC減少、血小板計(jì)數(shù)減少)都是輕微的。癥狀主要是不適、惡心、腹瀉和偶然嘔吐。它們具有中等嚴(yán)重性。l個(gè)顯著的滲-典型的"病毒"斑丘疹，在笫12天發(fā)作，90%覆蓋度(coverage)。第2個(gè)群組的安全性數(shù)據(jù)也是令人滿意的，沒(méi)有報(bào)告生物學(xué)異常。所有受試者在針對(duì)登革1進(jìn)行疫苗接種后28天具有抗體應(yīng)答(滴度為1315—13150)。參考文獻(xiàn)Bhamarapravati，N和YoksanS.(1997).DengueandDengueHemorrhagicFever.Liveattenuatedtetravalentdenguevaccines,CABIPublishing,367-379.DeFraitesRF，SmoakBL，TrofaAF，HokeCH，Kanesa-thasanN,KingA,MacArthyPO，等人，DenguefeveramongU.S.militarypersonnel-Haiti,September-November,1994.MMWR1994;43:845-848.Dunnen和Antonarakis(2000)Mutationnomenclatureextensionsandsuggestionstodescribecomplexmutations:adiscussion.HumMutation.15:7-12'，Erratumin:HumMutat2002;20(5):403GublerDJ.Dengue.(1988)In:Epidemiologyofarthropod—borneviraldisease.MonathTPM，editor,BocaRaton(FU:CRCPress:223-60GublerDJ，KunoG.Dengue和DengueHemorrhagicFever.CABInternationalPublishing1997GublerD.Epidemicdengue/denguehemorrhagicfeverasapublichealth,socialandeconomicprobleminthe21stcentury.(2002)TRENDSinMicrobiology.10:100-103Huang等人，(2000).J.Virol74;3020-3028.KautnerI，RobinsonMJ，KubnleU.(1997)DengueVirusinfection:Epidemiology,pathogenesis,clinicalpresentation,diagnosis,andprevention.JofPediatrics;131:516-524Monath，TP.(1994)Dengue:therisktodevelopedanddevelopingcountries.ProcNatlAcadSci;91:2395-2400.Rigau-P6rezJG，ClarkGG，GublerDJ，ReiterP，SandersEJ，VorndamAV.(1998)Dengueanddenguehaemorrhagicfever.Lancet;352:971-977.RothmanAL,EnnisFA.(1999)Immu卿athogenesisofdenguehemorrhagicfever.Virology;257:1—6SabinAB.(1952)ResearchondengueduringWorldWarII.AmJTropMedHyg;1:30-50ShirtcliffeP，CameronE，NicholsonKG,WiselkaMJ.(1998)Don'tforgetdengue!Clinicalfeaturesofdenguefeverinreturningtravellers.JRoyCollPhysLond.;32:235-237.ThompsonJD，HigginsDG和GibsonTJ.(1994)CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,.position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.Nucl.Acids.Res.,22(22)，4673-4680VaughnDW，GreenS,KalayanaroojS，InnisBL，NimmannityaS，SuntayakornS，RothmanAL，EnnisFA，NisalakA.(1997)Dengueintheearlyfebrilephase:viremiaandantibodyresponse.JInfectDis;176:322-30.VaughnDW,GreenS，KalayanaroojS，InnisBL，NimmannityaS，SuntayakornS，EndyTP,RaengsakulrachB，RothmanAL，ErmisFA，NisalakA.(2000)Dengueviremiatiter,antibodyresponsepattern,andvirusserotypecorrelatewithdiseaseseverity.JInfDis;181:2-9.WHOTechnicalGuide,1986.Denguehaemorrhagicfever:diagnosistreatmentandcontrol,pl-2.WorldHealthOrganization,Geneva,SwitzerlandWuS,Grouard-VogelG，SunW，MascolaJ，BrachtelE，PutvatanaR.(2000)HumanskinLangerhanscellsaretargetsofdenguevirusinfection.NatureMed;7:816—820權(quán)利要求1.活的減毒登革1型病毒株，其包含序列SEQIDNo.3，其中至少第5962和7947位的核苷酸被突變，條件是下列核苷酸不被突變1323、1541、1543、1545、1567、1608、2363、2695、2782、5063、6048、6806、7330和9445。2.根據(jù)權(quán)利要求1的登革1型病毒林，其中第2719位的核苷酸進(jìn)一步被突變。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的登革1型病毒林，其中SEQIDNo.3包含突變2719G>A、5962OA和7947A>G。4.根據(jù)權(quán)利要求1—3中任一項(xiàng)的登革1型病毒林，其進(jìn)一步包含在給定密碼子位置中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換，所述置換不導(dǎo)致那個(gè)位置處所編碼的氨基酸的改變。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的登革l型病毒林，其包含SEQIDNo.1。6.免疫原性組合物，其在藥學(xué)上可接受的載體中包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的活的減毒登革1型病毒林。7.疫苗組合物，其在藥學(xué)上可接受的載體中包含根據(jù)權(quán)利要求1—5中任一項(xiàng)的活的減毒登革1型病毒林。8.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其是單價(jià)疫苗組合物。9.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其是多價(jià)登革疫苗組合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物，其包含含有序列SEQIDNo.40的活的減毒登革2型病毒林。11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其包含103-106CCIDs。的根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的活的減毒登革1型病毒林。12.分離的核酸，其包含DNA序列SEQIDNo.1或其等價(jià)RNA序列。13.由SEQIDNo.1或其片段編碼的分離的多蛋白，其至少包含NS3蛋白第481位的賴氨酸，和/或NS5蛋白第1"位的精氨酸。14.根據(jù)權(quán)利要求13的多蛋白的片段，其包含NS3蛋白和/或NS5蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及活的減毒VDV1(VERO來(lái)源的登革血清型1病毒)毒株，其通過(guò)在PDK上傳代并在Vero細(xì)胞上消毒而衍生自野生型登革1型毒株16007。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含VDV1毒株的疫苗組合物。文檔編號(hào)C07K14/18GK101238144SQ200680028498公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2006年5月18日優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日發(fā)明者B·蓋伊,C·黃,J·朗,R·奇尼,V·巴班申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德有限公司;病害控防中心