一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的elisa試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明通過免疫沉淀技術(shù)篩選雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原GroEL，利用原核表達載體表達GroEL重組蛋白，并利用該抗原蛋白建立了檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒。本發(fā)明試劑盒在檢測雞白痢沙門氏菌抗體過程中能夠減少雞的應(yīng)激，并提高檢測特異性和敏感性。
【專利說明】—種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗原制備及ELISA試劑盒，具體地說，涉及一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的敗血性傳染性疾病，其排泄物是重要的傳播媒介，同時也可通過雞蛋垂直傳播，是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。
[0003]雞白痢沙門氏菌多侵害20日齡以內(nèi)幼雛，引起白色下痢，病死率極高，成年雞則可帶菌而無臨床癥狀。該病既可垂直傳播，又有嚴(yán)重的水平傳播，所以造成的危害和經(jīng)濟損失巨大。目前西方國家已完全消滅了雞白痢，但我國仍然爆發(fā)嚴(yán)重。常規(guī)的雞白痢檢測方法為平板凝集，通過針刺雞采血，在平板上與雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原混合,通過出現(xiàn)凝集現(xiàn)象來判斷是否感染雞白痢沙門氏菌。由于通過針刺采血對雞應(yīng)激大,容易造成雞的生產(chǎn)性能下降，甚至肝脾破裂死亡，蛋雞尤為明顯，同時大型雞場存欄量大，工作量繁重，而一般陰性血清在足夠時間下也會產(chǎn)生凝集，易造成假陽性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是建立一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA方法，在檢測雞白痢過程中減少雞的應(yīng)激，提高特異性和敏感性。
[0005]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒，所述試劑盒內(nèi)含有雞白痢沙門氏菌抗原GroEL蛋白。
[0006]進一步地，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有:包被雞白痢沙門氏菌抗原的抗體檢測板,酶標(biāo)抗體，陽性對照為雞白痢陽性血清，陰性對照為雞白痢陰性血清。
[0007]作為優(yōu)選，所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體。
[0008]進一步地，所述雞白痢沙門氏菌抗原GroEL蛋白為純化的雞白痢沙門氏菌重組蛋白 GroEL0
[0009]更進一步地，所述雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL是由原核表達載體pET-28a-GroEL表達的，原核表達載體pET-28a_GroEL是由以下方法構(gòu)建而成的:
[0010]I)設(shè)計一對含有酶切位點的特異性引物:
[0011]GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
[0012]GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ；
[0013]2)利用上述特異性引物，以雞白痢沙門氏菌基因組為模板，擴增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性內(nèi)切酶，分別對PCR擴增產(chǎn)物和pET-28a原核表達載體進行酶切，用T4DNA連接酶將擴增片段的酶切產(chǎn)物連接到pET-28a酶切產(chǎn)物上，構(gòu)建pET-28a-GroEL載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)中，經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定，表明重組原核表達載體pET-28a-GroEL構(gòu)建成功。
[0014]進一步地，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有:封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液和終止液。[0015]封閉液為PBST配制5%脫脂奶粉；樣品稀釋液為I XPBS ;洗滌液為PBST ;顯色液為IOOmmol檸檬酸鈉溶液24.3mL,200mmol磷酸氫二鈉25.7ml，加入50mg TMB,臨用前加入50微升30%H202配制；終止液為2M濃硫酸。
[0016]本發(fā)明還提供了所述試劑盒的使用方法:
[0017]將待檢血清或者蛋黃液按1:100比例經(jīng)PBS稀釋后加入抗體檢測板中，每孔100 μ L，并同時設(shè)立好陰、陽性對照，37°C作用I小時；接著PBST洗三遍；用PBS將辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體按1:5000稀釋，每孔100 μ L加入反應(yīng)板中，37°C作用30分鐘；接著PBST洗三遍；按每孔加入100 μ L顯色液，37°C作用約15分鐘后加入2M硫酸終止液終止反應(yīng)，最后通過酶標(biāo)儀檢測，陰性平均值+2.58SD為臨界值，大于臨界值判為陽性，反之為陰性。
[0018]本發(fā)明還提供了 一種表達雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL的載體。
[0019]進一步地，所述載體為原核表達載體，是由以下方法構(gòu)建而成的:
[0020]I)設(shè)計一對含有酶切位點的特異性引物:
[0021]GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
[0022]GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ；
[0023]2)利用上述特異性引物，以雞白痢沙門氏菌基因組為模板，擴增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性內(nèi)切酶，分別對PCR擴增產(chǎn)物和pET-28a原核表達載體進行酶切，用T4DNA連接酶將擴增片段的酶切產(chǎn)物連接到pET-28a酶切產(chǎn)物上，構(gòu)建pET-28a-GroEL載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)中，經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定，表明重組原核表達載體pET-28a-GroEL構(gòu)建成功。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于:
[0025]本發(fā)明通過免疫沉淀技術(shù)篩選出雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原GroEL，該抗原具有良好的特異性和敏感性，可用于雞蛋和血清中雞白痢沙門氏菌抗體檢測，可以大大減少雞的應(yīng)激，提高經(jīng)濟效益，提高工作效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實施例1中雞白痢陰、陽性血清純化IgG ；
[0027]其中，A為雞白病陽性血清純化IgG，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化如；2:純化后；B為雞白痢陰性血清純化IgG，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化后；2:純化前。
[0028]圖2為本發(fā)明實施例1中免疫沉淀技術(shù)篩選雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原；A為SDS-PAGE電泳圖；B為肽指紋圖譜分析圖；
[0029]其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:雞陰性血清(純化后IgG);2:雞白痢沙門氏菌陽性血清(純化后IgG) ；3:雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物；4:beads+兔抗雞IgG 二抗+雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物；5:beads+兔抗雞IgG 二抗+雞陰性血清(純化后IgG) +雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物；6:beads+兔抗雞IgG 二抗+雞白痢沙門氏菌陽性雞血清(純化后IgG) +雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物。
[0030]圖3為本發(fā)明實施例2中雞白痢沙門氏菌基因組電泳鑒定圖；
[0031]其中，M:基因組分子量標(biāo)準(zhǔn)XDNAHind III ；1:雞白痢沙門氏菌基因組DNA。
[0032]圖4為本發(fā)明實施例2中雞白痢沙門氏菌GroEL基因擴增片段的電泳鑒定圖；[0033]其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:雞白痢沙門氏菌GroEL基因擴增片段。
[0034]圖5為本發(fā)明實施例2中pMD19-T_GroEL連接產(chǎn)物的雙酶切電泳鑒定圖；
[0035]其中，A =GroEL基因PCR鑒定；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I =GroEL基因；B:pMD19-T-GroEL雙酶切鑒定；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空載質(zhì)粒雙酶切前；2:pMD19-T-GroEL質(zhì)粒雙酶切后。
[0036]圖6為本發(fā)明實施例2中pET-28a_GroEL連接產(chǎn)物的雙酶切電泳鑒定圖；
[0037]其中，A =GroEL基因PCR鑒定；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；I =GroEL基因；B:pET-28a-GroEL雙酶切鑒定；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空載質(zhì)粒雙酶切前；2:pET-28a-GroEL質(zhì)粒雙酶切后。
[0038]圖7為本發(fā)明實施例3中原核表達載體的轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達SDS-PAGE電泳圖；
[0039]其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:誘導(dǎo)前空載體；2:誘導(dǎo)后空載體；3:含pET-28a-GroEL質(zhì)粒的BL21基因工程菌誘導(dǎo)前表達細菌總蛋白；4:含pET-28a_GroEL質(zhì)粒的BL21基因工程菌誘導(dǎo)后表達細菌總蛋白。
[0040]圖8為本發(fā)明實施例3中GroEL重組蛋白的蛋白印跡鑒定；
[0041]其中，A =His單克隆抗體檢測；1 =GroEL-His重組蛋白；2:空載體誘導(dǎo)對照；B:雞白痢陰性血清(雞場采集)檢測；3 =GroEL-His重組蛋白；4:空載體誘導(dǎo)對照；C:雞白痢陽性血清(雞場采集)檢測；5:空載體誘導(dǎo)對照；6 =GroEL-His重組蛋白。
[0042]圖9為本發(fā)明實施例3中GroEL重組蛋白的純化中SDS-PAGE考馬斯亮藍染色分析；
[0043]其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:含pET-28a_GroEL質(zhì)粒的BL21基因工程菌誘導(dǎo)表達細菌總蛋白；2:穿透液蛋白；3:洗脫液蛋白；4:純化的GroEL-His蛋白。
【具體實施方式】
[0044]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0045]實施例1免疫沉淀(pulldown)技術(shù)篩選雞白痢沙門氏菌優(yōu)勢抗原
[0046]I平板凝集實驗
[0047]取10 μ L雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原滴于一塊干凈的玻片上，接著取10 μ L雞場采集的血清滴于該玻片上，上下顛倒進行充分混合，2min內(nèi)出現(xiàn)凝集顆粒，液體清亮判為陽性，不出現(xiàn)凝集顆粒則判為陰性，以SPF雞為陰性對照。分別鑒定出雞白痢陰、陽血清用于免疫沉淀。
[0048]2雞白痢陰、陽性血清純化IgG
[0049]2.1透析袋處理:取200ml溶液I (用蒸餾水配制，含2% (W/V)碳酸氫鈉、ImmolEDTA,氫氧化鈉調(diào)pH為8.0構(gòu)成)于燒杯中,將燒杯置于水浴鍋內(nèi)煮沸,接著將一定長度的透析袋放入溶液I中緩慢攪動，IOmin后取出燒杯自然冷卻，接著用蒸餾水徹底沖洗透析袋7-8次；下一步取200ml溶液II (蒸餾水配制ImmolEDTA，氫氧化鈉調(diào)pH為8.0)于燒杯中，操作同上。
[0050]2.2分別取經(jīng)過平板凝集實驗鑒定的雞白痢陰、陽性血清300 μ L加入2ml EP管，接著加入等體積300 μ L滅菌生理鹽水充分混勻。逐滴加入飽和硫酸銨溶液600 μ L使其飽和度達到50%，室溫放置30min，4°C、12000rpm，離心IOmin棄上清。加入Iml滅菌生理鹽水溶解沉淀，再次逐滴加入飽和硫酸銨溶液538 μ L使其飽和度達到35%，室溫放置30min，4°C、12000rpm，離心IOmin棄上清。加入Iml滅菌生理鹽水溶解沉淀，重復(fù)上述操作。最后離心20min,盡量棄掉上清。加入300 μ L滅菌生理鹽水溶解沉淀,裝入透析袋中，4°C透析24h，當(dāng)中換液數(shù)次、用1%氯化鋇溶液檢測透析效果。雞白痢陰、陽性血清純化IgG前后的蛋白質(zhì)分子量見圖1。
[0051]透析完畢測定IgG濃度，測定結(jié)果為25 μ g/μ L。之后取少量抗體，加入6 X SDS上樣緩沖液煮沸IOmin進行SDS-PAGE，檢測純化IgG純度。
[0052]檢測純化IgG純度是因為免疫沉淀要求用到的抗體具備良好的純度，雞場采集的血清含有很多非IgG成分，容易影響免疫沉淀的結(jié)果，通過SDS-PAGE可以清楚看到除了 IgG重輕鏈外，較少其他雜蛋白，達到免疫沉淀的要求。
[0053]3雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物的制備
[0054]取10 μ L雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株533甘油菌加入到5ml LB液體培養(yǎng)基活化過夜，接著全部轉(zhuǎn)入200ml LB液體培養(yǎng)基37°C振搖培養(yǎng)過夜，4°C、5000g/min離心5min收集菌體，用20ml滅菌PBS清洗菌體、離心棄上清。用IOml滅菌PBS重懸菌體，對收集的菌體進行超聲裂解，裂解條件為:4°C冰浴，槽溫40°C，間斷超聲，工作2s、間歇3s，共1800s，功率為35%。接著12000g/min，離心20min，棄沉淀、收集上清，測定蛋白濃度，測定結(jié)果為20 μ g/μ L，將雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物保存于_80°C用于免疫沉淀。
[0055]4免疫沉淀探尋雞白痢沙門氏菌蛋白抗原
[0056]4.1protein A/G beads 處理
[0057]取500 μ L25%protein A/G beads4°C、3000rpm 離心 3min 棄上清；加入 2M 鹽酸狐至lml4°C顛倒孵育30min-lh ；4°C>3000rpm離心3min棄上清；加入滅菌水500 μ L重懸beads, 4°C >3000rpm離心3min棄上清，重復(fù)該步驟3次。接著加入Lysis Buffer500 μ L重懸 beads, 4°C顛倒孵育 Ih ；4°C >3000rpm 離心 3min 棄上清；加入 Lysis Buffer500 μ L 重懸beads, 4°C >3000rpm離心3min棄上清，重復(fù)該步驟2次；最后加入Lysis Buffer500 μ L重懸beads,保存于4°C。
[0058]4.2beads、兔抗雞IgG、雞白痢陰陽性血清(純化后IgG)偶聯(lián)物制備
[0059]取50μ Lbeads、60y L兔抗雞IgG、200y L雞白痢陽性血清(純化后IgG)加入1.5mlEP管，之后加入690 μ L Lysis Buffer混勻，4°C顛倒孵育8h ;按相同操作取50 μ L beads、60 μ L兔抗雞IgG、200 μ L雞白痢陰性血清(純化后IgG)進行偶聯(lián)；同時取50 μ Lbeads、60 μ L兔抗雞IgG，4°C顛倒孵育4h偶聯(lián)作為對照。
[0060]4.3 免疫沉淀(pulldown)實驗
[0061]取雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物解凍，將990μ L上清轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，分為3管，其中每管加入10 μ L beads4°C顛倒孵育4h，4°C、3000rpm離心3min，將900 μ L上清轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中；分別將偶聯(lián)好的beads、兔抗雞IgG、雞白痢陽性血清(純化后IgG)復(fù)合物，beads、兔抗雞IgG、雞白痢陰性血清(純化后IgG)復(fù)合物，beads、兔抗雞IgG復(fù)合物加入到該EP管內(nèi)，并加入15 μ L蛋白酶抑制劑，4°C顛倒孵育8h。4°C、3000rpm離心3min，小心棄上清；向其中加入ImlLysis Buffer輕輕重懸復(fù)合物,4°C、3000rpm離心3min棄上清，如此重復(fù)洗滌4-6次。最后離心完全棄掉上清，加入40 μ LI X SDS上樣緩沖液煮沸l(wèi)Omin，之后12000rpm離心5min。同時取20 μ L雞白痢沙門氏菌抗原復(fù)合物、按1:20稀釋的雞白痢雞白痢陰、陽性血清(純化后IgG)分別加入6XSDS上樣緩沖液煮沸l(wèi)Omin。
[0062]4.4SDS-PAGE 電泳、染色、脫色
[0063]所有配方參考《分子克隆三》配制12%蛋白膠，電泳時將4.3煮過的樣品都分別加到一個孔內(nèi)，然后再加一個蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，開始以80V電壓進行電泳，當(dāng)樣品進入分離膠后調(diào)為160V電壓,直到IOkDa蛋白帶在膠最下緣時停止。值得注意的是pull down實驗后所有蛋白膠、染色、脫色溶液均應(yīng)使用超純水配制，在取膠、染色、脫色時均應(yīng)戴上一次性塑料手套和口罩，所有器皿用濃硫酸泡過，防止蛋白污染。
[0064]4.5目的蛋白切割及保存
[0065]Pull down實驗后通過SDS-PAGE染色、脫色發(fā)現(xiàn)有目的蛋白(見圖2A)，首先利用凝膠成像系統(tǒng)拍下照片，接著戴好手套、口罩，將蛋白膠用超純水洗滌兩遍，用新的手術(shù)刀片切下目的條帶，放到干凈的進口 1.5mlEP管內(nèi)。每條特異條帶放入一個EP管內(nèi)，之后裝到自封袋內(nèi)，做好標(biāo)記暫時凍存于_20°C。將目的蛋白條帶送到中國科學(xué)院生物物理所進行肽指紋圖譜分析(見圖2B)，將分析得到的數(shù)據(jù)放到數(shù)據(jù)庫進行比對，確定得到目的蛋白為GroEL蛋白。
[0066]實施例2雞白痢沙門氏菌GroEL原核表達載體的構(gòu)建
[0067]I雞白痢沙門氏菌全基因組的提取
[0068]取雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株533甘油菌10 μ L接種5mlLB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過夜。
[0069]按照細菌基因組DNA快速提取試劑盒說明操作:取2ml培養(yǎng)菌液，IOOOOrpm,離心30s，盡可能的吸棄上清，收集菌體。加入200 μ L緩沖液RB重懸，IOOOOrpm離心30s，棄上清。將細胞振蕩重懸于180 μ L緩沖液RB。加入20 μ L蛋白酶K (20mg/ml)，充分混勻，再加入200 μ L結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70°C放置lOmin。冷卻后加入100 μ L異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。將上一步混合物加入一個吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm離心30_60s，倒掉收集管中的廢液。加入500 μ L抑制物去除液IR，12000rpm離心30s，棄廢液。加入700 μ L漂洗液WB (加入無水乙醇)，12000rpm離心30s,棄掉廢液。加入500 μ L漂洗液WB, 12000rpm離心30s,棄掉廢液。將吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加60μ L洗脫緩沖液EB (洗脫緩沖液事先在65-70°C水浴中預(yù)熱)，室溫放置3-5min，12000rpm離心lmin。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min, 12000rpm離心lmin。
[0070]制備1%的瓊脂糖凝膠，取5 μ L DNA溶液與6 XDNA上樣緩沖液混合后上樣電泳，20min后觀察并記錄實驗結(jié)果(見圖3)。剩余DNA溶液存放_20°C。
[0071]2雞白痢沙門氏菌基因GroEL的克隆
[0072]根據(jù)GenBank上登陸的GroEL系列,用Primer5.0設(shè)計特異性引物擴增GroEL基因片段。
[0073]上游引物GroEL-F: 5’ -CGCggatcc ATGGCAGCTAAAGACGTA-3’，含 BamH I 酶切位點；
[0074]下游引物GroEL-R:5’-CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC-3’，含 Xho I 酶切位點。
[0075]以雞白痢沙門氏菌基因組為模板，建立50 μ L PCR反應(yīng)體系:
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測雞白痢沙門氏菌抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)含有雞白痢沙門氏菌抗原GroEL蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有:包被雞白痢沙門氏菌抗原的抗體檢測板，酶標(biāo)抗體，陽性對照為雞白痢陽性血清，陰性對照為雞白痢陰性血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述雞白痢沙門氏菌抗原GroEL蛋白為純化的雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL是由原核表達載體pET-28a-GroEL表達的，原核表達載體pET-28a_GroEL是由以下方法構(gòu)建而成的: O設(shè)計一對含有酶切位點的特異性引物:
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ； 2)利用上述特異性引物，以雞白痢沙門氏菌基因組為模板，擴增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性內(nèi)切酶 ，分別對PCR擴增產(chǎn)物和pET-28a原核表達載體進行酶切，用T4DNA連接酶將擴增片段的酶切產(chǎn)物連接到pET-28a酶切產(chǎn)物上，構(gòu)建pET-28a_GroEL載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)中，經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定，表明重組原核表達載體pET-28a-GroEL 構(gòu)建成功。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)設(shè)有:封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液和終止液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法為: 將待檢血清或者蛋黃液按I: 100比例經(jīng)PBS稀釋后加入抗體檢測板中，每孔100 μ L，并同時設(shè)立好陰、陽性對照，37°C作用I小時；接著PBST洗三遍；用PBS將辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體按1:5000稀釋，每孔100 μ L加入反應(yīng)板中，37°C作用30分鐘；接著PBST洗三遍；按每孔加入100 μ L顯色液，37°C作用約15分鐘后加入2M硫酸終止液終止反應(yīng)，最后通過酶標(biāo)儀檢測，陰性平均值+2.58SD為臨界值，大于臨界值判為陽性，反之為陰性。
8.—種表達雞白痢沙門氏菌重組蛋白GroEL的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體，其特征在于，所述載體為原核表達載體，是由以下方法構(gòu)建而成的: 1)設(shè)計一對含有酶切位點的特異性引物:
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH I ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC Xho I ； 2)利用上述特異性引物，以雞白痢沙門氏菌基因組為模板，擴增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性內(nèi)切酶，分別對PCR擴增產(chǎn)物和pET-28a原核表達載體進行酶切，用T4DNA連接酶將擴增片段的酶切產(chǎn)物連接到pET-28a酶切產(chǎn)物上，構(gòu)建pET-28a_GroEL載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)中，經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定，表明重組原核表達載體pET-28a-GroEL 構(gòu) 建成功。
【文檔編號】C12N15/70GK103995126SQ201410158723
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】鄭世軍, 徐志超, 李曉齊, 王永強, 曹紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)