一種血液培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種血液培養(yǎng)方法，其包括如下步驟：在離心管中加入溶血?jiǎng)?，密封離心管，管內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)；將通過(guò)無(wú)菌手段采集到的血液樣本注入離心管，在室溫狀態(tài)下震蕩離心管，充分混合血液樣本和溶血?jiǎng)?，使血?xì)胞裂解，血細(xì)胞內(nèi)的病原體釋放出來(lái)；以3k～15krpm的離心速度將離心管離心10～60分鐘，平穩(wěn)取出離心管；離心管內(nèi)的混合液呈現(xiàn)分離，形成上清液和沉淀濃縮液；提取出離心管內(nèi)的沉淀濃縮液；將沉淀濃縮液接種至瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行孵育培養(yǎng)檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢。本方法流程簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)時(shí)間短、成本低且陽(yáng)性檢出率高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種血液培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種血液培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)行的血液培養(yǎng)是將新鮮離體的血液標(biāo)本接種至營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，在一定溫度、濕度等條件下，使對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，從而檢出病原菌的一種人工培養(yǎng)法。該培養(yǎng)法常用于菌血癥、敗血癥及膿毒敗血癥的病因?qū)W診斷。
[0003]傳統(tǒng)的血液培養(yǎng)過(guò)程:采集患者血液標(biāo)本，注入血液培養(yǎng)瓶，瓶中有幾十毫升的液體肉湯培養(yǎng)基。如果在五天之內(nèi)肉湯血培養(yǎng)呈陽(yáng)性，則需要抽出菌液，接種至適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基上，再繼續(xù)孵育，獲得菌落方可進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)；如果肉湯血培養(yǎng)呈陰性，則在第五天時(shí)需要抽出菌液，接種至適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基，再繼續(xù)孵育，即為“盲轉(zhuǎn)”。該傳統(tǒng)方法中存在如下缺陷:
(1)血液標(biāo)本注入肉湯培養(yǎng)基中后，患者血液中存在的免疫因子和可能存在的抗生素均對(duì)血液中的病原體有抑制作用，從而影響陽(yáng)性檢出結(jié)果的準(zhǔn)確性； (2)血液標(biāo)本中血細(xì)胞完整，細(xì)胞內(nèi)的病原體受限于細(xì)胞膜,難以培養(yǎng)檢出，敏感性和特異性都會(huì)受到影響，從而影響陽(yáng)性檢出率；
(3)血液標(biāo)本先在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不論其結(jié)果是否陽(yáng)性，均需要抽出接種至固相的瓊脂培養(yǎng)基，檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，并且如果血液中的病原菌為真菌，單單液相的肉湯培養(yǎng)基孵育則容易出現(xiàn)假陰性而漏檢；
(4)用于血液培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)基比較貴，有效期較短，一般最多一年；特別是血培養(yǎng)儀器，動(dòng)輒幾十上百萬(wàn)，一般中小醫(yī)院、邊遠(yuǎn)地區(qū)的衛(wèi)生所難以承受；
(5)采集患者血液標(biāo)本后，一般采用離心管提取一定量的血液注入血液培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，通常是采用抽采器具從離心管中抽出一定量的血液，而血液培養(yǎng)的培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)無(wú)菌環(huán)境的要求很高，而抽采器具容易污染血液標(biāo)本，引入細(xì)菌等，造成檢驗(yàn)干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種流程簡(jiǎn)單、檢驗(yàn)時(shí)間短、成本低且陽(yáng)性檢出率高的血液培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明的血液培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
a.在離心管中加入溶血?jiǎng)?，密封離心管，管內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)；
b.通過(guò)無(wú)菌手段采集血液樣本注入離心管，在室溫狀態(tài)下震蕩離心管，充分混合血液樣本和溶血?jiǎng)?，使血?xì)胞裂解，血細(xì)胞內(nèi)的病原體釋放到血細(xì)胞外；
c.以3k~15krpm的離心速度將離心管離心10~60分鐘，平穩(wěn)取出離心管；
d.離心管內(nèi)的混合液呈現(xiàn)分離，形成上清液和沉淀濃縮液；
e.提取出離心管內(nèi)的沉淀濃縮液；
f.將沉淀濃縮液接種至瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行孵育培養(yǎng)檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢。[0006]進(jìn)一步地，所述離心管從上至下依次為上管、中管和收集管，所述中管與上管、收集管可拆卸式連接，所述上管兩端開(kāi)口且上端開(kāi)口設(shè)有密封蓋組件，所述中管兩端開(kāi)口且內(nèi)設(shè)隔離閥，所述收集管的上端開(kāi)口且下端為圓弧底面；步驟b中血液樣本的注入量以使步驟d中的沉淀濃縮液填充滿(mǎn)隔離閥以下的管內(nèi)容積為準(zhǔn)；步驟e中提取沉淀濃縮液的過(guò)程為:先關(guān)閉隔離閥，再使收集管脫離，收集管內(nèi)的溶液即為沉淀濃縮液。
[0007]本方案具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)血細(xì)胞在孵育培養(yǎng)前被裂解，細(xì)胞內(nèi)隱藏的病原體被釋放出來(lái)，提高了病原體的濃度，使檢驗(yàn)的敏感性和特異性得以提聞，進(jìn)而提聞了陽(yáng)性檢出率；
(2)離心處理去除包含大部分抗生素和免疫因子的上清液，起到濃縮血液標(biāo)本中有效成分的作用，提高了陽(yáng)性檢出率；
(3)省去了肉湯培養(yǎng)基及其培養(yǎng)過(guò)程，直接將裂解離心濃縮后的血液標(biāo)本接種到瓊脂培養(yǎng)基上，為臨床診治節(jié)約時(shí)間，克服了微生物學(xué)檢驗(yàn)慢的短板； (4)不需要肉湯培養(yǎng)基及相關(guān)昂貴、笨重的血培養(yǎng)儀器，避免安裝、運(yùn)輸和使用所需的苛刻條件，不必?fù)?dān)心培養(yǎng)基有效期限的問(wèn)題，且只需要室溫儲(chǔ)存，僅用到離心管和普通的離心機(jī)即可，輕便且成本低，適用于小醫(yī)院、衛(wèi)生所、軍隊(duì)?wèi)?zhàn)地醫(yī)院。
[0008]并且，本案中的離心管采用隔離閥來(lái)阻截上清液和沉淀濃縮液，使得在提取沉淀濃縮液時(shí)，避免了采用抽采器具影響操作效率和污染沉淀物的問(wèn)題，做到了無(wú)污染，保證陽(yáng)性檢出率的準(zhǔn)確性。離心管的上管、中管和收集管的可拆卸式結(jié)構(gòu)，在提取沉淀濃縮液時(shí)便捷，簡(jiǎn)化了操作流程，保證了沉淀濃縮液的質(zhì)量。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為本發(fā)明實(shí)施例二中的離心管倒置時(shí)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)圖；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例三中的離心管的結(jié)構(gòu)圖。
[0010]附圖標(biāo)記說(shuō)明:1一上管；2—收集管；3—隔離閥；7—密封蓋組件；11一中管；31—閥體開(kāi)關(guān)；32—鋼珠；33—支架；34—鋼珠座。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0012]實(shí)施例一
a.在離心管中加入與血液標(biāo)本的體積比為1:5的溶血?jiǎng)?，通過(guò)離心管上端的密封蓋組件密封離心管，再對(duì)管內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)；或先將離心管和溶血?jiǎng)┓謩e滅菌，再將溶血?jiǎng)┘尤氲揭咽菬o(wú)菌狀態(tài)的離心管中，再密封；
b.將通過(guò)無(wú)菌手段采集到的血液樣本注入離心管，在室溫狀態(tài)下稍稍用力震蕩離心管十來(lái)下，即可充分混合血液樣本和溶血?jiǎng)寡?xì)胞裂解，使得血細(xì)胞內(nèi)藏匿的細(xì)菌釋放出來(lái)；
c.以3krpm的離心速度將離心管離心30分鐘，平穩(wěn)取出離心管，勿振搖；
d.等待離心管內(nèi)的混合液呈現(xiàn)分離，形成上清液和沉淀濃縮液；
e.采用抽采器具抽掉上清液，換新的抽采器具提取出離心管內(nèi)的沉淀濃縮液，抽采器具使用前進(jìn)行消毒滅菌處理；f.用接種環(huán)或拭子即可輕易蘸取沉淀濃縮液直接劃線接種于各種適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基上進(jìn)行孵育培養(yǎng)檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢。
[0013]實(shí)施例二
a.準(zhǔn)備特制的離心管，離心管由上管1、中管11和收集管2可拆卸式組裝而成，所述上管I兩端開(kāi)口且上端開(kāi)口設(shè)有密封蓋組件7，所述中管11兩端開(kāi)口且內(nèi)設(shè)鋼珠式單向隔離閥3，離心管直立時(shí)，鋼珠32置于支架33上，閥門(mén)打開(kāi)；離心管倒置時(shí)，如圖1所示，鋼珠32脫離支架33，鋼珠32堵住鋼珠座34的通道，閥門(mén)關(guān)閉，所述收集管2的上端開(kāi)口且下端為圓弧底面；加入與血液標(biāo)本的體積比為1:20的溶血?jiǎng)?，密封離心管，管內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)；
b.血液樣本的注入量以使步驟d中的沉淀濃縮液填充滿(mǎn)隔離閥以下的管內(nèi)容積為準(zhǔn)，其余與實(shí)施例一中的步驟b相同；
c.以IOkrpm的離心速度將離心管離心10分鐘，平穩(wěn)取出離心管，勿振搖；
d.與實(shí)施例一中的步驟d相同；
e.倒置離心管，閥門(mén)呈關(guān)閉狀態(tài)，使上管I脫離；再將收集管2直立，閥門(mén)呈打開(kāi)狀態(tài)，擰下中管11，收集管2與中管11脫離，得到沉淀濃縮液；
f.與實(shí)施例一中的步驟f相同。
[0014]實(shí)施例三
a.準(zhǔn)備特制的離心管，如圖2所示，離心管由上管1、中管11和收集管2可拆卸式組裝而成，所述上管I兩端開(kāi)口且上端開(kāi)口設(shè)有密封蓋組件7，所述中管11兩端開(kāi)口且內(nèi)設(shè)帶閥體開(kāi)關(guān)31的截?cái)囝?lèi)隔離閥3，閥體開(kāi)關(guān)31設(shè)于管外，通過(guò)閥體開(kāi)關(guān)31控制閥門(mén)的通斷，所述收集管2的上端開(kāi)口且下端為圓弧底面；加入與血液標(biāo)本的體積比為1:10的溶血?jiǎng)?，密封離心管，管內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)；
b.與實(shí)施例二中的步驟b相同；
c.以15krpm的離心速度將離心管離心60分鐘，平穩(wěn)取出離心管，勿振搖；
d.與實(shí)施例一中的步驟d相同；
e.保持離心管直立狀態(tài)，通過(guò)閥體開(kāi)關(guān)31關(guān)閉閥門(mén)，直接擰下收集管2，得到沉淀濃縮
液；
f.與實(shí)施例一中的步驟f相同。
[0015]上述實(shí)施例一采用的是普通離心管，在提取沉淀濃縮液的過(guò)程中應(yīng)注意抽采器具等的無(wú)菌處理，應(yīng)避免污染，以免導(dǎo)致檢測(cè)無(wú)效。而實(shí)施例二和實(shí)施例三無(wú)抽采器具的引入，更容易做到無(wú)污染，保證整個(gè)過(guò)程的無(wú)菌狀態(tài)，無(wú)需采取繁瑣的步驟措施來(lái)預(yù)防污染，提高了工作效率，為臨床診斷爭(zhēng)取了寶貴時(shí)間。因此，在實(shí)施中，優(yōu)選的采用實(shí)施例二和三的方式來(lái)進(jìn)行血液培養(yǎng)。
[0016]以下是本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的比較和分析，統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)性，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0017](I)材料和方法
以梅里埃的血液培養(yǎng)儀器及其血培養(yǎng)瓶設(shè)為對(duì)照組，采集臨床有感染指征患者的血液做血液培養(yǎng)。以本發(fā)明的新方法作為測(cè)試組，二者配對(duì)做比對(duì)試驗(yàn)。
[0018]記錄和結(jié)果對(duì)照組標(biāo)本和測(cè)試組培養(yǎng)例數(shù)均為227例，其中，對(duì)照組陽(yáng)性27例(陽(yáng)性檢出率為
11.89%)，測(cè)試組陽(yáng)性34例(陽(yáng)性檢出率為14.98%)。[0019]分析評(píng)價(jià)
兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，卡方檢驗(yàn)=2.0489, P < 0.05，拒絕HO，相差顯著。僅僅從陽(yáng)性率來(lái)看，本發(fā)明的新方法結(jié)果優(yōu)于現(xiàn)有方法的進(jìn)口設(shè)備及其血培養(yǎng)瓶得出的結(jié)果。造成這種結(jié)果的原因可能是:a臨床患者在抽血時(shí)機(jī)往往不是最佳時(shí)機(jī)，而是之前就使用了抗生素，也即是血液中有較高的抗生素濃度，而新方法因離心濃縮去除了大多數(shù)抗生素，減弱了抗生素對(duì)病原體的抑制作用，濃縮后待檢樣本中病原體的濃度提高，進(jìn)而提高了陽(yáng)性檢驗(yàn)的敏感性和特異性；b本方法裂解了血細(xì)胞，釋放出了細(xì)胞中的病原體，提高了病原體濃度，從而使得檢出率提聞。
【權(quán)利要求】
1.一種血液培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: a.在離心管中加入溶血?jiǎng)?，密封離心管，管內(nèi)進(jìn)行消毒滅菌達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)； b.通過(guò)無(wú)菌手段采集血液樣本注入離心管，在室溫狀態(tài)下震蕩離心管，充分混合血液樣本和溶血?jiǎng)?，使血?xì)胞裂解，血細(xì)胞內(nèi)的病原體釋放到血細(xì)胞外； c.以3k~15krpm的離心速度將離心管離心10~60分鐘，平穩(wěn)取出離心管； d.離心管內(nèi)的混合液呈現(xiàn)分離，形成上清液和沉淀濃縮液； e.提取出離心管內(nèi)的沉淀濃縮液； f.將沉淀濃縮液接種至瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行孵育培養(yǎng)檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行涂片染色鏡檢。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液培養(yǎng)方法，其特征在于:所述離心管從上至下依次為上管、中管和收集管，所述中管與上管、收集管可拆卸式連接，所述上管兩端開(kāi)口且上端開(kāi)口設(shè)有密封蓋組件，所述中管兩端開(kāi)口且內(nèi)設(shè)隔離閥，所述收集管的上端開(kāi)口且下端為圓弧底面； 步驟b中血液樣本的注入量以使步驟d中的沉淀濃縮液填充滿(mǎn)隔離閥以下的管內(nèi)容積為準(zhǔn)； 步驟e中提取沉淀濃縮液的過(guò)程為:先關(guān)閉隔離閥，再使收集管脫離，收集管內(nèi)的溶液即為沉淀濃縮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血液培養(yǎng)方法，其特征在于:所述隔離閥為鋼珠式單向閥門(mén)，步驟e中提取沉淀濃縮液的過(guò)程為:倒置離心管，隔離閥自動(dòng)關(guān)閉，使上管脫離，再將收集管直立，隔離閥自動(dòng)打開(kāi)，擰下中管，收集管與中管脫離，得到沉淀濃縮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血液培養(yǎng)方法，其特征在于:所述隔離閥為帶閥體開(kāi)關(guān)的截?cái)囝?lèi)閥門(mén)，步驟e中提取沉淀濃縮液的過(guò)程為:保持離心管直立狀態(tài)，通過(guò)閥體開(kāi)關(guān)關(guān)閉隔離閥，直接擰下收集管 ，得到沉淀濃縮液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/24GK103898192SQ201410165196
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】徐永濤 申請(qǐng)人:重慶龐通醫(yī)療器械有限公司