一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案要點為：一株連香樹紅球菌Rhodococcuscercidiphylli，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCCNo.9067。本發(fā)明還公開了該連香樹紅球菌的篩選方法及其在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明中連香樹紅球菌菌株的篩選方法操作簡單、快速，可用于被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中，降解去除亞硝胺類物質(zhì)，對亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水進(jìn)行生物處理，降低其健康安全風(fēng)險水平。
【專利說明】一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于飲用水中亞硝胺類物質(zhì)的微生物降解【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]飲用水消毒在保證生物安全性的同時，也產(chǎn)生一系列對人體危害的消毒副產(chǎn)物。在該過程中產(chǎn)生的亞硝胺類物質(zhì)(NitiOsamines)消毒副產(chǎn)物，由于具有致癌、致畸和致突變的作用，而且毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常見的的鹵代消毒副產(chǎn)物(三鹵甲烷和鹵乙酸等)，因此引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注，已經(jīng)成為環(huán)境和健康研究領(lǐng)域的熱點問題。根據(jù)美國環(huán)保局(USEPA)的污染物風(fēng)險信息數(shù)據(jù)庫(Integrated Risk Information System, IRIS))和標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險評估方法外推得到10_6致癌風(fēng)險水平上飲用水中多種亞硝胺類物質(zhì)的閾值濃度低于20ng/L，美國EPA將其中6種物質(zhì)列入非控制性污染物檢測名單2 (UCMR 2)，并作為2008-2010年監(jiān)測的重點。
[0003]在飲用水生產(chǎn)過 程中，國內(nèi)外普遍采用預(yù)氧化技術(shù)降低后續(xù)處理單元的負(fù)荷，導(dǎo)致亞硝胺類物質(zhì)提前產(chǎn)生。由于此類物質(zhì)屬于高極性小分子有機物，因而水處理普遍采用的沙濾及活性炭過濾對其處理效果并不明顯。目前針對亞硝胺類物質(zhì)(主要是NDMA)有效的消減控制方面的研究主要有紫外及高級氧化技術(shù)(UV/H202，03/H202等)。但不同的處理方法存在處理水量相對較小、在后續(xù)的消毒單元中容易重新生成亞硝胺類物質(zhì)、經(jīng)濟成本過高及產(chǎn)生二次污染等問題。
[0004]與化學(xué)氧化及其它常規(guī)水處理方法相比，微生物處理法可以實現(xiàn)對特定污染物的定向去除，具有效果好、處理成本低、操作簡便、不添加任何外來化學(xué)物質(zhì)和避免化學(xué)處理引起的二次污染等特點，因此往往是污染物去除的首選技術(shù)。研究表明，大部分亞硝胺類物質(zhì)是可以生物降解的，可通過二次基質(zhì)代謝的途徑實現(xiàn)降解。到目前為止，針對亞硝胺類物質(zhì)的生物處理研究，國內(nèi)外未見在地下水或飲用水過濾單元中篩選出有效的降解菌株。因此，篩選針對亞硝胺類物質(zhì)的有效降解菌株并進(jìn)行降解效果評價是生物處理技術(shù)的首要任務(wù)。為此，從自然界中篩選出對亞硝胺類物質(zhì)有高效降解能力的菌株，應(yīng)用于飲用水中亞硝胺類物質(zhì)的去除將具有實際的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一株連香樹紅球菌及其篩選方法和應(yīng)用，該連香樹紅球菌菌株是從實際運行的飲用水處理工藝中篩選得到的，其能夠有效地降解多種亞硝胺類物質(zhì)，并且該菌株能夠有效降解飲用水氯胺消毒過程中出現(xiàn)的亞硝胺消毒副產(chǎn)物和被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)，在飲用水凈化處理方面具有良好的應(yīng)用前
旦
-5^ O
[0006]本發(fā)明提供的連香樹紅球菌iRhodococcus cercidiphylli )，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為:CGMCC N0.9067，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期:2014年04月16日。
[0007]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于包括以下步驟:(1)馴化富集培養(yǎng)，在生物活性炭流動馴化處理裝置的馴化柱中填充活性炭，該活性炭為飲用水處理廠連續(xù)運營三年以上的生物活性炭，飲用水處理廠的工藝依次為預(yù)氯化、混凝沉淀、生物活性炭濾池和氯消毒，生物活性炭流動馴化處理裝置的進(jìn)水為飲用水處理廠生物活性炭濾池出水，并在生物活性炭濾池出水中加入亞硝胺類物質(zhì)調(diào)節(jié)進(jìn)水的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為10μ g/L，COD含量為1.0mg/L，用蠕動泵使進(jìn)水在生物活性炭流動馴化處理裝置中循環(huán)流動，保持水力停留時間為20min，進(jìn)水經(jīng)過活性炭吸附柱進(jìn)行吸附和微生物降解處理，其中活性炭吸附柱的流速為10mL/min,活性炭吸附柱的總?cè)莘e為500mL,該生物活性炭流動馴化處理裝置于25°C連續(xù)運行2個月；(2)分離純化培養(yǎng)，采集生物活性炭流動馴化處理裝置中的活性炭與磷酸鹽緩沖液混合，制得菌懸液接種到液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，其中磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液，pH=7.3，液體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下傳代培養(yǎng)3次，傳代培養(yǎng)時間為15天/次，所述液體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，其余成分為超純水，液體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min，將富集培養(yǎng)物接種于固體富集培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，其中固體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，溫度為25°C，培養(yǎng)時間為2-3天/次，所述固體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，瓊脂20，其成分為超純水，固體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min ;(3)選擇性培養(yǎng)，將步驟(2)分離純化得到的純培養(yǎng)物接種到選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，直到得到具有對亞硝胺類物質(zhì)具有降解能力的連香樹紅球菌，其中選擇性培養(yǎng)基為礦物鹽培養(yǎng)基，其成分以g/L計為:K2HPO4.3H20 4.25，NaH2PO4.H2O 1.00，MgSO4.7H20 0.20，F(xiàn)eSO4.7H20 0.012，MnSO4.H2O
0.003，ZnSO4.7H20 0.003，CoSO4.7H20 0.001, NH4Cl 2.0，其余成分為超純水，pH=7.3，培養(yǎng)溫度為20-30°C，該礦 物鹽培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min。
[0008]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌的篩選方法中，所述的步驟(1)中磷酸鹽緩沖液的配置方法為:在800mL超純水中加入8g NaCl, 0.2g KC1，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.3，加水定容至lOOOmL，在121°C溫度下恒溫滅菌20min后于室溫保存，備用。
[0009]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌的篩選方法中，所述的步驟(3)中選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25°C。
[0010]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，主要通過以下方式實現(xiàn):(I)連香樹紅球菌濕細(xì)胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°c培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細(xì)胞；(2)取連香樹紅球菌濕細(xì)胞接種于含有亞硝胺類物質(zhì)的礦物鹽培養(yǎng)基中，在避光條件下于25°C對礦物鹽培養(yǎng)基中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行降解，其中每IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基中接種0.6g連香樹紅球菌濕細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明所述的亞硝胺類物質(zhì)為亞硝基二甲胺(NDMA)、亞硝基二乙胺(NDEA)、亞硝基二丙胺(NDPA)、亞硝基吡咯烷(Npyr)和亞硝基二丁胺(NDBA)中的一種或多種。
[0012]本發(fā)明所述的連香樹紅球菌在降解飲用水中亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，主要通過以下方式實現(xiàn):(I)連香樹紅球菌濕細(xì)胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°c培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細(xì)胞；(2)取連香樹紅球菌濕細(xì)胞接種于飲用水中，在避光條件下于25°C對飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行降解，其中每IOOmL飲用水中接種0.6g連香樹紅球菌濕細(xì)胞，并且飲用水在接種連香樹紅球菌濕細(xì)胞之前用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)飲用水的pH=7.3。
[0013]將篩選的連香樹紅球菌進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定，所述遺傳學(xué)鑒定為提取菌株的DNA，進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果提交NCBI基因文庫進(jìn)行比對。
[0014]本發(fā)明涉及的連香樹紅球菌菌株具有以下特征:
1、連香樹紅球菌菌株適宜在中性偏堿性(PH7-8)的培養(yǎng)介質(zhì)中生長，適合的生長溫度為25°C左右，其細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為細(xì)胞呈扁平橢圓狀，大小為2.5-5.0ymX0.5-2.0ym,屬革蘭氏陽性，不生芽孢，無鞭毛；
2、連香樹紅球菌菌株在固體富集培養(yǎng)基的瓊脂平板上的菌落形態(tài)一致，培養(yǎng)3天的菌落中間呈淡紅黃色，濕潤，圓形，凸起，不透明，邊緣較為整齊；
3、16SrRNA基因序列特征為:連香樹紅球菌菌株的16S rRNA序列長度為1201bp。
[0015]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明中連香樹紅球菌菌株的篩選方法操作簡單、快速；
2、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌對亞硝胺類物質(zhì)具有較好的降解效果，特別是對于飲用水中痕量濃度(濃度為200ng/L)的亞硝胺類物質(zhì)在短時間內(nèi)的降解去除率范圍為38-80% ；
3、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌用于處理飲用水中經(jīng)預(yù)氯化提前生成的亞硝胺類物質(zhì)，能有效降解NDMA，Npyr, NDEA, NDPA和NDBA 5種亞硝胺類物質(zhì)，提高飲用水的安全性；
4、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌可用于被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中，降解去除亞硝胺類物質(zhì)，對亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水進(jìn)行生物處理，降低其健康安全風(fēng)險水平；
5、本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌菌株可投加于生物活性炭工藝單元，作為對亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行生物降解的深度強化處理手段，方法簡單，運行及維護(hù)成本較低，在規(guī)?；幚韥喯醢奉愇镔|(zhì)中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明篩選的連香樹紅球菌在培養(yǎng)基上的菌落圖，圖2是本發(fā)明連香樹紅球菌菌株的細(xì)胞形態(tài)圖，圖3是本發(fā)明實施例3中連香樹紅球菌對礦物鹽培養(yǎng)基中5種亞硝胺類物質(zhì)降解的質(zhì)量濃度變化曲線，圖4是本發(fā)明實施例3中連香樹紅球菌對被亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中5種亞硝胺類物質(zhì)降解的質(zhì)量濃度變化曲線。
【具體實施方式】
[0017]以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0018]實施例1菌株的分離與純化 1、培養(yǎng)基的制備(I)礦物鹽培養(yǎng)基
K2HPO4.3Η20:4.25.00g，NaH2PO4.H2O:1.00g，MgSO4.7H20:0.20g，F(xiàn)eSO4.7H20:0.012g,MnSO4.H2O:0.003g，ZnSO4.7H20:0.003g，CoSO4.7H20:0.0OlgjNH4Cl 2.0g，超純水 lOOOmL,
pH=7.3，礦物鹽培養(yǎng)基在121°C下恒溫滅菌20分鐘。
[0019](2)固體富集培養(yǎng)基
Tryptonye Soya Broth (Oxoid LTD, England) 30g,瓊脂 20g,超純水 1000mL,固體富集培養(yǎng)基使用前在121°C下恒溫滅菌20分鐘。
[0020]2、馴化富集培養(yǎng)
在生物活性炭流動馴化處理裝置進(jìn)行微生物馴化富集培養(yǎng)，該馴化處理裝置中用水取自飲用水處理廠生物活性炭濾池出水，在水中加入NDMA，Npyr, NDEA, NDPA和NDBA5種亞硝胺物質(zhì)，活性炭為飲用水處理廠運營三年以上的生物活性炭。在馴化柱中填充活性炭，用蠕動泵使進(jìn)水在馴化處理裝置中循環(huán)流動，保持水力停留時間20min，水流經(jīng)活性炭吸附柱，進(jìn)行吸附和生物降解處理，其中馴化處理裝置在常溫(25°C)條件下連續(xù)運行2個月，活性炭吸附柱的流速為10mL/min，生物活性碳吸附柱的總?cè)莘e為500mL，進(jìn)水的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為10 μ g/L, COD含量為1.0mg/L。
[0021]稱取采集于生物活性炭流動馴化處理裝置中的生物活性炭10g，放入250mL三角瓶中，加入50mL磷酸鹽緩沖液，并加適量玻璃珠，置于振蕩器快速震蕩4-5h。所得到的生物膜懸液為附著生物膜懸液，取5mL所得生物膜懸液，接種于事先滅菌的250mL亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1.0 μ g/L的礦物鹽培養(yǎng)基中，25°C避光培養(yǎng)7天，獲得第一代培養(yǎng)液，共傳代3次。
[0022]3、分離純化培養(yǎng)
將第三代培養(yǎng)液稀釋IO6倍后接種于固體富集培養(yǎng)基平板，放入恒溫培養(yǎng)箱中于25°C下培養(yǎng)3天。挑取平板上形成的單個菌落，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，進(jìn)行分離培養(yǎng)，于25°C下培養(yǎng)3天后對平板培養(yǎng)物進(jìn)行顯微鏡檢查，如果獲得的培養(yǎng)物菌種不純，則按上述方法挑取平板培養(yǎng)物劃線接種于平板分離、純化培養(yǎng)基中繼續(xù)純化，直到顯微鏡檢查結(jié)果表明為純菌為止，經(jīng)純化得到純連香樹紅球菌菌株。
[0023]實施例2連香樹紅球菌菌株的微生物學(xué)特性研究 1、菌落形態(tài)觀察
將分離純化培養(yǎng)得到的連香樹紅球菌單胞菌株劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，于25°C下培養(yǎng)至長出菌落，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如下表明菌株的菌落特征為:在固體富集培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3天的菌落直徑大小約為l_2mm，菌落呈圓形，凸起，不透明，中心呈淡紅黃色，邊緣整齊，如圖1所示。
[0024]2、細(xì)胞形態(tài)觀察
挑取在固體富集培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸鹽緩沖液(PH7.3)漂洗、梯度乙醇脫水、醋酸異戊酯處理以及二氧化碳臨界點干燥、噴金、將樣品放入觀察室后進(jìn)行電鏡掃描，電鏡掃描結(jié)果如圖2，表明連香樹紅球菌呈扁橢圓狀，不生芽孢，無鞭毛，大小為 2.5-5.0umX0.5-2.0 μ m。
[0025]3、16S rRNA基因序列測定
將接種于液體富集培養(yǎng)基中的單胞菌株于25°C，ISOrpm培養(yǎng)3天后的單胞菌細(xì)胞收集后米用 DNA 提取試劑盒(FastDNA SPIN kit, Takara Biotechnology C0., Ltd.,Japanese)，提取單胞菌的DNA，送測序公司，進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI基因文庫(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行比對。其中，菌株的 16S rRNA (SEQ IDN0.1)序列長度為1210bp。
[0026]根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征，細(xì)胞形態(tài)特征以及其16S rRNA基因序列的比對結(jié)果，鑒定菌株屬于連香樹紅球菌Rhodococcus cercidiphylli。
[0027]實施例3連香樹紅球菌的應(yīng)用
1、制備連香樹紅球菌單胞菌單胞菌株的濕細(xì)胞
用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基上，25°C溫度下，培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮連香樹紅球菌濕細(xì)胞。
[0028]2、去除5種亞硝胺物質(zhì)試驗
挑取菌種連香樹紅球菌的濕細(xì)胞接種于礦物鹽培養(yǎng)基中，在避光條件下，于25°C進(jìn)行培養(yǎng)，其中，每IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基中接種0.6g濕細(xì)胞；礦物鹽培養(yǎng)基中的5種亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為200ng/L，檢測方法根據(jù)前期研究，采用超高液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)測定，測定接種前培養(yǎng)基和接種后第I天、3天、5天、7天、10天的礦物鹽培養(yǎng)基中5種亞硝胺類物 質(zhì)的質(zhì)量濃度值，測定結(jié)果如圖3所示。
[0029]連香樹紅球菌除了將接種的濕細(xì)胞后立即進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，即在121°C高壓下蒸汽滅菌20分鐘，使接種的連香樹紅球菌立即滅活之外，得到無生物活性的對照組，其余條件相同，測定接種前培養(yǎng)基和接種后第I天、3天、5天、7天、10天的相應(yīng)礦物鹽培養(yǎng)基中亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度。
[0030]測定結(jié)果表明:扣除空白對照，本發(fā)明中篩選的連香樹紅球菌對5種亞硝胺類物質(zhì)具有很好的降解效果，去除效率高，在接種量為0.6g連香樹紅球菌濕細(xì)胞/IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基時，接種10天后飲用水中NDMA，NDEA, NDPA, Npyr和NDBA濃度分別降低至14.6%，52.3%，21.2%，51.5%和62%，說明連香樹紅球菌對5種亞硝胺類物質(zhì)的去除率分別為85.4%，47.7%, 78.8%, 48.5%和38%，進(jìn)而表明礦物鹽培養(yǎng)基中亞硝胺類物質(zhì)的變化是由連香樹紅球菌引起的，且降解亞硝胺類物質(zhì)效率高，因此，連香樹紅球菌能夠有效地去除亞硝胺類物質(zhì)，可用于亞硝胺類物質(zhì)的降解。
[0031]3、去除亞硝胺類物質(zhì)污染的飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)試驗
1)用接種環(huán)取連香樹紅球菌菌株的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基上，于25°C溫度下，培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細(xì)胞，備用；
2)將加入磷酸鹽緩沖液的飲用水高壓滅菌處理，飲用水的pH=7.3 ；
3)向飲用水中加入5種亞硝胺類物質(zhì)，使飲用水中每種亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為200ng/L ；
4)取滅菌后的飲用水500mL置于500mL棕色瓶中，接種連香樹紅球菌濕細(xì)胞，密封后在避光條件下，于25°C溫度下培養(yǎng)，每隔Ih震蕩lmin，降解飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)，接種量為每IOOmL的飲用水中加入0.6 g連香樹紅球菌濕細(xì)胞；
5)檢測方法根據(jù)前期研究，采用超高液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)測定接種后第I天、3天、5天、7天、10天的飲用水中亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，測定結(jié)果如圖4所示。[0032]測定結(jié)果顯示:在接種連香樹紅球菌之后，連香樹紅球菌從第三天開始顯著降解5種亞硝胺類物質(zhì)，飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度迅速下降，接種10天后飲用水中NDMA, NDEA, NDPA, Npyr和NDBA等5種亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別降低至25.6%，65.4%，
32.9%, 64.5%和69.3%，說明連香樹紅球菌對5種亞硝胺類物質(zhì)的降解率分別為74.4%，34.6%, 67.1%, 35.5%和30.7%，進(jìn)而表明連香樹紅球菌對飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)具有較高的降解率。
[0033] 以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一株連香樹紅球菌Rhodococcus cercidiphylli,保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.9067。
2.—種權(quán)利要求1所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于包括以下步驟:(1)馴化富集培養(yǎng)，在生物活性炭流動馴化處理裝置的馴化柱中填充活性炭，該活性炭為飲用水處理廠連續(xù)運營三年以上的生物活性炭，飲用水處理廠的工藝依次為預(yù)氯化、混凝沉淀、生物活性炭濾池和氯消毒，生物活性炭流動馴化處理裝置的進(jìn)水為飲用水處理廠生物活性炭濾池出水,并在生物活性炭濾池出水中加入亞硝胺類物質(zhì)調(diào)節(jié)進(jìn)水的亞硝胺類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為lOyg/L，COD含量為1.0mg/L，用蠕動泵使進(jìn)水在生物活性炭流動馴化處理裝置中循環(huán)流動，保持水力停留時間為20min，進(jìn)水經(jīng)過活性炭吸附柱進(jìn)行吸附和微生物降解處理，其中活性炭吸附柱的流速為10mL/min，活性炭吸附柱的總?cè)莘e為500mL，該生物活性炭流動馴化處理裝置于25°C連續(xù)運行2個月；(2)分離純化培養(yǎng)，采集生物活性炭流動馴化處理裝置中的活性炭與磷酸鹽緩沖液混合，制得菌懸液接種到液體富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，其中磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液，pH=7.3，液體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，在溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下傳代培養(yǎng)3次，傳代培養(yǎng)時間為15天/次，所述液體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，其余成分為超純水，液體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min，將富集培養(yǎng)物接種于固體富集培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，其中固體富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)是避光條件，溫度為25°C，培養(yǎng)時間為2-3天/次，所述固體富集培養(yǎng)基的成分以g/L計為:蛋白胨30，瓊脂20，其成分為超純水，固體富集培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min ；(3)選擇性培養(yǎng)，將步驟(2)分離純化得到的純培養(yǎng)物接種到選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，直到得到具有對亞硝胺類物質(zhì)具有降解能力的連香樹紅球菌，其中選擇性培養(yǎng)基為礦物鹽培養(yǎng)基，其成分以g/L計為:K2HPO4.3H20 4.25，NaH2PO4.H2O 1.00，MgSO4.7H20 0.20，F(xiàn)eSO4.7H20 0.012，MnSO4.H2O0.003，ZnSO4.7H20 0.003，CoSO4.7H20 0.001, NH4Cl 2.0，其余成分為超純水，pH=7.3，培養(yǎng)溫度為20-30°C，該礦物鹽培養(yǎng)基使用前于121°C溫度下恒溫滅菌20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于:所述的步驟(1)中磷酸鹽緩沖液的配置方法為:在800mL超純水中加入8g NaCl, 0.2g KC1，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.3，加水定容至lOOOmL，在121°C溫度下恒溫滅菌20min后于室溫保存，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于:所述的步驟(3)中選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連香樹紅球菌的篩選方法，其特征在于:所述的亞硝胺類物質(zhì)為亞硝基二甲胺、亞硝基二乙胺、亞硝基二丙胺、亞硝基吡咯烷和亞硝基二丁胺中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1所述的連香樹紅球菌在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要 求6所述的連香樹紅球菌在降解亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于主要通過以下方式實現(xiàn):(1)連香樹紅球菌濕細(xì)胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細(xì)胞；(2)取連香樹紅球菌濕細(xì)胞接種于含有亞硝胺類物質(zhì)的礦物鹽培養(yǎng)基中，在避光條件下于25°C對礦物鹽培養(yǎng)基中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行降解，其中每IOOmL礦物鹽培養(yǎng)基中接種0.6g連香樹紅球菌濕細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的連香樹紅球菌在降解飲用水中亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的連香樹紅球菌在降解飲用水中亞硝胺類物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于主要通過以下方式實現(xiàn):(I)連香樹紅球菌濕細(xì)胞的制備，用接種環(huán)取連香樹紅球菌的新鮮斜面菌種，劃線接種于固體富集培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)3天后即可得到長有明顯菌落的培養(yǎng)基平板，獲得新鮮的連香樹紅球菌濕細(xì)胞；(2)取連香樹紅球菌濕細(xì)胞接種于飲用水中，在避光條件下于25°C對飲用水中的亞硝胺類物質(zhì)進(jìn)行降解，其中每IOOmL飲用水中接種0.6g連香樹紅球菌濕細(xì)胞，并且飲用水在接種連香樹紅球菌濕細(xì)胞之前用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)飲用水的pH =7.3。
【文檔編號】C12N1/20GK103966127SQ201410173419
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】王萬峰, 郭彥玲, 朱春友, 黃耀, 樊靜, 張國慶, 宋琳琳, 潘峰 申請人:河南師范大學(xué)