一種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的表達(dá)載體為同時表達(dá)草甘膦抗性基因1和草甘膦抗性基因2的環(huán)形載體；所述草甘膦抗性基因1編碼的蛋白質(zhì)為序列1所示的蛋白質(zhì)或其氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)；所述草甘膦抗性基因2編碼的蛋白質(zhì)為序列2所示的蛋白質(zhì)或其氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)。實驗證明，轉(zhuǎn)入了所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因棉花具有非常強(qiáng)的草甘膦抗性。本發(fā)明對于進(jìn)一步培育高抗草甘膦植物及其應(yīng)用具有非常重要的意義。
【專利說明】—種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因作物是指通過特定方法將來自于動物、植物、微生物等來源的目的基因轉(zhuǎn)移到天然作物中，從而使作物定向獲得某種特性并使之能穩(wěn)定遺傳，例如抗除草劑、抗蟲、抗逆、抗病等。該技術(shù)能克服物種遺傳壁壘，改變傳統(tǒng)耕作方式，大幅度提升作物產(chǎn)量及品質(zhì)。第一種轉(zhuǎn)基因作物于1983年首次研發(fā)成功，至今已有35科120多種植物成功應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，產(chǎn)生了巨大社會經(jīng)濟(jì)效益并在提高耕地利用效率、減少農(nóng)藥施用及環(huán)境污染、提高人工效率方面產(chǎn)生了巨大推動作用。
[0003]對于轉(zhuǎn)基因作物的研究早在20世紀(jì)80年代初期就已經(jīng)開始，至今已經(jīng)有多種轉(zhuǎn)基因作物的研究報道，涵蓋了大部分糧食作物及經(jīng)濟(jì)作物，如水稻、玉米、棉花、煙草、番茄、辣椒、大豆、楊樹等，目的基因大部分為抗蟲，抗除草劑，抗病，抗逆等抗性基因。
[0004]草甘膦是一種具有廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑。廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理，是全世界除草劑使用量最大的品種之一。草甘膦具有獨特的除草機(jī)理，草甘膦是植物莽草酸合成途徑關(guān)鍵酶EPSPS的抑制劑，從而打斷植物的莽草酸合成途徑，植物中的莽草酸含量增加，植物體所必需的芳香族氨基酸合成減弱或停止，隨之植物失綠而死亡。草甘膦是一種滅生性除草劑，直接在田間噴施，會對作物產(chǎn)生危害。隨著抗草甘膦EPSPS基因的發(fā)現(xiàn)和抗草甘膦作物的培育，使草甘膦在田間大量使用成為可能。
[0005]草甘膦化學(xué)名稱N-磷酸甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)-glyeine),結(jié)構(gòu)式Ho2CCH2NHCH2Po3H2分子量為169.1，常態(tài)為白色固體，熔點200°C，230°C融化分解，密度
0.5g/cm3不可燃，常溫能穩(wěn)定儲藏。草甘膦可與堿(有機(jī)或無機(jī))生成極易溶于水的鹽，而且又不損失其母體化合物的除草活性，草甘膦異丙胺鹽是最常用的易容鹽，溶解度達(dá)500g/L，且不降低草甘膦的毒性。
[0006]目前應(yīng)用最廣泛的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花是美國孟山都公司，抗農(nóng)達(dá)(草甘膦)棉花(Roundup ReadyCotton),于1994年通過環(huán)境釋放許可，1997年開始在主要產(chǎn)棉區(qū)推廣種植。已商業(yè)化的抗農(nóng)達(dá)棉花含有CP4-EPSPS基因。該基因是從Agrobacterium spp中分離出來的對草甘膦 不敏感。草甘膦對CP4-EPSPS作用和結(jié)合位點與草甘膦對大多數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)的敏感型EPSPS的作用和結(jié)合位點是一致的。總體來看，雖然CP4-EPSPS蛋白有50.1%與傳統(tǒng)玉米的EPSPS相似，但只有23.3%是完全一致的。因此，通過在草甘膦與PEP (磷酸稀醇式丙酮酸)結(jié)合區(qū)以外的氨基酸序列變化所引起的構(gòu)象變化，可以有效降低對草甘膦的親和性CP4-EPSPS基因插入后，避開了植物體內(nèi)原有的EPSPS系統(tǒng)，從而使莽草酸代謝得以正常進(jìn)行，產(chǎn)生了對草甘膦的抗性。目前商業(yè)化的抗草甘膦作物大都采用了 CP4-EPSPS基因。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種含有草甘膦抗性基因的表達(dá)載體及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的表達(dá)載體，為同時表達(dá)草甘膦抗性基因I和草甘膦抗性基因2的環(huán)形載體；
[0009]所述草甘膦抗性基因I (GR79基因)編碼的蛋白質(zhì)(GR79蛋白)可為下述al)或a2):
[0010]al)氨基酸序列為序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)；
[0011]a2)將al)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)；
[0012]所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)編碼的蛋白質(zhì)(GAT蛋白)可為下述bl)或b2):
[0013]bl)氨基酸序列為序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0014]b2)將bl)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)。
[0015]為了便于蛋白的純化，可在由序列表中序列I或序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0016]表:標(biāo)簽的序列
[0017]
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)載體為同時表達(dá)草甘膦抗性基因I和草甘膦抗性基因2的環(huán)形載體； 所述草甘膦抗性基因I編碼的蛋白質(zhì)為下述al)或a2): al)氨基酸序列為序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)； a2)將al)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)； 所述草甘膦抗性基因2編碼的蛋白質(zhì)為下述bl)或b2): bl)氨基酸序列為序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)； b2)將bl)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述草甘膦抗性基因I為如下I)至3)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中al)所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1中al)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；和/或 所述草甘膦抗性基因2為如下4)至6)中任一所述的DNA分子: 4)編碼序列為序列表中序列4所示的DNA分子； 5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中bl)所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1中bl)所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)載體中，所述草甘膦抗性基因I存在于表達(dá)盒I中；所述草甘膦抗性基因2存在于表達(dá)盒2中； 所述表達(dá)盒I中啟動所述草甘膦抗性基因I轉(zhuǎn)錄的啟動子，以及所述表達(dá)盒2中啟動所述草甘膦抗性基因2轉(zhuǎn)錄的啟動子均為35S啟動子； 所述35S啟動子的序列具體為序列表中序列5的第1-710位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)盒I中終止所述草甘膦抗性基因I轉(zhuǎn)錄的終止子，以及所述表達(dá)盒2中終止所述草甘膦抗性基因2轉(zhuǎn)錄的終止子均為NosT終止子； 所述NosT終止子的序列具體為序列表中序列5的第2370-2846位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)盒I和所述表達(dá)盒2中，在所述35S啟動子的下游均還包括Ω序列；和/或 所述表達(dá)盒I中，在所述Ω序列和所述草甘膦抗性基因I之間還包括葉綠體前導(dǎo)肽序列； 所述Ω序列具體為序列表中序列5的第717-787位；所述葉綠體前導(dǎo)肽序列具體為序列表中序列5的第792-1018位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)盒I的序列為序列表中序列5的第1-2846位；和/或 所述表達(dá)盒2的序列為序列表中序列5的第2863-4586位。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)載體的序列為序列表中序列5。
8.含有權(quán)利要求1-7中任一所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因微生物。
9.如下(A)中的應(yīng)用或(B)中的方法: (A)權(quán)利要求1-7中任一所述的表達(dá)載體在培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用； (B)培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下BI)和B2)的步驟: BI)向目的植物中導(dǎo)入權(quán)利要求1-7中任一所述表達(dá)載體，得到同時表達(dá)權(quán)利要求1-7任一中所述的草甘膦抗性基因I和所述的草甘膦抗性基因2的轉(zhuǎn)基因植物； B2)從步驟BI)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，草甘膦抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。
10.DNA分子I和/或DNA分子2: 所述DNA分子I為如下I)至3)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中al)所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1中al)所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 所述DNA分子2為如下4)至6)中任一所述的DNA分子: 4)編碼序列為序列表中序列4所示的DNA分子； 5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中bl)所述蛋白質(zhì)的DNA分子; 6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1中bl)所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
【文檔編號】C12N15/84GK103981199SQ201410204703
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】郭三堆, 孫豹, 張銳, 孟志剛, 孫國清, 林敏 , 陸偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 郭三堆